简介
炎症与癌症之间的联系成为癌症的热门话题。然而，潜在的分子机制尚不清楚。参与癌症进展的癌症相关炎症包括炎症细胞和炎症介质的存在，其中包括癌症微环境中的趋化因子、细胞因子和前列腺素[1,2]. 在众多细胞因子中，肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种重要的多功能炎症细胞因子，具有多效性作用，涉及细胞凋亡、生存和免疫反应的调节[三–5]. 据报道，各种细胞都能释放TNF-α，如成纤维细胞、枯否细胞、角质形成细胞、浸润性炎症细胞（包括肿瘤浸润性巨噬细胞）以及肿瘤细胞（包括B细胞淋巴瘤和结肠癌细胞）[6,7]. TNF-α能够通过与包括TNF-β受体1（TNFR1）和TNF-γ受体2（TNFR2）在内的受体结合，增加细胞因子、蛋白酶和生长因子的产生[8]. TNFR2在免疫细胞中表达受限，调节有限的生物学功能，而TNFR1在人体组织中普遍表达，是TNF-α的主要信号受体[9]. 然而，TNF-α是否能上调其受体尚不清楚。炎症因子TNF-α能够促进肿瘤的生长、侵袭、转移和淋巴管生成[6,7,10–13]. 作为肿瘤促进剂，TNF-α激活Noxo1和Gna14以增强胃肿瘤的发生[11]. 然而，TNF-α在乳腺癌发生发展中的作用还没有很好的记录。
核因子κB（NF-κB）对TNFR-associated death domain protein（TRADD）的激活作出反应，TRADD介导蛋白复合体的募集导致细胞存活和炎症介质的释放[14]. NF-κB是协调先天免疫和炎症之间平衡的关键调节因子[15]. 据报道，在大多数细胞类型中，TNFR1的激活可以触发编码促生存和促炎症分子的基因的典型或非典型NF-κB依赖性转录调节[16]. TNFR1介导的NF-κB活化促进头颈部鳞状细胞增殖[10]. NF-κB和p38/MAPK信号协同促进TNF-α诱导的细胞因子IL-6的产生[17]. 与其他MAPK家族成员一样，p38作为一种磷酸激酶启动信号级联，促进细胞生长、分化、凋亡，并对炎症或应激作出反应[18]. 信号转导子和转录激活子3（STAT3）介导细胞因子受体向细胞核的信号转导[19]. STAT3的组成性激活是癌症中许多致癌信号通路的汇合点[20]. 在TNF-α给药条件下，TNFR1导致规范或非规范NF-κB通路的激活，随后诱导IL-6/JAK1/2/STAT3信号转导[21,22]. 然而，TNF-α在乳腺癌中调节TNFR1/NF-κB（和/或p38）/p-STAT3的意义尚不明确。
哺乳动物乙型肝炎X相互作用蛋白（HBXIP，或称为LAMTOR5）最初被鉴定为与乙型肝炎病毒X蛋白的C末端结合[23]. HBXIP是mTORC1激活所需的一种新型摇床组件[24]. HBXIP可以与survivin协同控制细胞凋亡和分裂，也可以作为中心体动力学和胞质分裂的调节剂来调节细胞生长[25,26]. 我们的研究小组已经报道HBXIP在乳腺癌中高度表达，显示了癌蛋白的功能[27–32]. 最近，我们发现HBXIP可以作为转录因子（如c-myc、SREBP-1c）的辅激活剂，促进乳腺癌的增殖和脂质代谢[33,34]. 然而，TNF-α对乳腺癌患者HBXIP的影响尚不清楚。
在本研究中，我们感兴趣的是肿瘤蛋白HBXIP上炎症因子TNF-α在炎症和癌症之间的联系中的意义。引人注目的是，我们发现TNF-α能够通过驱动NF-κB（和/或p38）/p-STAT3/HBXIP/TNFR1的正反馈回路上调HBXIP，从而促进乳腺癌的生长。我们的发现为TNF-α在乳腺癌发展中上调HBXIP的机制提供了新的见解。
结果
TNF-α给药能够通过激活TNFR1促进乳腺癌细胞的增殖
