Rescue of impaired blood-brain barrier in tuberous sclerosis complex patient derived neurovascular unit

doi:10.1186/s11689-024-09543-y

.2024年5月23日；16(1):27.

doi:10.1186/s11689-024-09543-y。

结节性硬化症患者衍生神经血管单元血脑屏障受损的抢救

附属公司

¹美国纳什维尔范德比尔特大学物理和天文系。
²美国纳什维尔范德比尔特大学范德比特综合生物系统研究与教育研究所。
^三美国纳什维尔范德比尔特大学细胞与发育生物学系。
⁴美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心神经外科。
⁵美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心儿科。
⁶美国波士顿哈佛医学院波士顿儿童医院神经内科Rosamund Stone转化神经科学中心。
⁷美国纳什维尔范德比尔特大学生物医学工程系。
⁸美国纳什维尔范德比尔特大学分子生理学和生物物理系。
⁹美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心神经外科。kevin.ess@childrenscolorado.org。
¹⁰美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心儿科。kevin.ess@childrenscolorado.org。
¹¹美国科罗拉多大学安舒茨医学院儿科。kevin.ess@childrenscolorado.org。
¹²美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心儿科。diana.neely@vumc.org。

^#贡献均等。

PMID： 38783199
预防性维修识别码：项目经理1112784
内政部： 10.1186/s11689-024-09543-y

结节性硬化症患者衍生神经血管单元血脑屏障受损的抢救

杰奎琳·布朗等。神经病学杂志. 2024.

.2024年5月23日；16(1):27.

doi:10.1186/s11689-024-09543-y。

附属公司

¹美国纳什维尔范德比尔特大学物理和天文系。
²美国纳什维尔范德比尔特大学范德比特综合生物系统研究与教育研究所。
^三美国纳什维尔范德比尔特大学细胞与发育生物学系。
⁴美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心神经外科。
⁵美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心儿科。
⁶美国波士顿哈佛医学院波士顿儿童医院神经内科Rosamund Stone转化神经科学中心。
⁷美国纳什维尔范德比尔特大学生物医学工程系。
⁸美国纳什维尔范德比尔特大学分子生理学和生物物理系。
⁹美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心神经外科。kevin.ess@childrenscolorado.org。
¹⁰美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心儿科。kevin.ess@childrenscolorado.org。
¹¹美国科罗拉多大学安舒茨医学院儿科。kevin.ess@childrenscolorado.org。
¹²美国纳什维尔范德比尔特大学医学中心儿科。diana.neely@vumc.org。

^#贡献均等。

PMID： 38783199
预防性维修识别码：项目经理1112784
内政部： 10.1186/s11689-024-09543-y

摘要

背景：结节性硬化综合征（TSC）是一种多系统遗传病，可导致大脑和其他重要器官的良性肿瘤。最衰弱的症状来自中枢神经系统的参与，并导致多种严重症状，包括癫痫发作、智力残疾、自闭症和行为问题。TSC是由TSC1或TSC2基因的杂合突变引起的，mTOR激酶的失调及其多方面下游信号改变是疾病发病的核心。虽然这种疾病的神经后遗症已经得到了很好的证实，但对于这些突变如何影响细胞成分和血脑屏障（BBB）的功能，人们知之甚少。

方法：我们利用人类诱导的多能干细胞和微流体细胞培养技术，生成了TSC疾病特异性BBB细胞模型。

结果：利用微生理系统，我们证明从TSC2杂合突变细胞产生的BBB显示出增加的通透性。这可以通过野生型星形胶质细胞或雷帕霉素（一种mTOR激酶抑制剂）治疗来挽救。

结论：我们的研究结果证明了微生理系统在研究人类神经疾病方面的实用性，并提高了我们对促TSC发病机制的细胞谱系的认识，并为未来的治疗提供了依据。

关键词：星形胶质细胞；BBB；人干细胞；微流体；雷帕霉素；组织芯片；m任务大纲。

PubMed免责声明

利益冲突声明

Mustafa Sahin博士报告说，诺华、Biogen、Astellas、Aeovian、Bridgebio和Aucta提供了支持。他曾在诺华、罗氏、Regenxbio、SpringWorks Therapeutics、Jaguar Therapeotics和Alkermes的科学咨询委员会任职。

