Abcam科学家Kwon Yongwon博士作为一个令人兴奋的生命科学研究领域，CRISPR-Cas9基因编辑具有巨大且快速发展的潜力，它仍然是一项相对较新的技术，仍然面临着许多重大障碍，包括高度可变的敲除效率、脱靶和安全问题。阿布卡姆科学家Yongwon Kwon博士和他的专家基因编辑团队正致力于克服这些挑战，以生产高质量的研究工具，个人专注于设计更好的导向RNA（gRNAs），以提高基因编辑的成功率。
在这次独家SelectScience访谈中，Kwon分享了对Abcam先进的CRISPR-Cas9技术的见解，并展望了未来，提出了一种新的高效的原发癌细胞基因敲除（KO）方案。这种新颖、优化的方法使同时编辑多个基因成为可能，既节省了时间和资源，又简化了下一代免疫疗法的基因编辑过程。
告诉我们你在Abcam的角色
YK公司：我是Abcam细胞工程团队中分子小组的负责人。目前，我的任务是为CRISPR-Cas9基因组编辑设计gRNA和供体DNA，包括敲除、条件敲除、碱基编辑、条件表达、点突变和敲入（KI）技术。
是什么激励你进入科学世界的？
YK公司：当我11岁的时候，我的祖母死于癌症。这激励我成为一名科学家，这样我就可以帮助推进癌症治疗。在过去的10年里，我一直致力于识别肺癌和乳腺癌的生物标记物。未来，我希望我们在这里的工作能够帮助研究人员为癌症治疗的基因疗法的发展做出贡献。
优化Cas9 RNP转染的好处是什么？
YK公司：CRISPR-Cas9技术为基因组编辑提供了相对简单的分子工具。CRISPR-Cas9复合物由gRNA和Cas9 CRISPR相关蛋白9核酸酶组成，它们共同形成核糖核蛋白，称为RNP复合物。基于这种复合物的生化能力，它可以结合和切割靶点。
过去，许多研究人员选择一种质粒将gRNA和Cas9传递到细胞进行编辑，因为质粒价格低廉，易于使用，并且可以包含可选标记。然而，将gRNA和Cas9表达为质粒存在一些问题。首先，CRISPR成分作为质粒的引入通常与高水平的“非靶向效应”或意外编辑有关。由于质粒可以在细胞内持续数周，gRNA和Cas9持续表达，这增加了gRNA-Cas9在错误位置切割细胞基因组的可能性。
当CRISPR-Cas9以预先复杂的RNP格式交付时，由于RNP仅在细胞内有限的时间内活动，因此非靶向突变的可能性较低。活性RNP复合体将在靶点重复裂解DNA链，并且在被降解之前，只会在转染细胞中停留大约一天。因此，减少了偏离目标的切割。
其次，质粒DNA可以随机整合到靶细胞的宿主基因组中。通过使用RNP格式，它避免了DNA整合的风险。使用RNP的另一个好处是，在这种形式下，gRNA受到Cas9的保护，因此不太容易降解。我使用人工合成的gRNA，因为它们可以进行化学修饰，以保护它们免受核酸内切酶降解和免疫攻击。这两种因子都能使gRNA在细胞内的短时间内更有效地靶向基因组DNA。
科学家目前在这项技术上面临哪些挑战？
YK公司：这项技术的安全性和效率是需要全面研究的重要问题。CRISPR-Cas9系统的效率可能会因非目标更改而降低。具体地说，gRNA往往具有相对较高的错配耐受性，Cas9常常会切割与目标基因序列相似的非目标位点。为了提高Cas9的特异性并改进gRNA设计，研究人员已经产生了Cas9“缺口酶”。尼克斯高度准确，可以产生单链断裂，而不是双链断裂。此外，当与两个相邻的gRNA一起使用时，它们可以降低离目标编辑的概率。
目前有几种gRNA评分预测算法可供研究人员使用。其中许多工具基于Doench等人开发的算法计算目标和非目标分数。然而，我们仍需要改进此算法，因为当前的目标和非靶预测与实际切割效率不同。
CRISPR-Cas9技术潜在应用的另一个改进是使用新型Cas9酶。为了准确编辑CRISPR-Cas9基因组，在靶位点需要一个原间隔区相邻基序（PAM）序列。现有的Cas9只识别许多潜在PAM序列中的一小部分，限制了该技术的应用。最近，开发了一种新的Cas9，它可以识别更广泛的PAM序列，扩展了该技术的应用。
最后，同源定向修复（HDR）介导的KIs的效率很低，仅低于5%。CRISPR研究人员通过改进靶策略，特别是插入大DNA片段，致力于提高KI效率。这也是我们目前正在实验室中进行的工作。
与单一gRNA靶向相比，这导致KO效率提高了85%。
Yongwon Kwon博士 阿布卡姆
告诉我们你的多导RNA方法及其优点
YK公司：为了提高CRISPR-Cas9在KO的效率，我们开发了一种优化的Cas9-RNP转染方法，其中多个gRNA一起转染。靶位点的单个gRNA可能会导致或不会导致蛋白质表达缺失。然而，联合转染每个靶点的多个gRNAs可能会增加敲除蛋白表达的机会，因为以这种方式进行基因编辑可以非常精确地删除片段。
我们使用每个靶点两个引导物优化了Cas9 RNP转染方案。与单一gRNA靶向相比，这导致KO效率提高了85%。该技术的另一个好处是，它减少了对如此广泛的gRNA选择的需要，从而节省了宝贵的时间。
我们已将此方法应用于癌细胞群体，并发现Cas9 RNP转染消除了克隆和病毒转导的需要，使癌症发展和进展相关基因的功能研究变得简单得多。
你认为这个领域的未来发展如何？
YK公司：CRISPR-Cas9技术现在被常规应用于高效的基因编辑，为生物医学研究的进步做出了贡献。最近，CRISPR-Cas9已被用于确定潜在的治疗靶点，甚至已进入临床测试。在这些临床研究中密切监测安全性和效率非常重要，因为这项技术有能力塑造未来的临床应用。
从淘汰赛专家那里了解更多信息：
•如何利用淘汰模型取得研究成功–Hanna Dreja博士
•使用CRISPR/Cas9加速从长椅到床边的过渡–Karine Enesa博士
参考文献：
Doench，J.G.等。CRISPR-Cas9-介导基因高活性sgRNAs的合理设计。自然。2014
Doench，J.G.等。优化sgRNA设计，以最大限度地提高CRISPR-Cas9的活性和最小化非靶向效应。自然。2016