据报道，TNF-α促进胃肿瘤发生和肿瘤淋巴管生成[7,11]. 因此，我们推测TNF-α可能参与了乳腺癌细胞的增殖。据报道，用10 ng/ml或100 ng/ml TNF-α治疗可诱导肿瘤干细胞数量增加和肿瘤淋巴管生成[7,35]. 我们通过MTT、EdU掺入和集落形成分析表明，用20 ng/ml TNF-α处理能够增强MDA-MB-468和/或SK-BR3细胞的增殖。此外，siRNA沉默TNFR1可显著抑制TNF-α诱导的MDA-MB-468或SKBR-3细胞的增殖(图1A-一维)提示TNF-α通过激活TNFR1促进乳腺癌细胞增殖。通过Western blot分析验证细胞中TNFR1的表达（补充图1A）。为了排除20 ng/ml TNF-α介导细胞凋亡的可能性，我们使用Annexin-V-PI分析检测了细胞凋亡。正如预期的那样，我们观察到20ng/ml TNF-α治疗未能诱导细胞凋亡，这表明我们的系统可以排除20ng/ml TNF-β诱导细胞凋亡的可能性（补充图1B）。此外，我们观察到siTNFR1可以显著诱导细胞凋亡，这表明敲低TNFR1可以阻断TNF-α促进乳腺癌细胞增殖的作用。因此，我们得出结论，炎症细胞因子TNF-α通过激活其受体TNFR1促进乳腺癌细胞的增殖。
临床乳腺癌组织中TNF-α与HBXIP呈正相关，乳腺癌细胞中HBXIP上调
TNF-α能够通过激活癌症相关通路或上调Noxo1和Gna14促进癌症的发展[11]. 以前，我们证明癌蛋白HBXIP促进了乳腺癌的发展[27–30,33,34]. 因此，我们对TNF-α是否通过上调HBXIP促进乳腺癌的发展感兴趣。定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析显示，24例临床乳腺肿瘤组织中TNF-αmRNA水平高于癌旁组织(*第页<0.05，Wilcoxon的符号秩检验，图2A和补充表1）。此外，我们观察到上述组织中TNF-αmRNA水平与HBXIP mRNA水平呈正相关（r=0.7684**第页<0.01，皮尔逊相关，图2B)增加了TNF-α上调乳腺癌患者HBXIP的可能性。正如预期的那样，我们验证了TNF-α能够以剂量或时间依赖性的方式在MDA-MB-468和/或SK-BR3细胞的mRNA和蛋白质水平上调HBXIP的表达(图2C-第二版和补充图2A-2C）。然而，当TNFR1被siRNA击倒时，TNF-α在MDA-MB-468细胞中无法发挥作用(图2F和补充图2D），表明TNF-α依赖于乳腺癌细胞中的TNFR1上调HBXIP。接下来，我们发现TNF-α能够以剂量依赖的方式激活MDA-MB-468细胞中的HBXIP启动子(图2G). 相反，TNFR1的沉默显著地消除了该事件(图2H). 总之，我们得出结论，TNF-α与临床乳腺癌组织中的HBXIP呈正相关，并上调乳腺癌细胞中的HBXIP。
TNF-α通过激活转录因子STAT3激活HBXIP启动子
为了深入了解TNF-α激活HBXIP启动子的机制，我们通过Gene promoter Miner预测了HBXIP基因启动子中的转录因子结合位点(网址：http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/). 有趣的是，我们观察到HBXIP启动子区域存在涉及炎症反应的转录因子的几个结合元件，包括STAT3、STAT5a和AP1。为了进一步验证这些转录因子是否有助于TNF-α介导的HBXIP启动子的激活，我们构建了一系列突变型HBXIP基因启动子（补充图3A和图3A). 此外，我们构建了一个随机突变型HBXIP启动子作为阴性对照。突变体的序列与STAT3、STAT5a和AP1无关。我们的数据显示，TNF-α治疗也可以通过随机突变激活HBXIP启动子，这表明STAT3、STAT5a和AP1的元素在HBXIP的启动子激活中起重要作用（补充图3B）。此外，我们观察到，当STAT3的结合位点发生突变时，TNF-α诱导的HBXIP启动子激活可以显著消除（补充图3A）。正如预期的那样，用TNF-α处理细胞时，带有STAT3元件突变的HBXIP启动子的活性没有增加(图3B和补充图3C），表明STAT3可能激活由TNF-α介导的HBXIP启动子。此外，siRNA敲除STAT3能够消除细胞中的事件(图3C和补充图3D）。染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明，STAT3可以与MDA-MB-468细胞中HBXIP的启动子结合，TNF-α可以增强STAT3与HBXIP启动子的结合(图3D). 通过Western blot分析证实STAT3在细胞中的干扰效率(图3E). 总之，我们得出结论，TNF-α能够通过激活转录因子STAT3增加HBXIP启动子的活性。
