本文在以下内容中提到：

介绍

支气管哮喘是一种慢性气道炎症以气道高反应性和可逆流动为特征的疾病限制(1). 流行病学调查表明，目前约有3亿患者遭受每年有25000人死于哮喘每年全球范围内。此外，哮喘的发病率和死亡率呈现增长趋势，哮喘成为全球主要公众健康问题(2). 慢性气道炎症诱导的气道重塑是哮喘的发病机制(三). 气道重塑主要涉及慢性炎症引起的大面积炎症气道平滑肌细胞（ASMC）增殖和细胞外基质（ECM）沉积。扩散和ASMC肥大在气道中起着特别重要的作用重塑，并被视为其重要特征(4). 此外，ASMC的范围增殖与哮喘的严重程度呈正相关(5).

各种因素，包括1/2型辅助T细胞细胞因子失衡、细胞因子、基质金属肽酶和组织金属肽酶抑制剂、遗传因素、神经调节和基因突变，在发生和哮喘的发展(6，7). 微RNA（miRNAs/miRs）是一类高度进化保守的小分子非编码RNA长度为21–23 nt。它们与它们的mRNA相互作用靶向基因以降低其稳定性和/或抑制翻译，从而负调控靶基因的表达。miRNAs是参与了一系列重要的病理生理过程，包括细胞增殖、分化和凋亡以及免疫反应和肿瘤形成(8，9). 它是估计miRNAs占人类基因的1-3%，调节30%以上人类基因的表达(10). 最近，miRNAs在哮喘的发生和发展已引起越来越多的关注注意(11，12). 此外，miRNA表达异常可能通过调节哮喘气道重塑ASMC的增殖和凋亡(13——15).Let-7a是Let-7家族的成员，是第一批已鉴定的miRNAs和肺中最丰富的miRNA之一组织(16). Let-7a调节白细胞介素（IL）-13分泌，而后者在哮喘炎症反应与气道重塑(17). 以前的研究表明支气管上皮细胞let-7a表达下调以及支气管镜检查中获得的经支气管肺活检组织来自哮喘患者(18，19).此外，let-7a的沉默被证明显著减轻呼吸道炎症和气道高反应性哮喘小鼠(20，21)表明let-7a与患有哮喘。然而，let-7a在支气管平滑肌细胞中的表达哮喘患者及其调节作用仍然存在有待充分阐明。在本研究中，let-7a的变化哮喘患者与健康患者ASMC的表达水平分别为逆转录定量聚合酶链检测反应（RT-qPCR）和let-7a对增殖的影响检测ASMCs凋亡情况；此外，潜在目标对let-7a基因进行了鉴定。

材料和方法

收集患者样本和人类ASMC的原代培养

哮喘和非哮喘受试者的ASMC为来源于通过以下方法获得的节段性支气管活检标本胜利油田中心医院纤维支气管镜检查（中国东营），包括15名哮喘患者和10名非哮喘患者学科。受试者均无吸烟史或最近3个月内呼吸道感染。哮喘受试者符合指南中的诊断标准中国支气管哮喘的防治(22). 所有受试者都提供了书面材料知情同意参与本研究和本研究经胜利油田中心伦理委员会批准医院（中国东营）。上皮、结缔组织、血液从获得的支气管中取出血管和软骨活检标本（5×5mm），然后用冰柜清洗PBS含有青霉素-链霉素3倍。这些标本是然后放入5毫升组织培养瓶中。胎牛血清；1毫升；10%; 吉布科；赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）然后将平滑肌组织块切成小块然后用虹膜剪刀反复切碎。混合物是用一个无菌吸管。然后将培养瓶倒置在5%CO中237°C培养箱。2小时后，当坚持细胞的数量，烧瓶被翻转，杜尔贝科的改良Eagle's培养基（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）从一侧加入含10%FBS的溶液。更换了介质每3-4天一次，经过14天的培养，山丘和山谷观察细胞融合情况。用0.125%胰蛋白酶分离后，细胞以1:2的比例传代。通道4-8处的细胞用于实验。ASMC由典型的丘陵山谷生长模式与免疫细胞化学α-平滑肌肌动蛋白染色(23).

