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.2024年3月26日；43(3):113896.
doi:10.1016/j.celrep.2024.113896。 Epub 2024年3月4日。

ATM蛋白激酶对转录模式、聚ADP-核糖和RNA-DNA杂交的调控

菲利普·伍利 1, 温雪梅 1, 奥利维亚·M·康威 1, 尼科莱特·A·恩德 1, 李继勋 2, Tanya T Paull先生 三
附属公司

ATM蛋白激酶对转录模式、聚ADP-核糖和RNA-DNA杂交的调控

菲利普·伍利等。 单元格代表. .

摘要

共济失调毛细血管扩张症突变（ATM）蛋白激酶是DNA损伤反应的主调节器，也是氧化应激的重要传感器。共济失调-扩张症（A-T）患者脑组织中的基因表达分析表明，患者小脑中发生大规模的转录变化，这与转录基因的表达水平和鸟嘌呤胞苷（GC）含量有关。在培养的人类神经元样细胞中，我们绘制了多聚（ADP-核糖）和RNA-DNA杂交积累基因组范围内ATM抑制的位置，发现这些标记也与高转录水平、活性转录组蛋白标记和高GC含量一致。抗氧化剂治疗逆转转录区中R环的积累，这与活性氧物种在促进这些损伤中的中心作用一致。基于这些结果，我们假设转录相关损伤在ATM缺乏细胞中积累，这些位点的单链断裂和PARylation最终产生转录变化，从而损害小脑功能，并导致A-T患者的神经变性。

