本文在以下内容中提到：

介绍

微RNA（miRNAs/miRs）是一类RNA测量长度<25 bp且无蛋白质编码功能(1). 以前的研究已经证明miRNAs可以调节细胞增殖，入侵、免疫反应和生理代谢3′非翻译结合的病理生理过程靶向mRNA以降低其表达的区域（3′-UTR）(2).

肝细胞癌（HCC）是一种严重的健康问题全世界，特别是亚洲和非洲的负担(三). 尽管有先进的治疗方法临床数据表明，在前几年已经实施转移患者通常预后较差(4). 因此，控制肿瘤转移是改善预后的重要策略HCC。目前，越来越多的证据表明miRNA起作用肝癌转移中的关键作用(5,6).例如，肝癌组织中miR-1271的下调是与静脉浸润和异位表达有关miR-1271可能抑制侵袭和肺转移结节的形成(7).

miR-552是一种新型的癌相关miRNA主要研究结直肠癌(8). 在功能上，miR-552是证明可以增加CRC细胞的迁移和侵袭能力(9). 然而miR-552在HCC转移中的作用及其相关机制上皮-间充质转化（EMT）细胞迁移和侵袭机制(10)，尚不清楚。

本研究确定miR-552是HCC中上调。miR-552高表达预示不良3年随访中的总生存率和无病生存率期间。体外，miR-552被证明增加靶向Wnt抑制因子1的迁移、侵袭和EMT（WIF1）。此外，糖原合成酶激酶3β（GSK3β）/β-连环蛋白信号传导激活被证实是miR-552的致癌功能。

材料和方法

道德审查

临床样本的使用得到了西安交通第一附属医院伦理委员会大学（中国西安）根据1975年宣言赫尔辛基。每个人都获得并签署了书面知情同意书纳入本研究的患者。

临床样本和细胞系

总共76个HCC组织和匹配的癌旁组织收集了53名男性患者和23名女性患者的组织他接受了肝胆外科手术，西安交通大学第一附属医院2010年1月和2014年1月。组织储存在液体中氮气。人永生化正常肝细胞系（LO2）和购买HCC细胞系（Huh-7、MHCC97-L、Hep3B、MHCC97-H）来自中国生物化学与细胞生物学研究所科学院（中国上海）西安市第一附属医院转化医学交通大学。用改良Dulbecco’s培养细胞Eagle's介质（DMEM；Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）补充10%胎牛血清（FBS；吉布科；赛默飞世尔科技公司）和1%V/V青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，德国）在含5%CO的增湿大气中2在37°C。

细胞转染

miR-552模拟物（miR10003215-1-5；miR-553），miR-551抑制剂（miR20003215-1-5；miR-552-inhi），阴性对照模拟物（miR01201-1-5；miR-ctrl），阴性对照抑制剂（miR02201-1-5）；miR-ctrl-inhi），WIF1小干扰（si）RNA（stB0009885；si-WIF1）和阴性对照siRNA（siN05815122147-1-5；si-ctrl）从RiboBio Co.（中国广州）购买。阴性对照载体（Vec-ctrl）和WIF1质粒（SC119176）从OriGene（美国马里兰州罗克维尔）获得。总共10个μ克模拟物、抑制剂、siRNA或质粒被用于转染肝癌使用Lipofectamine 3000（Invitrogen；Thermo Fisher）的细胞Scientific，Inc.）。之后转染48小时后，进一步收集细胞实验。

逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

三唑®试剂（Invitrogen；ThermoFisher Scientific，Inc.）用于从组织中分离总RNA和培养细胞。RT-PCR和qPCR使用Superscript III逆转录酶试剂盒（Invitrogen；ThermoFisher Scientific，Inc.）和iTaq Universal SYBR-Green Supermix套件（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）。这个Bulge-Loop miR-552 RT-qPCR引物组（广州RiboBio，Co。，中国广州）用于测量miR-552表达式。引物序列如下：WIF1正向，5′-GTGTGAAATCAGCAAATGCC-3′和反向，5′-GTCTCCATGCCAACCTCT-3′；和GAPDH正向，5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′和反向，5′-GGACTCCACGACGTACTCA-3′）。热循环条件如下如下：在50°C下初始变性2分钟，酶在95°C下变性10分钟，然后进行40次循环：95°C下变性15秒，60°C下退火30秒，70°C下伸长率为1 min，72°C下最终伸长率10最小值2-ΔΔCq方法(11)用于计算相对GAPDH标准化基因表达。