数字

图1
NVU示意图概述。血管室（1，粉色），其中装载BMEC并灌注血管室介质。带有3µm孔的多孔PET膜（2，灰色）在一侧支持一层BMEC，在另一侧支持一个“大脑”神经细胞室侧支持一层星形胶质细胞。神经室（4，黄色）在水凝胶中包含神经元和其他星形胶质细胞。通过神经细胞室的灌注通道显示为紫色

图2
控制和屏障功能的比较*TSC2系统*-在Transwell平板中进行突变BMEC单细胞培养。A类与对照组（CC3）BMEC培养物相比，TSC患者衍生（TSP8-15）BMEC跨孔培养物显示3000DA的通透性增加，但300Da右旋糖酐的通透率无统计学意义。野生型人周细胞（Peri）形成最小屏障(N个 = 2–4).B类测量在不同孔径的膜上培养的CC3和TSP8-15 BMEC的跨内皮电阻（TEER）。数据的双向方差分析表明，基因型依赖性F（1,16）=18.87(*P（P）* < 0.0005），但与膜孔径无关的F（2,16）=1.91(*P（P）* = 0.1791）对TEER的影响（整体*P（P）* < 0.0001,N个 = 2–4)

图3
NVU共同培养体系中BBB的中断。A类与CC3相比，培养8天的TSC患者衍生（TSP8-15）BMEC Transwell培养物显示3kD FITC右旋糖酐的渗透率较小，但无统计学意义(第页 < 0.06,N个 = 5).B类在NVU系统中，与匹配基因型的星形胶质细胞和神经元共培养8天后，与CC3相比，TSP8-15的BBB通透性显著增加(第页 < 0.01,N个 = 5)

图4
BMEC培养物中连接蛋白的表达。A类来自CC3和TSP8-15 iPSC系的BMEC单层表达BMEC标记物cloudin、claudin-5、ZO-1和VE-cadherin。所有图像的比例尺=100µm。B类显示了种子CC3和TSP8-15 NVU血管BMEC室（顶部面板）以及神经元和星形细胞神经细胞室（底部面板）的相位图像。所有图像中的比例尺=400µm

图5
NVU中BBB渗透率增加，产生于*TSC2系统*杂合突变细胞与等基因对照细胞的比较。A类TSP77+/+和TSP77±衍生的BMEC表达BMEC标记蛋白闭塞、克劳丁-5、ZO-1和谷氨酸-1。所有图像的比例尺均为100µm。B类与等基因对照TSP77+/+NVU相比，TSP77±NVU的BBB通透性显著增加(第页 < 0.01,N个 = 5)

图6
控制星形胶质细胞拯救TSC BBB功能。A类体外培养第6-8天（DIV）测定的BBB渗透性*TSC2系统*突变体（TSP8-15）NVU显著高于对照（CC3）NVUs(第页 < 0.01,N个 = 5).B类BBB渗透率*TSC2系统*接种对照（CC3）星形胶质细胞的（TSP8-15）突变NVU与对照（CC3NVU）测定的BBB通透性没有显著差异(N个 = 5,第页 > 0.05).C类接种BMEC、神经元和星形胶质细胞的NVU的BBB通透性来源于不同TSC患者（TSP23-9）的iPSC，携带不同的*TSC2系统*功能缺失突变也显著高于对照NVU（CC3=2.95×10^–7厘米/秒，第页 < 0.001,N个 = 5).D类其他情况下存在对照（CC3）星形胶质细胞*TSC2系统*突变型（TSP23-9）NVU将BBB渗透性恢复到与对照（CC3）NVUs测量值在统计上无法区分的水平。(第页 = 不适用。，N个 = 5)