关键词：ATM；CP：分子生物学；DNA修复；R回路；小脑共济失调；聚ADP-核糖基化；转录。

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利益冲突声明

利益声明作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.A-T患者转录组显示出与对照组的显著差异。
（A） 比较小脑A-T患者转录组（5名患者）和对照转录组（4名患者）的MA图。虚线对应|Log2FC|>1，实线对应|Log2FC|>2。橙色对应于Log2FC<−1，q<0.01（下调的基因集），蓝色对应于Log2FC>1，q<0.01（上调的基因集）。FC，折叠更改。（B） MA图比较BA9皮层A-T患者转录组和控制患者转录组。（C） MA图比较BA10皮层A-T患者转录组和控制患者转录组。（D） 每种组织类型中上调（|Log2FC|>1）、下调（Log2FC<−1）和未受影响基因集的基因数量。括号中的基因集表示与野生型（|Log2FC|>2）相比变化至少4倍的差异转录基因的数量。FDR，错误发现率。（E） 人类小脑共济失调相关基因属于每种组织类型的上调和下调基因集。带下划线的基因位于|Log2FC|>2子集中。（F） 小脑中具有最极端|Log2FC|值的500个基因的热图。列是患者，行是基因。
图2。
图2 A-T患者的差异表达基因与转录物丰度和GC含量的模式一致。
（A） q<0.01的小脑基因的转录变化与表达等级图。表达等级定义为按平均对照患者转录物丰度排序的q<0.01的所有基因集。表达等级越高，对照组中的基因表达越高。队列包括5名A-T患者和4名对照组（见表S1）。（B） 小脑下调基因集的表达分位数直方图。如（A）所示，但没有q值要求，所有基因都是按照平均对照患者转录物丰度排序的，然后被分成100个大小相等、不重叠的箱子。最右边的箱子中含有对照组患者中1%的最高表达基因，最左边的箱子中包含对照组患者1%的最低表达基因。在直方图上标出每个基因库中下调基因的数量。浅橙色：与对照组相比，A-T患者Log2FC<1的基因；深橙色：Log2FC<2的基因。（C） 小脑上调基因集的表达分位数直方图。浅蓝色：与对照组相比，A-T患者Log2FC>1的基因；深蓝色：Log2FC>2的基因。（D） 如（A）所示，但BA9皮层除外。（E） 如（B）所示，但BA9皮层除外。（F） 如（C）所示，但BA9皮层除外。（G） 图1A中小脑上调、下调和未受影响基因集的基因GC含量密度图。（H） 图1B中BA9上调、下调和未受影响基因集的基因GC含量密度图。（一） 图1C中BA10上调、下调和未受影响基因集的基因GC含量密度图。（J） 小脑上调、下调和未受影响基因集每个基因最大100-nt GC含量的密度图。（K） BA9上调、下调和未受影响基因集每个基因最大100-nt GC含量的密度图。（五十） BA10上调、下调和未受影响基因集每个基因最大100-nt GC含量的密度图。
图3。
图3有丝分裂后神经元样细胞中的ATM抑制产生ROS依赖性单链断裂。
（A） 基于先前观察的ATM缺乏细胞中转录相关损伤的工作模型。,ATM的丢失会在人类细胞中产生高ROS，从而产生R环、ssDNA断裂、高PAR化和蛋白质聚集。（B） 从SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞分化的有丝分裂后人类神经元样细胞的分化细胞的亮场图像（左上）和碱性彗星测定结果的实例，比较未处理、ATMi处理和ATMi+NAC条件。比例尺：20μm。（C） 碱性彗星实验中橄榄矩的定量测定测量了每个治疗组的>380个细胞。分化后的SH-SY5Y细胞被短发夹RNA耗尽ATM，并辅以SETX的C末端解旋酶域的表达，如图所示（左）。分化后的SH-SY5Y细胞用ATMi或ATMi加NAC处理，如图所示（右）***假设方差不相等，通过双样本t检验，p<0.0005。
图4。
图4.PAR ChIP显示了ATM活动损失时信号增加。
（A） 未经处理的SH-SY5Y分化神经元样细胞（“无ATMi”）、用1μM AZD1390（“+ATMi“）处理2天的细胞，以及以前发布的数据集中的ATAC-seq和H3K27ac数据中PAR-ChIP的基因组浏览器视图示例。,（B） 在有无ATMi的情况下回收PAR ChIP产品；显示的信号是来自2个复制的ChIP信号，去掉了输入贡献，并根据每个样本的读取深度进行了标准化读取。（C） 基于SH-SY5Y细胞的RNA-seq数据，在所有启动子（TSS上游1000nt到下游500nt）和转录基因启动子处的正常化PAR-ChIP信号。（D） 与TSS全基因组H3K27ac信号模式相比，ATMi存在下PAR ChIP信号的累积模式。（E） H3K27ac峰值位置的标准化PAR ChIP信号（57068）。（F） H3K27me3峰值位置的标准化PAR ChIP信号（176439）。（G） ATMi存在下PAR ChIP信号的累积模式与ATAC-seq峰位（“中心”）全基因组（包括上游和下游3kb）的ATAC-seq信号模式相比。（H） 正常化的PAR ChIP信号显示在1号染色体位置的子集上，GC含量显示为指定水平。我们在每次分析中使用了100-nt序列块（除10–20[13181]、70–80[13677]和80–90[2523]外，所有序列块均为14000个序列块）。显示了这些块的位置（“中心”），以及上游和下游的3-kb窗口***通过双样本t检验，p<0.0005，假设与未经治疗的ATMi相比，差异不相等。NS，无显著性。
图5。
图5 R环随着ATM的抑制而增加，并通过抗氧化处理而缓解。
（A） 未经处理的SH-SY5Y分化神经元样细胞（“R-ChIP no-ATMi”）、用1μM AZD1390（“R-ChIP+ATMi”）处理2天的细胞、仅用NAC处理的细胞（“R-ChIP+NAC”）以及同时含有ATMi和NAC的细胞（”R-ChIP+ATMi+NAC“）中R-ChIP的基因组浏览器视图示例如图4所示，与ATMi存在时的PAR ChIP信号相比。显示的信号是来自2个复制的ChIP信号，去掉了输入贡献，并根据每个样本的读取深度对读取进行了标准化。（B） 如图所示，TSS全基因组累积R-ChIP信号的模式。（C） 转录启动子处的标准化R-ChIP信号。（D–F）分别在H3K27ac（D）、H3K4me1（E）和H3K4me3（F）ChIP位置的归一化R-ChIP信号。（G） 如图所示，ATMi处理细胞全基因组中PAR ChIP位点的累积R-ChIP信号模式。（H） ATMi处理细胞中PAR ChIP位点的正常化R-ChIP信号。（I） ATAC序列位置的归一化R-ChIP信号。（J） 如图所示，ATAC-seq位点的累积R-ChIP信号模式***假设方差不相等，通过双样本t检验，p<0.0005。
图6。
图6 PAR和R-ChIP信号与转录物丰度和GC含量相关。
（A） 平均TSS PAR ChIP与ln（转录物丰度）标绘。在图中，TSS被定义为基因启动上游1000 nt到下游500 nt的窗口。样本空间包括PAR存在于TSS中的位置，以及来自RNA-seq（“活性TSS”）的相应转录物丰度信息。样本空间按转录物丰度值排序，并划分为100万个观察值的非重叠箱。绘制了每个箱子的平均PAR和平均ln（丰度）值。对无ATMi和+ATMi PAR样品进行处理。（B） 如（A）所示，但不适用于ATMi和+ATMi R-ChIP。（C） 如（B）所示，但对于NAC处理的R-ChIP。（D） 根据100-nt滚动平均GC含量绘制的平均TSS PAR ChIP。样本空间包括PAR存在于TSS中的位置以及相应的转录丰度信息（“活性TSS”）。样品按GC含量分类，并分为250000个观察值的非重叠箱。绘制了每个料仓的平均PAR和平均GC含量。该过程是在没有ATMi和+ATMi PAR样本的情况下进行的。（E） 如（D）所示，但不适用于ATMi和+ATMi R-ChIP。（F） 如（E）所示，但对于NAC处理的R-ChIP。（G） 根据平均GC含量和平均R-ChIP绘制平均PAR ChIP（仅无ATMi样品）。样本空间包括PAR和R-ChIP信号都存在的位置。样品空间首先按GC含量分类为500000个观察值的非重叠箱。然后根据R-ChIP值对每个500000个观测值进行排序，然后将其划分为25000个非重叠观测值。根据平均PAR信号和平均GC含量绘制每个25000个观察点，并用ln（R-ChIP）着色。（H） 如（G）所示，但适用于+ATMi ChIP。（一） 不同位置子集的每个GC箱的平均ChIP信号（仅无ATMi样本）。PAR和R-ChIP重合的位置子集按GC含量排序，并划分为250000个观察值的非重叠区域。存在PAR但没有R-ChIP的位置子集，以及存在R-ChIP但没有PAR的位置子集均按GC内容排序，并划分为100万个观察值的非重叠区域。（J） 如（I）所示，但对于ATMi处理的细胞。
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