TNF-α增强STAT3磷酸化通过NF-κB和/或p38信号在HBXIP启动子激活中的作用
据报道，705位点的磷酸化STAT3（p-STAT3）酪氨酸易位到细胞核中，并作为转录因子激活靶基因的表达[36,37]. 相应地，免疫荧光染色分析表明，TNF-α能够促进p-STAT3从细胞质向细胞核的移位，这可以通过沉默TNFR1来消除(图4A). NF-κB和p38/MAPK通路参与STAT3磷酸化的增加[17,38]. 有趣的是，我们观察到，给予PDTC（NF-κB的特异性抑制剂）可以降低MDA-MB-468和SK-BR细胞中TNF-α介导的p-STAT3或HBXIP的升高水平(图4B和补充图4A、4B）。此外，在MDA-MB-468细胞中使用PDTC可以减弱TNF-α增加的p-STAT3核滞留（补充图4C、4D）。此外，P65的沉默显著抑制了TNF-α诱导的细胞内HBXIP启动子的活性（补充图4E），这表明NF-κB激活的STAT3参与了肿瘤坏死因子-α诱导的乳腺癌细胞中HBXIP的上调。此外，我们证明，在MDA-MB-468和SK-BR3细胞中，用p-p38激酶活性抑制剂SB202190治疗可以消除TNF-α增加的p-STAT3和HBXIP(图4C和补充图4F，4G），表明p-p38/STAT3信号传导是TNF-α诱导的HBXIP表达所必需的。值得注意的是，我们发现PDTC和SB202190的联合治疗导致细胞内HBXIP相对于PDTC或SB202190-的单次使用下调(图4D,第4页). 总之，我们得出结论，TNF-α增加STAT3磷酸化通过乳腺癌中HBXIP启动子活化的NF-κB和/或p38信号传导。
TNF-α升高的HBXIP上调乳腺癌细胞TNFR1的表达
众所周知，反馈调节经常发生在癌症中[7,11]. 我们的研究小组报告称，HBXIP能够以反馈回路的方式促进乳腺癌的脂质代谢过程和MDM2/P53[28,34]. 因此，我们推测HBXIP可能以反馈方式参与TNFR1的调节。我们观察到，24例临床乳腺癌组织中TNFR1的mRNA水平高于相应的癌周组织(图5A和补充表1）。QRT-PCR分析显示HBXIP的表达水平与TNFR1的表达水平呈正相关(图5B). 正如预期的那样，我们观察到HBXIP过度表达可以上调TNFR1，而siRNA沉默HBXIP导致TNFR1在MDA-MB-468和SK-BR3细胞的mRNA和蛋白质水平上以剂量依赖性方式下调(图5C,第五天以及补充图5A-5D）。给药TNF-α后，HBXIP的敲低可抑制TNFR1在细胞中的表达(图5E和补充图5E），表明TNF-α能够通过激活HBXIP上调TNFR1。因此，我们得出结论，TNF-α升高的HBXIP能够上调乳腺癌细胞中的TNFR1。
TNF-α通过HBXIP促进乳腺癌生长在体外和体内
接下来，我们评估TNF-α是否可以通过HBXIP促进乳腺癌的生长。MTT和集落形成分析显示，HBXIP的敲除显著阻断了TNF-α增强的MDA-MB-468细胞增殖(图6A,6亿). 此外，流式细胞术分析表明，TNF-α增加了S期细胞的百分比，而siRNA沉默HBXIP可以消除该事件(图6C). 引人注目的是，MTT分析表明，敲除STAT3可以消除TNF-α加速的细胞增殖。相反，HBXIP的过度表达可以缓解TNF-α处理的细胞中STAT3敲低引起的抑制(图6D和补充图6），表明TNF-α通过STAT3/HBXIP信号传导促进乳腺癌细胞的增殖。