图7
雷帕霉素可缓解TSC BBB的通透性。A类在体外第5天，TSP8-15 NVU的血脑屏障通透性显著高于CC3 NVU的血脑屏障通透性(第页 < 0.01;N个 = 5). 与载体处理的TSC NVU相比，用雷帕霉素灌注血管隔室导致TSC血脑屏障通透性在统计学上显著降低，并且在统计学上与对照组（CC3）不可区分。B类就TSP8-15 NVU而言，培养5天时，TSP23-9 NVU的BBB通透性显著高于CC3 NVU(第页 < 0.001,N个 = 5). 雷帕霉素灌流TSP23-9 NVU中BBB的渗透性显著小于经溶媒处理的对应物，且在统计学上与CC3水平无明显差异。TSP23-9样本的误差条太小，无法在此图上进行解析（p N.S。，N个 = 5)

图8
基因型和雷帕霉素对神经细胞和BBB NVU外代谢组的影响。A类主成分分析表明组织类型（血管与大脑）之间存在显著的代谢差异。此外，雷帕霉素对大脑和血管腔室的治疗会引起代谢组的改变。基因型（野生型，CC3 vsTSC2系统杂合突变TSP8-15）似乎对代谢组的影响较小。B类层次聚类图提供了代谢物水平差异的全球比较>两倍第页值小于0.05。不同个体代谢物水平（行）按基因型、组织类型和雷帕霉素治疗（列）进行聚类。代谢物根据所有样品的相对特征丰度进行着色，从低（绿色）到高（红色）

图9
对照组（CC3）和TSC（TSP8-15）NVU中的雷帕霉素、基因型和组织类型改变了代谢途径。显示了前25条重要反应途径。在列出的每种途径中，至少有一个变量（雷帕霉素治疗、基因型、组织类型）显示出显著差异。重要性定义为第页-在含有四种或四种以上代谢物且表达水平发生变化的通路中，值小于或等于0.05，且变化最小为两倍

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的更新

结节性硬化症患者衍生神经血管单元中受损血脑屏障的抢救。
Brown JA、Faley SL、Judge M、Ward P、Ihrie RA、Carson R、Armstrong L、Sahin M、Wikswo JP、Ess KC、Neely MD。 Brown JA等人。 bioRxiv[预打印]。2023年12月16日2023.12.15.571738。doi:10.1101/2023.12.15.571738。生物Rxiv。2023 更新位置：《神经疾病杂志》。2024年5月23日；16(1):27. doi:10.1186/s11689-024-09543-y。 PMID：38168450 免费PMC文章。已更新。预打印。

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双等位基因突变TSC2系统导致人类iPSC-Derived神经元皮质结节相关的异常。
Winden KD、Sundberg M、Yang C、Wafa SMA、Dwyer S、Chen PF、Buttermore ED、Sahin M。 Winden KD等人。神经科学杂志。2019年11月20日；39(47):9294-9305. doi:10.1523/JNEUROSCI.0642-19.2019。Epub 2019年10月7日。神经科学杂志。2019. PMID：31591157 免费PMC文章。
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久松C、岛田T、宫本茂A、李A、山形K。 Hisatsune C等人。神经科学杂志。2021年9月29日；41(39):8134-8149. doi:10.1523/JNEUROSCI.1930-20.2021。Epub 2021年8月20日。神经科学杂志。2021 PMID：34417327 免费PMC文章。
结节性硬化症症状的电路和生化基础：从癫痫到神经认知缺陷。
Feliciano DM、Lin TV、Hartman NW、Bartley CM、Kubera C、Hsieh L、Lafourcade C、O'Keefe RA、Bordey A。 Feliciano DM等人。国际神经科学发展杂志。2013年11月；31(7):667-78. doi:10.1016/j.ijdevneu.2013.02.008。Epub 2013年2月26日。国际神经科学发展杂志。2013 PMID：23485365 免费PMC文章。审查。
寻找结节性硬化症综合征的治疗方法：从遗传学到靶向药物治疗。
McEneaney LJ，三通AR。 McEneaney LJ等人。高级基因。2019;103:91-118. doi:10.1016/bs.adgen.2018.11.003。Epub 2018年12月20日。高级基因。2019. PMID：30904097 审查。

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