RT-qPCR

从细胞中提取的总RNA使用TRIzol（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）和纯度用NanoDrop测定提取RNA的含量2000分光光度计（赛默飞世尔科学公司）和RNAA260/A280比值在1.8和2.0之间的样品用于合成cDNA。总RNA使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo FisherScientific，Inc.），根据制造商的协议。这个反应在25℃下进行5分钟，50℃下进行20分钟，然后在75℃下进行用SYBR进行5分钟的qPCR®预混料Ex Taq™（Takara Bio Inc.，Otsu，Japan；目录号DRR041A）根据制造商的说明，使用ABI 7500实时荧光qPCR机器（应用生物系统；Thermo Fisher科学公司）。U6和β-肌动蛋白被用作let-7a、信号转导子和激活子的参考基因转录（STAT3）检测。反应PCR条件如下：95°C初始变性持续3分钟和40次循环，95°C持续15秒，60°C持续30秒用于检测let-7a和STAT3的引物如下：Let-7a正向，5′-GCGCCTGGAGGTAGGTTG-3′反向，5′-CAGTGCAGGGTCGAGGT-3′；STAT3正向，5′-TGCTGAGGAGAGAATCGT-3′背面为5′-TAGTAGTAACTGGACGCG-3′；U6前进，5′-CTCCGCTTCGGCAGCACA-3′和背面，5′-AACGCTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin正向，5′-GGTCATCACCATTGGCAA-3′反向，5′-GAGTTGAAGGTTTCGTGGA-3′。设计引物并由上海三光生物工程有限公司（上海，中国）。let-7a和STAT3的相对mRNA表达水平使用2-∆∆Cq方法(24).

细胞转染

哮喘受试者的ASMC对数生长阶段接种到6孔板中，并分为let-7a模拟组和阴性对照（NC）模拟组。Let-7a模拟物（5′-UGAGUAGUAGUGUAGU；基因制药，上海，中国）和NC-mics（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；基因制药）转染到相应组的ASMC中Lipofectamine™2000（Invitrogen；赛默飞世尔科技公司）严格遵守制造商的协议。这个6小时后用正常培养基替换转染培养基转染。转染效率用RT-qPCR。

细胞计数试剂盒（CCK）-8分析

转染24小时后，收集细胞然后以3000的密度播种到96米的板块中细胞/孔。CCK-8染色剂（10µl；Dojindo Molecular Technologies，日本熊本株式会社）反应液添加到指定在37°C下每24小时孵育2小时在波长为ELX800通用微孔板阅读器（BioTek Instruments，美国弗吉尼亚州Winooski公司）。

流式细胞术

转染48小时后，收集细胞用PBS洗涤两次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化离心（111.8×g，5 min，4°C）后收集，以制备单细胞悬液（1×106细胞/ml）个别地。将此细胞悬液中的5 ml注入流中试管，然后添加5µl Annexin V荧光素异硫氰酸盐（BD Biosciences）和10µl碘化丙啶（BD生物科学）。将混合物孵育15分钟在黑暗中，然后添加300µl绑定缓冲液。这个然后立即对混合物进行流式细胞术评估（BD FACSCanto II；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，美国）确定凋亡率。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性测定

转染48小时后，收集细胞然后播种到96米板上。基质和缓冲溶液在室温下严格按照制造商关于Apo-ONE同质半胱氨酸蛋白酶-3/7的协议Assay（美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司；产品目录号G7790）。A类将总共100µl基底与9900µl缓冲溶液混合制备Apo-ONE Caspase-3/7试剂。随后，100µl将此反应试剂添加到每个孔中，然后搅拌使用摇床30秒，在室内孵育2小时黑暗中的温度。每个井的荧光强度然后使用帝肯Infinite M200专业版读板器进行检测（Tecan Trading AG，Maennedorf，Switzerland），其中测定caspase-3/7活性。