通过Western blot分析验证了HBXIP在细胞中的干扰或过度表达的效率(图6E). 然后，肿瘤异种移植试验表明，TNF-α治疗显著促进裸鼠MDA-MB-468细胞的生长，而HBXIP沉默显著抑制肿瘤生长(图7A,7亿). 此外，免疫组织化学染色显示，小鼠肿瘤组织中HBXIP和细胞增殖标记物Ki67的表达水平显著增加，但HBXIP的敲除导致相反的结果(图7C). 此外，Western blot分析验证了小鼠肿瘤组织中HBXIP和TNFR1的表达水平(图7D). 因此，我们认为TNF-α可以通过HBXIP促进乳腺癌的生长在体外和体内.
讨论
炎症和癌症之间的联系成为癌症的热门话题[2]. 然而，其背后的机制在很大程度上仍然未知。与癌症相关的炎症因子促成了这一事件[1,5,39]. 在这些炎症因子中，TNF-α/TNFR1介导的信号传导已被广泛研究[35]. 我们小组已经报道HBXIP作为一种关键的癌蛋白促进了乳腺癌的发展[27,28,31,33,34]. 在本研究中，我们对TNF-α对乳腺癌患者HBXIP的影响感兴趣。
鉴于TNF-α可促进头颈鳞癌和胃癌的发展[10,11]，我们关注TNF-α是否参与乳腺癌的进展。有趣的是，我们发现TNF-α治疗可以加速乳腺癌细胞的增殖。此外，我们的数据排除了使用20 ng/ml TNF-α诱导细胞凋亡的可能性。然后，我们发现临床乳腺癌组织中TNF-α的表达水平与HBXIP的表达水平呈正相关。有趣的是，我们证明TNF-α/TNFR1可以上调乳腺癌细胞中的HBXIP。当细胞中的siRNA敲低TNFR1时，TNF-α未能上调HBXIP细胞的表达。这表明TNF-α能够通过TNFR1增强乳腺癌细胞中癌蛋白HBXIP的表达。
接下来，我们试图探讨肿瘤坏死因子-α上调乳腺癌患者HBXIP的机制。据报道，STAT3在癌症中起着重要的转录因子作用[36,40]. 磷酸化STAT3在激活其核内靶基因转录中的作用[36,37,41]. 在本研究中，我们验证了p-STAT3有助于TNF-α介导的HBXIP启动子的激活。众所周知，炎症细胞因子TNF-α可以启动复杂的信号级联，如NF-κB、JNK/AP1和p38/MAPK信号[7,11,42]. P-p38可以作为磷酸激酶激活STAT3的磷酸化[43]. 为了更好地理解其机制，我们验证了TNF-α对STAT3磷酸化的影响。正如预期，我们观察到TNF-α可以激活STAT3通过NF-κB和/或p38信号传导，导致乳腺癌细胞中HBXIP上调。TNF-α还可以通过NF-κB或p38信号传导诱导许多癌蛋白的表达，如JAG1、Fascin、VEGF和MMP2/MMP9，以促进癌症的发展[11,35,38,44]. 因此，我们认为TNF-α可能广泛影响包括HBXIP在内的癌基因在癌症中的表达。此外，我们证明HBXIP可以上调TNFR1的表达，形成TNFR1/NF-κB（和/或p38）/p-STAT3/HBXIP/TNFR1正反馈回路。在功能上，我们提供了TNF-α通过HBXIP促进乳腺癌生长的证据在体外和体内因此，我们得出结论，TNF-α/TNFR1激活NF-κB（和/或p38）/STAT3/HBXIP信号，导致癌症的发展。在治疗上，癌蛋白HBXIP可能是乳腺癌的靶点。
总之，我们提出了一个模型，即炎症因子TNF-α通过激活乳腺癌中的癌蛋白HBXIP而参与致癌。在此模型中，TNF-α作为肿瘤启动子刺激TNFR1，随后NF-κB和/或p38/MAPK信号传导导致转录因子STAT3激活，从而导致癌蛋白HBXIP上调。引人注目的是，HBXIP上调TNFR1的表达，在乳腺癌中形成TNFR1/NF-κB（和/或p38）/STAT3/HBXIP/TNFR1正反馈回路。我们的发现为TNF-α刺激HBXIP在乳腺癌炎症和癌症之间联系的机制提供了新的见解。
材料和方法
患者样本
24例临床乳腺肿瘤组织及其相应的瘤周组织是在天津第一中心医院（中国天津）手术切除后获得的。获得患者的书面同意，同意将样本用于研究目的。乳腺癌患者的信息见补充表1。该研究方案由南开大学研究伦理委员会批准。