蛋白质印迹分析

用放射免疫沉淀分析法分析细胞裂解缓冲液（中国西安华特生物科技有限公司）和用BCA蛋白检测试剂盒II（分类号5000002；生物实验室）。蛋白质样品（40μg） 是用10%SDS-PAGE凝胶分离并转移到硝化纤维素上使用Bio-Rad的膜（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）储罐吸液系统（Bio-Read Laboratories，Inc.）。膜是用5%牛血清白蛋白封闭（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）在室温下使用1X TBST（含0.1%吐温-20的TBS）2小时。将膜与适当的初级培养基一起培养抗体在4°C下以1:1000稀释过夜。辣根1:2000的过氧化物酶（HRP）结合二级抗体用稀释液在室温下培养细胞膜1小时用TBST清洗后的温度（TBS为0.1%吐温-20）3次，持续10分钟用增强化学发光（ECL）观察膜试剂（EMD Millipore；美国马萨诸塞州Billerica）。培养的膜用ECL试剂包装在塑料包装盒中，并暴露于x射线胶片。然后将暴露的x射线胶片扫描到扫描仪拍摄的黑白图像（LiDE 220，佳能公司，东京，日本）。每个蛋白质条带的强度使用ImageJ软件[V1.8.0_112；美国国立卫生研究院（NIH），贝塞斯达，医学博士，美国]。相应的GAPDH强度用于计算谱带的相对强度。

用于免疫印迹的主要抗体分析如下：购买了WIF1（目录号ab155101）来自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）；上皮钙粘蛋白（E-cadherin；猫。编号3195）、波形蛋白（目录编号3932）、GSK3β（目录编号12456）并购买磷酸化GSK3β（cat.no.5558）抗体来自Cell Signaling Technology，Inc.（丹弗斯，马萨诸塞州，美国）；和矩阵金属蛋白酶（MMP）-2（分类号sc-13594）和GAPDH（分类号。sc-47724）抗体购自Santa Cruz Biotechnology，公司（美国德克萨斯州达拉斯）。

免疫组织化学染色

含副甲醛的石蜡包埋肝癌组织章节由西安和特生物科技有限公司编制用于免疫组织化学染色。WIF1主要抗体为在PBS中以1:100稀释，在4°C下标记WIF1过夜。生物素化山羊抗兔二级抗体（cat.no。SP-9001；ZSGB-BIO；OriGene Technologies，Inc.，中国北京）用于检测初级抗体。复合物由检测HRP-链霉亲和素结合物（ZSGB-BIO；OriGene Technologies，Inc.）并通过DAB（ZSGB-BIO；OriGene Technologies，Inc.）可视化。这个最后的免疫组织化学染色得分计算如下如前所述(12).

伤口愈合分析

转染后，将细胞培养在6孔板，并生长到80-90%汇合。伤口穿过油井中部由一个200μl无菌吸管提示。随后，用血清减少（2%FBS）培养细胞v/v）在加湿的5%CO中的DMEM237°C培养箱0和48小时后，用相控显微镜在放大倍数为×40，并用Image J软件进行分析（V1.8.0_112；NIH）。

Transwell分析

Transwell嵌件（美国纽约州彭菲尔德Nalge Nunc）涂有Matrigel（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）上层1mg/ml，37°C孵育30分钟。简言之，3×104将细胞接种到上室使用血清减少（2%FBS v/v）DMEM。总计750μl DMEM公司将含有10%FBS的溶液加入下室。细胞是然后在加湿的5%CO中培养237°C培养箱24小时。将腔室固定在4%多聚甲醛中5分钟室温下，然后用0.3%结晶紫染料染色10分钟。用棉签清除非侵入细胞。入侵细胞在光学显微镜下以×200.