双荧光素酶报告基因化验

let-7a的靶基因使用TargetScan miRNA靶基因预测生物信息学网站(网址：http://www.targetscan.org). 这个生物信息学预测表明STAT3可能是一种潜在的let-7a的靶基因。野生型（WT）和突变型（MUT）报告基因质粒由GeneCopoeia有限公司合成。（中国广州）。PCR扩增产物STAT3的3′-非翻译区（3′-UTR）连接到Xbal公司I pGL3质粒的酶消化位点，以便构建野生型pGL3-WT-STAT3报告基因质粒（5′-UGACCUCGGAGUGCUCC-3′）。定点突变是在STAT3的3′UTR的结合位点上进行，即与let-7a序列互补，获得新质粒突变后为pGL3-MUT-STAT3报告基因质粒（5′-ugaccucgaugcgcaagcacc-3′）。293个细胞（ScienceCell ResearchLaboratories，Inc.，San Diego，CA，USA）分为4组，即STAT3 WT质粒对照组（用pGL3-WT-STAT3报告基因质粒和NC-mics），STAT3 WT质粒实验组（pGL3-WT-STAT3转染报告基因质粒和let-7a模拟物），STAT3 MUT质粒控制组（转染pGL3-MUT-STAT3报告基因质粒和NC-mimics）和STAT3 MUT质粒实验组（转染pGL3-MUT-STAT3报告基因质粒和let-7a模拟物）。细胞各组在转染24小时后按照制造商的双核糖体报告程序基因系统试剂盒（Promega公司）和萤火虫的活动使用Globax 20/20光度计（Promega公司）。Renilla荧光素酶基因用作内部参考以验证转染效率和计算相对荧光素酶活性as下式：相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/肾素荧光素酶活性。

蛋白质印迹分析

收集各组细胞并用PBS 3次，然后添加放射免疫沉淀分析分析缓冲液（发酵剂；赛默飞世尔科技公司）和1%蛋白酶抑制剂（目录号78439；Pierce；Thermo Fisher科学公司），并在冰上孵育20分钟。混合物在4°C下离心（111.8×g）15分钟，然后将上清液收集以使用双茚四酮酸法。每条车道共有20µg蛋白质用10%SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜（EMD Millipore，Billerica，MA，美国）。在房间里用5%脱脂牛奶封口后温度保持6h，将膜与初级培养基孵育抗STAT3抗体（分类号sc-293151；1:1000稀释）和GAPDH（分类号sc-32233；1:1000稀释；圣克鲁斯Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA）在4°C下过夜。这个在添加辣根之前清洗膜过氧化物酶结合二级抗体（cat.no.sc-2354；1:2000稀释；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和37°C培养清洗膜1小时，观察蛋白质带使用增强化学发光试剂（Western Blotting检测试剂盒；Applygen Technologies，Inc.，中国北京）根据制造商的协议。随后，QuantityOne软件（版本4.6；Bio-Read Laboratories，Inc.，Hercules，CA，美国）用于密度分析，GAPDH用作确定相对表达式的内部引用统计3。

统计分析

数据通过SPSS 19.0软件（IBM Corp。，美国纽约州阿蒙克）。数值表示为平均值±标准值使用学生的t检验。所有实验重复至少3次。P<0.05表示具有统计学意义差异。

结果

Let-7a在哮喘患者中下调ASMC公司

let-7a在ASMC中的相对表达水平哮喘和非哮喘受试者使用RT-qPCR。如所示图1，的let-7a在哮喘患者ASMC中的相对表达水平与非哮喘患者的ASMC（P<0.01）。

图1。 Let-7a在气道中的表达水平哮喘患者的平滑肌细胞明显与非哮喘受试者相比，调节下调。**与非哮喘组相比，P<0.01。

Let-7a模拟抑制哮喘ASMCs的增殖和促进细胞凋亡

ASMC增殖在气道中起着至关重要的作用重塑(4). 为了测定let-7a对细胞增殖的潜在影响let-7a转染哮喘ASMC和哮喘ASMCmimics和let-7a的成功上调被证实RT-qPCR（P<0.01）；图2A). 这个CCK-8分析结果表明let-7a模拟显著抑制哮喘ASMC的增殖（P<0.01）；图2B). 流量细胞分析表明let-7a显著模拟增强哮喘ASMCs的凋亡（P<0.01）；图2C). 此外，let-7a模拟哮喘患者caspase-3/7活性显著升高ASMC（P<0.01）；图2D).

图2。 let-7a的上调抑制哮喘ASMC的增殖和促进凋亡。（A）与NC-mics组相比，let-7a在let-7a模拟物组显著上调。（B） 细胞计数Kit-8分析表明let-7a模拟物显著抑制哮喘ASMC的增殖。（C） 流式细胞术分析表明let-7a模拟物显著促进哮喘ASMC。（D） Caspase-3/7活性分析表明let-7a模拟显著促进哮喘患者caspase-3/7活性ASMC**与NC模拟相比P<0.01。OD，光密度；ASMC，气道平滑肌细胞；NC，阴性对照。