试剂、细胞系和细胞培养
本研究中使用的试剂为SB202190（Sigma，St.Louis，USA）、PDTC（Sigma，St.Louis，USA）、TNF-α（Peprotech，USA）。乳腺癌细胞株MDA-MB-468和SK-BR3在DMEM培养基（Gibco，Grand Island，NY）、10%胎牛血清（FCS）、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素中培养，并将其置于湿化5%CO中2温度为37°C。
染色质免疫沉淀（ChIP）
如前所述，根据制造商的方案（Epigentek Group Inc，Brooklyn，NY）在MDA-MB-468细胞中进行ChIP分析[45]. 用特异性引物从免疫沉淀DNA样品中扩增HBXIP启动子区，包括STAT3结合位点。补充表2中列出了所有引物。所有实验至少进行了3次。
免疫组织化学染色（IHC）
如前所述，对样品进行免疫组织化学染色[46]. 使用了抗Ki67（美国CST细胞信号技术公司）和抗HBXIP（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）[33,47]. 3名独立观察者对免疫染色强度进行分类。
小鼠肿瘤异种移植
根据美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》制定的指南对裸鼠进行护理和治疗。动物移植是根据《赫尔辛基宣言》进行的。在裸鼠体内进行肿瘤移植。简而言之，将含有MDA-MB-468细胞的模拟组添加到对照溶剂（BSA，牛血清白蛋白）中，并用20 ng/ml TNF-α联合HBXIP或si-control每两天沉默一次，共5次。收集细胞并在2×10的条件下重新悬浮7每毫升含无菌磷酸盐缓冲盐水。三组4周龄雌性BALB/c裸鼠（中国北京实验动物中心）（每组5只）在小鼠肩部皮下注射0.1ml细胞悬液。注射后8天测量肿瘤体积，然后每4天测量一次肿瘤体积。肿瘤体积（V）=（L×W2)用卡尺测量长度（L）和宽度（W），计算出×0.5。30天后，处死小鼠，切除肿瘤并进行测量以进行进一步研究。
双荧光素酶报告基因测定
将贴壁细胞接种到24孔板中，确保细胞汇合率达到60-80%，然后与含有野生型或HBXIP启动子突变型或pGL3-Basic的质粒共转染作为阴性对照，并将pRL-TK质粒（Promega，Madison，WI，USA）作为内标化。24小时后收集细胞提取物，并使用裂解缓冲液（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）进行裂解。使用Dual-luciferase reporter Assay System（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）作为制造商的程序进行双重荧光素酶报告基因检测。所有实验重复至少3次。
质粒构建和小干扰RNA（siRNA）
我们实验室保存了PGL3-Basic、pCMV-tag2B、PGL3-HBXIP、pRL-TK（Promega，Madison，WI，USA）和pCMV-HBXIP，pcDNA3.0、pcDNA3.0-HBXIP。将HBXIP启动子中的STAT3、STAT5a和AP1突变体克隆到质粒PGL3-Basic中。补充表2中列出了所有引物和siRNA序列。
RNA提取、RT-PCR和定量实时PCR（qRT-PCR）
根据制造商的程序，使用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从细胞（或组织）中提取总RNA。根据制造商的协议，使用多（A）尾总RNA和带有ImPro-II逆转录酶的逆转录引物（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）进行逆转录。如前所述，采用RT-PCR[48]. qRT-PCR是根据Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）（德国曼海姆罗氏诊断有限公司）的指示进行的。补充表2中列出了所有引物。以GAPDH为对照。