双荧光素酶报告分析

目标扫描(http://www.targetscan.org/)和米兰达(网址：http://www.microrna.org)用于预测miR-552的靶点。预测的野生型WIF1 3′-UTR序列与miR-552和突变的3′-UTR序列相对应合成并插入pEZX-MT06质粒载体（GeneCopoeia，Inc.，美国马里兰州罗克维尔）。重组结构，将miR-552模拟物或miR-552抑制剂共转染到使用Lipofectamine 3000的Huh-7和Hep3B细胞（Invitrogen；ThermoFisher Scientific，Inc.）。48小时后，收集细胞，荧光素酶活性为使用Luc-Pair Duo-Luciferase检测试剂盒2.0进行测量（GeneCopoeia公司）。萤火虫萤光素酶活性标准化为雷尼利亚荧光素酶活性。

XAV939细胞治疗

XAV939（产品目录号X3004）购自Sigma-Aldrich；Merck KGaA，溶于二甲基亚砜（DMSO、Sigma-Aldrich、Merck KGaA）。共20×104将细胞接种到6孔板中，并在37°C下培养过夜。XAV939用于处理最终浓度为5μM培养24小时。使用DMSO将细胞作为控件。

统计分析

连续变量表示为平均值±标准偏差。使用SPSS进行统计分析21.0版软件（SPSS Inc.；IBM Corp.，Armonk，NY，USA）或GraphPad PRISM 5软件，美国）。miR-552与临床特征的相关性为皮尔逊χ分析2测试。之间的相关性通过Spearman相关分析miR-552和WIF1的表达分析。使用未配对学生t检验。采用单向方差分析比较多组数据和Bonferroni方法用于事后测试。进行生存分析使用Kaplan-Meier曲线和对数库检验。P<0.05为被认为显示了统计上的显著差异。

结果

miR-552的表达在肝癌组织并预测预后不良

miR-552在人体组织中的表达是RT-qPCR分析。HCC中miR-552的显著增加将组织与相邻的非肿瘤组织进行比较(图1A; P<0.01）。这个miR-552在肝癌患者中的临床意义是调查。共有两个亚组，miR-552高表达组（≥mean，n=50）和miR-552低表达组（<mean，n=26），在队列中根据miR-552。在表I，结果来自皮尔逊χ2测试表明miR-552与静脉侵犯（P=0.035）和晚期肿瘤结节转移(13)阶段（III+IV；P=0.024），表明miR-552高的肿瘤表达水平可能更具攻击性。因此，差异miR-552在侵袭性组织（肿瘤肝内转移、胆管侵犯或静脉浸润）检测非侵袭性HCC组织。根据假设，与非侵袭性HCC组织相比，miR-552表达显著侵袭性HCC组织中上调(图1B; P<0.05）。

图1 miR-552上调预示更糟肝癌患者的预后。（A） miR-552的表达为76例HCC组织中上调。（B） 具有侵袭性的HCC组织临床特征显示miR-552表达水平较高与非侵袭性组织相比。miR-552患者高表达组的总生存率较低和（D）更短的无病生存时间*P<0.05和**P<0.01。miR，microRNA；HCC，肝细胞癌症。

表I miR-552的临床意义肝细胞癌。

表I

miR-552的临床意义肝细胞癌。

临床特征	miR-552表达		χ2	P值
	高 （n=50）	低 （n=26）
性别			1.259	0.262
男性	37	16
女性	13	10
年龄，年			1.284	0.257
<60	22	15
≥60	28	11
乙型肝炎感染			1.404	0.236
缺席者：	11	9
出席	39	17
肿瘤大小，cm			2.606	0.107
<5	27	19
≥5	23	7
肝脏肝硬化			0.866	0.352
缺席者：	14	10
出席	36	16
血清甲胎蛋白水平，ng/ml			2.155	0.142
<400	20	15
≥400	30	11
静脉入侵			4.451	0.035
缺席者：	33	23
出席	17	三
埃德蒙森·斯坦纳分级			1.748	0.186
I+II级	19	14
III+IV级	31	12
肿瘤结节转移期			5.077	0.024
I+II级	21	18
III+IV级	29	8