STAT3是直接的监管目标let-7a基因

确定精确的分子生物学let-7a调节增殖和哮喘ASMCs的凋亡，let-7a的潜在靶基因为使用TargetScan进行分析和预测。分析表明STAT3是let-7a的潜在靶基因，因为它的存在STAT3的3′-UTR中的理论互补结合位点let-7a种子序列的mRNA(图3A). 进一步验证STAT3是否双核糖核酸酶报告基因let-7a的直接靶基因进行试验以确认let-7a对STAT3 mRNA的3′-UTR的荧光素酶活性。如图3B，让-7a明显模仿抑制pGL3-WT-STAT3报告子的荧光素酶活性基因载体，而它们对pGL3-MUT-STAT3报告基因载体的荧光素酶活性（P<0.01）。这表明let-7a与STAT3 mRNA的3′-UTR，并且STAT3是let-7a。

图3。 STAT3被验证为直接let-7a的靶基因。（A） let-7a和STAT3互补结合序列。（B） Let-7a mimics明显抑制荧光素酶野生型pGL3-WT-STAT3的活性，而NC模拟物没有这种活性效果**与NC模拟相比P<0.01。STAT3、信号传感器和转录激活物；WT，野生型；MUT，突变；UTR、，非翻译区域。

Let-7a模拟物抑制mRNA和哮喘ASMC中STAT3的蛋白表达

最后，STAT3的mRNA和蛋白表达转染let-7a模拟物或NC-mimics的哮喘ASMC分别用RT-qPCR和western blot检测。这个let-7a模拟物中STAT3 mRNA和蛋白的表达水平该组显著低于NC-mics组（P<0.01）；图4A和B),提示let-7a的上调显著抑制哮喘ASMC中STAT3 mRNA和蛋白的表达确认STAT3是let-7a规定的目标。

图4。 Let-7a模拟物抑制了哮喘ASMC中STAT3 mRNA和蛋白的表达。（A）逆转录定量聚合酶链反应分析表明，let-7a模拟物显著降低了哮喘ASMC中STAT3 mRNA的表达水平。（B） 西部印迹分析表明let-7a明显上调降低哮喘ASMC中STAT3蛋白的表达水平。**与NC模拟相比P<0.01。STAT3、信号传感器和激活器转录；ASMC，气道平滑肌细胞。

讨论

哮喘是一种常见的呼吸道疾病以气道重塑和气道高反应性为特征。气道重塑是指气道内的一系列结构变化有丝分裂原持续刺激下的气道壁以上皮损伤、腺体增生、肥大为特征，ASMC增殖、ECM沉积和基底膜增厚。其中，ASMC增殖是导致气道组织的结构变化(25)不仅加重了呼吸道但也会增加气道高反应性，因此在气道重塑发生发展中的关键作用(26). 因此，预防ASMC增殖控制哮喘气道的发生重塑已成为当前哮喘研究的热点。在过去十年，越来越多的研究关注ASMC在哮喘中，并建议将其作为治疗药物战略(27，28).

某些miRNAs已被证实参与对包括细胞在内的各种生物过程的调节增殖、分化、凋亡与组织发育通过调节靶基因表达，发挥关键作用在多种疾病的发生和发展中(29，30).关于miRNAs和支气管哮喘的现有数据表明miRNAs参与了支气管哮喘，包括呼吸道过敏性炎症以嗜酸性粒细胞浸润、ASMC高反应性和气道重塑(11). 在此外，不同程度哮喘患者可能会出现miRNA表达谱的差异(31). 此外，多种生理学ASMC的功能，包括收缩、增殖和凋亡也受miRNAs调控。胡等(32)据报道，miR-10a的过度表达显著降低人ASMC的增殖，同时抑制miR-10a促进其增殖。潜在机制包括磷脂酰肌醇-3的特异性抑制miR-10a阻断AKT的激酶催化亚单位α信号通路，以及细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶。此外，另一项研究确定ras同源家族ASMC中成员A（RhoA）的表达受miR-133a，而IL-13通过减少ASMC中miR-133a的含量。RhoA被确定为诱导ASMC功能障碍的关键分子，可能导致过度收缩、异常增殖和凋亡ASMC疾病(33). 因此，纠正ASMC中关键miRNA的异常表达可能潜在延迟气道重塑及相关的肺功能，这可能是一种有前途的治疗方法哮喘。