蛋白质印迹分析
如前所述使用蛋白质印迹分析[49]. 本研究中使用的主要抗体为兔抗HBXIP抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA，USA）、兔抗Ki67抗体（Cell Signaling Technology company，CST，USA-β-肌动蛋白抗体（Sigma，圣路易斯，美国）、兔抗STAT3抗体（Immunoway Biotechnology Company，美国）[50]，兔抗磷酸p38抗体（Cell Signaling Technology company，CST，USA）[51]和小鼠抗TNFR1抗体（Proteintech Group，芝加哥，伊利诺伊州，美国）[52]，兔抗P65抗体（Proteintech Group，芝加哥，伊利诺伊州，美国）。
免疫荧光染色
将细胞接种在经酸处理的玻璃盖玻片上，然后用冰镇4%多聚甲醛固定细胞20分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次，每次5分钟，放在台式浓缩器上。然后，用0.1%Triton X-100在PBS中渗透细胞20分钟。用PBS洗涤三次后，样品在含有5%BSA的PBS中封闭1小时，然后在室温下与一级抗体孵育2小时。用PBS洗涤三次后，用荧光团结合二级抗体（丹麦DAKO）培养细胞，并进行DAPI染色。再次清洗，将载玻片装入90%的甘油，并在荧光显微镜下观察（德国蔡司Axio成像仪Z1）。在三个随机选择的区域中观察细胞。
3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定
在转染或其他处理之前，将MDA-MB-468细胞接种到96孔板（1000个细胞/孔）上24小时。然后，从转染后第1天到第3天或第4天，每天使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）检测评估细胞增殖。
EdU分析
根据制造商的说明（中国广州RiboBio），使用Cell-Light TM EdU成像检测试剂盒进行五乙烯基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入分析。
流式细胞仪分析
如前所述使用流式细胞术分析协议[18]. 将MDA-MB-468细胞以1×10的比例放置在6孔板中5每个培养皿中的细胞，在无血清DMEM中保存48小时，然后收集细胞并用碘化丙啶或膜联蛋白V染色。
菌落形成分析
为了进行克隆原性分析，转染48小时后，将1000个活的转染细胞放置在6孔板中，并在完全培养基中保存2周。菌落用甲醇固定并用结晶紫染色。
统计分析
每个实验至少重复3次。通过使用学生的吨对独立组进行测试，假设第页<0.05 (*),第页<0.01 (**),第页<0.001（***），不显著（ns）。采用Wilcoxon符号秩检验分析乳腺癌组织及其癌周组织中TNF-α和TNFR1的表达水平。皮尔逊相关系数用于确定乳腺癌组织中HBXIP与TNF-α或TNFR1 mRNA水平之间的相关性。
利益冲突
没有利益冲突需要披露。
给予支持
本研究得到了国家自然科学基金（No.81272218、81372186、31670769和31670771）、国家基础研究计划（973计划，No.2015CB553703和2015CB553905）、重大传染病防治项目（No.2014ZX0002002-005）的支持重点慢性非传染性疾病防治项目（No.2016YFC130340）。
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