此外，还使用了Kaplan-Meier生存曲线以描述miR-552在HCC中的预后价值。患有以下疾病的患者miR-552的高表达降低了总生存率[图1C，危险比（HR）=2.541；95%置信区间（CI）1.442-4.478；P=0.001]和无病生存(图1D;HR=2.435，95%置信区间1.390-4.263；P=0.002）。这些数据表明miR-552是一种潜在的生物标志物肝癌患者。

miR-552促进迁移、侵袭HCC细胞的EMT

接下来，使用qPCR证明miR-552是除Hep3B外，所有肝癌细胞株中均上调(图2A; P<0.05）。miR-552型然后在Huh-7细胞中沉默表达(图2B; P<0.01），并且在Hep3B细胞(图2C;P<0.001）。

图2 miR-552抑制剂的转染和HCC细胞中的模拟物。（A） miR-552的表达在人永生化正常肝细胞LO2细胞系和4肝细胞癌Huh-7、MHCC97-L、Hep3B、MHCC97-H细胞逆转录定量聚合酶链标记的品系反应。（B） miR-552的表达被将其抑制剂转染Huh-7细胞。（C） 转基因miR-552模拟增加了Hep3B细胞中miR-551的表达。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。miR，microRNA；ctrl，控制；因希，抑制剂。

伤口愈合和Transwell分析用于分别确定迁移和入侵，在里面体外观察到miR-552的下调减少细胞迁移(图3A;P<0.05）和侵袭(图3B;Huh-7细胞中P<0.05）。相反miR-552显著促进细胞迁移(图3C; P<0.05）和侵袭(图3D，P<0.05）在Hep3B中细胞。这一结果表明，miR-552可能与肝癌的肿瘤转移。

图3 miR-552促进细胞迁移，体外侵袭和上皮-间充质转化。（A）残留面积百分比和（B）侵入细胞数量转染miR-552抑制剂的Huh7细胞中表达量减少。miR-552的上调增加了细胞（C）迁移和（D）Hep3B细胞的侵袭。（E） miR-552抑制增加Huh-7中E-cadherin表达但波形蛋白表达降低细胞。（F） E-cadherin表达减少，增加波形蛋白在转染Hep3B细胞中的表达miR-552模拟*P<0.05。miR，microRNA；E-钙粘蛋白，上皮钙粘蛋白；ctrl，控制；抑制物inhi。

肿瘤的迁移和侵袭是一个复杂的过程并受几个细胞过程调节，包括损失细胞间粘附，经常伴随E-cadherin下调，vimentin上调。这个本研究的western blot分析结果表明miR-552的敲除增加了E-cadherin的表达并降低了波形蛋白在Huh-7细胞中的表达(图3E; P＜0.05），而上调miR-552抑制E-cadherin，但诱导波形蛋白表达Hep3B细胞(图3F; P<0.05）。这些结果表明miR-552具有显著的致癌性肝癌细胞的功能。

WIF1是miR-552的下游靶点肝癌

miRNAs可能与3′-UTR结合并作为抑制剂减少某些mRNA的表达。共有2个在线MicroRNA目标预测工具，TargetScan(http://www.targetscan.org/)和米兰达(网址：http://www.microrna.org)，用于预测WIF1miR-552下游靶点。如所示图4A，miR-552的击倒率增加Huh-7细胞中WIF1 mRNA和蛋白的表达（P<0.05）；相反，miR-552过表达降低了WIF1在Hep3B细胞（P<0.05）。此外，野生型和根据miR-552与WIF1 3′-UTR的结合序列(图4B). 如所示图4C，双重核糖核酸酶报告员实验证明miR-552的下调增加了野生型WIF1 3′-UTR的荧光素酶活性（P<0.05），而miR-552的上调降低了野生型WIF1 3′-UTR（P<0.05）。在miR-552击倒中或诱导后，荧光素酶无明显变化突变型WIF1 3′-UTR的活性。此外，负相关Spearman证实miR-552和WIF1之间的表达相关分析(图4D;r=-0.703；P<0.001）。这些数据为提示WIF1是miR-552在HCC中的直接靶点。