Let-7a是Let-7a家族的成员其异常表达已在多个疾病，包括恶性肿瘤、阿尔茨海默病、哮喘、，过敏性鼻炎和过敏性皮炎(34). 索尔伯格等(18)通过miRNA微阵列验证结合RT-qPCR，let-7a在哮喘患者的支气管上皮细胞。里亚韦茨et（等）铝(19)报道let-7a在经支气管肺活检组织中明显下调重症哮喘患者的支气管镜检查与轻度哮喘患者和非哮喘对照组相比。列瓦宁等(35)发现let-7a水平在哮喘患者的支气管肺泡灌洗液。然而，据我们所知，let-7a在哮喘中的表达此前尚未报告ASMC。本研究表明let-7a在哮喘ASMCs中显著下调学科。因此，可以推测异常let-7a哮喘患者ASMC表达与ASMC功能障碍相关患者。约翰逊等(36)表明Let-7a抑制了控制细胞的途径增殖，也可能是细胞的主要调节器增殖。此外，Cheng等(37)发现let-7a的上调骨髓间充质干细胞表达抑制肺动脉平滑肌细胞通过STAT3/骨的增殖形态发生蛋白受体2型信号通路，因此延缓肺动脉高压的进展。此外，它已证实let-7a表达显著上调抑制血管平滑肌细胞的增殖(38); 此外，let-7a抑制多种肿瘤细胞的增殖与促肿瘤细胞凋亡(39). 目前研究，以确定let-7a在哮喘患者中的异常表达ASMC影响其增殖和凋亡用let-7a模拟物转染哮喘患者成功上调let-7a表达。CCK-8分析表明let-7a模拟物显著抑制了哮喘ASMC。此外，流式细胞术分析和caspase-3/7活性测定表明let-7a明显模拟增强哮喘ASMC的凋亡和caspase-3/7活性，从而验证let-7a影响哮喘气道组织通过抑制增殖和促进哮喘ASMC的凋亡。

miRNA靶点预测数据库TargetScan是然后用于进一步探索下游有针对性的监管let-7a调节哮喘功能的机制ASMC。生物信息学预测表明let-7a直接并专门调节STAT3，作为理论补充STAT3mRNA的3′-UTR与let-7a被鉴定。此外，let-7a在以往通过以下途径抑制肝癌细胞增殖的研究特异性调节STAT3基因表达(40)，这也提高了肝癌细胞对西妥昔单抗的特异性调节STAT3基因的表达(41).在本研究中，双核糖核酸酶分析表明let-7a与STAT3的3′-UTR特异性结合。此外，RT-qPCR和western blot分析表明let-7a显著降低了小鼠骨髓基质细胞的mRNA和蛋白表达水平哮喘ASMC中的STAT3，进一步表明STAT3是一个靶点let-7a调控的基因。STAT3是STAT家族的成员，并且是Janus中一个重要的信号转录因子激酶/STAT信号转导途径。它拥有多个重要的生物活性，并参与过程包括细胞增殖、分化、存活，血管生成和癌症转移，通过调节各种基因和细胞因子的表达(42). STAT3已被验证为密钥气道重塑中的调节因子。过敏性哮喘和气道哮喘小鼠的高反应性明显减轻带STAT3淘汰赛(43).此外，据报道，STAT3抑制剂可显著抑制哮喘小鼠气道重塑与肺部炎症(44). STAT3被证明可以促进ASMC通过诱导趋化因子和生长因子(45). 淘汰STAT3显著抑制人SMC的增殖气道组织(46).据报道，血小板衍生生长因子可诱导通过激活STAT3增殖人ASMC(47). 施等(48)也证实了上调STAT3的表达显著促进人的增殖ASMC。

总之，本研究表明let-7a在哮喘患者的ASMC中下调。在此外，let-7a被指示抑制增殖和促进人ASMC的凋亡，这可能与STAT3表达下调。Let-7a起着至关重要的作用在哮喘气道重塑期间。

致谢

不适用。

基金

本研究得到了山东省自然科学基金（批准号：。ZR2014HL003）。资助者在研究设计中没有角色，数据收集和分析、决定发布或准备手稿。

数据和材料的可用性

研究期间生成和分析的数据集可从相应作者处获得请求。

作者的贡献

HL设计了实验。YC、LQ、ZZ、GH和JZ进行了实验。YC和HL对数据进行了分析。HL写道手稿。

道德批准和同意参与

所有受试者都提供了书面知情同意书参与本研究，本研究由胜利油田中心医院伦理委员会（中国东营）。

患者同意发布

获得了所有人的书面知情同意患者。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益

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