图4 WIF1是的下游目标miR-552。（A） WIF1的mRNA和蛋白表达水平为转染miR-552抑制剂的Huh-7细胞上调表达在转染miR-552模拟物的Hep3B细胞中下调。（B）miR-552和WIF1 mRNA 3′-UTR之间的推测结合位点为在线数据库预测。（C） miR-552的上调抑制含有野生型但不含野生型的荧光素酶活性Huh-7细胞中WIF1的突变型3′-UTR载体。的击倒miR-552增加Hep3B细胞的荧光素酶活性包含野生型但不包含WIF1的突变型3′-UTR载体。（D）miR-552与WIF1蛋白表达的负相关Spearman相关分析证实肝癌组织中存在。*P<0.05。WIF1、Wnt抑制因子1；miR、，微RNA；UTR，非翻译区；Wt，野生型；Mt，突变体；ctrl，控制；抑制物inhi。

miR-552在肝癌中的致癌作用细胞由WIF1介导

为了进一步调查潜在的miR-552/WIF1轴在肿瘤进展中的作用机制miR-552下调的Huh-7细胞的表达首先受到抑制(图5A; P<0.05）。这个然后重复伤口愈合和Transwell分析，以表明WIF1基因敲除消除了迁移的抑制作用，miR-552下调诱导的侵袭和EMT(图5B和C; P<0.05）。随后，同样的实验也被用来证明WIF1过度表达降低了细胞的迁移、侵袭和EMTmiR-552上调Hep3B细胞(图。5D-F型; P<0.05）。

图5 WIF1的改变表达废除miR-552对肝癌细胞的作用。（A）WIF1特异性siRNA转染降低了WIF1的表达表达miR-552抑制剂的Huh-7细胞。（B） WIF1击倒促进Huh-7细胞迁移和侵袭miR-552抑制剂。（C） 抑制WIF1降低E-钙粘蛋白在Huh-7细胞中表达但波形蛋白表达增加表达miR-552抑制剂。（D） WIF1在Hep3B中过度表达细胞过度表达miR-552。（E） 抑制WIF1的上调过度表达miR-552的Hep3B细胞的迁移和侵袭。（F） WIF1的上调增加了E-cadherin的表达，但波形蛋白在Hep3B细胞中的表达降低miR-552*P<0.05。WIF1，Wnt抑制因子1；miR、，微RNA；ctrl，控制；抑制素，抑制剂；E-钙粘蛋白，上皮钙粘蛋白；小干扰RNA；Vec，矢量。

GSK3β/β-catenin信号传导对miR-552在肝癌中的作用

Western blot分析证明miR-552敲除降低Huh-7中Ser9处GSK3β磷酸化单元格(图6A; P<0.05）。这个GSK3β去磷酸化抑制β-catenin表达(图6A; P<0.05）。相反，miR-552过度表达增加了GSK3β磷酸化和β-连环蛋白Hep3B细胞中的表达(图。6亿; P＜0.05）。此外XAV939介导的GSK3β/β-catenin信号通路(图6C; P<0.05）废除miR-552在Hep3B细胞上过度表达的致癌功能迁移和入侵(图6D和E类; P<0.05）。XAV939治疗也抑制miR-552诱导的Hep3B细胞中的EMT(图6F;P<0.05）。综上所述，这些数据表明miR-552在肝癌细胞中的致癌功能归因于GSK3β/β-catenin信号通路激活减少，由WIF1介导。

图6 miR-552的促侵袭功能是通过调节GSK3β/β-catenin信号通路实现。GSK3β在Ser9的磷酸化作用和总表达水平转染miR-552的（A）Huh7细胞中β-catenin减少抑制剂，但转染（B）Hep3B细胞的miR-552模拟。（C） XAV939治疗降低GSK3βHep3B细胞的磷酸化和β-连环蛋白表达miR-552过度表达。XAV939处理抑制细胞（D）过度表达miR-552的Hep3B细胞的迁移和（E）侵袭。（F） XAV939治疗增加了E-cadherin的表达，但降低了波形蛋白在过度表达miR-552的Hep3B细胞中的表达。*P<0.05。miR，microRNA；糖原合成酶激酶3β；p、 磷酸化；ctrl，控制；抑制物inhi；二甲基亚砜亚砜；E-钙粘蛋白，上皮钙粘蛋白。

讨论

miRNAs在良性和恶性肿瘤中的异位表达恶性疾病可能会使细胞粘附和运动失调功能。安东等(14)表明2个粘附相关基因、连接黏附分子1和筋膜肌动蛋白结合miR-143过度表达后，蛋白1被抑制宫颈细胞中的miR-145。这种不正常的规定可能会破坏宫颈上皮屏障，是早产(15). 许多癌症的类型(16)，包括肝癌(17)，也展出了异常miRNA引起的迁移和入侵能力增强与癌症转移相关的表达谱预后不良。

在这些miRNA中，miR-552被鉴定为主成分分析法检测结肠癌中miRNA的上调(18). 值得注意的是，与缺陷DNA错配修复（MMR）肿瘤中miR-552的水平，miR-552在DNA MMR肿瘤中的表达上调(19). 这表明miR-552具有调节结肠癌细胞增殖的潜力和入侵。在本研究中，发现miR-552HCC组织中增加，尤其是门脉癌静脉浸润、淋巴结转移等特征攻击性行为。这个体外当前的结果研究还表明，miR-552可能在HCC细胞：抑制miR-552不仅减少迁移以及Huh-7细胞的侵袭，但也损害了EMT标记物miR-552的过度表达增加了Hep3B细胞的迁移、侵袭和EMT。

Wnt/β-catenin途径涉及一个家族对许多生物功能至关重要的蛋白质包括细胞分化(20)和器官发生(21). 在肝癌中，Wnt/β-catenin途径已经证明可以促进细胞增殖、侵袭和血管生成(22). WIF1该基因位于人类染色体12q14上，编码一种分泌蛋白通过结合Wnt蛋白(23). 在本研究、qPCR、western blot分析和双核糖核酸酶采用报告分析方法确认WIF1是一种miR-552的下游靶点。临床分析还显示miR-552与WIF1蛋白表达的负相关肝癌组织中。由于miR-552与WIF1 mRNA的3′-UTR结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），miR-552/WIF1 RISC可能导致WIF1 mRNA降解并阻止随后的翻译过程。因此，miR-552可能下调WIF1 mRNA以及蛋白质表达。作为一种重要的Wnt拮抗剂，WIF1是参与抑制各种癌细胞的侵袭行(24). 类似地目前的研究发现WIF1的表达改变废除miR-552对HCC细胞的前侵袭功能。作为WIF1可能会取消Wnt配体与LRP-5/6的结合受体(25)，我们假设miR-552敲除是否会导致GSK3β去磷酸化在Ser9。正如预期的那样，miR-552敲除降低了GSK3β磷酸化和β-catenin表达。XAV939已经以前被证实为β-catenin抑制剂(26). 在本研究中，XAV939是用于治疗miR-552过度表达的Hep3B细胞。现在研究表明XAV939也抑制细胞迁移，miR-552诱导的侵袭和EMT过程。作为转录本β-catenin可能增加一些EMT-相关转录因子(27)，包括锌指蛋白SNAI1、锌指蛋白SNAI2和扭体相关蛋白1。这个可以解释为什么miR-552在HCC中表现出促侵袭功能。

总之，miR-552与HCC高度相关恶性肿瘤，并具有作为预后生物标志物的潜在价值肝癌患者。

基金

本研究得到了来自国家自然科学基金（批准号：。81472247）。

数据和材料的可用性

研究期间生成的分析数据集包括可根据合理要求从相应作者处获得。

作者的贡献

CLi为研究的设计做出了贡献，并写道手稿。ZW、SC、JZ和KQ进行了研究；和CLiu有助于研究的设计。所有作者阅读和批准了最终的手稿。

道德批准和同意参与

临床样本的使用得到了西安交通第一附属医院伦理委员会大学。所有患者均获得书面知情同意书参加本研究。

患者同意发布

书面知情同意书由获得并签字参与本研究的每位患者。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

致谢

不适用。

工具书类