Analysis of hemisphere-dependent effects of unilateral intrastriatal injection of α-synuclein pre-formed fibrils on mitochondrial protein levels, dynamics, and function

doi:10.1186/s40478-022-01374-z

.2022年5月23日；10(1):78.

doi:10.1186/s40478-022-01374-z。

单侧纹状体内注射α-突触核蛋白预形成纤维对线粒体蛋白水平、动力学和功能的半球依赖性影响分析

玫瑰B信条^1 2, Adeel A备忘录^1 2 三, 信德湖P Komaragiri^1 2, 桑迪普·K·巴罗迪亚^1 2, 马修·S·戈德堡^4 5 6

附属公司

¹阿拉巴马大学伯明翰分校神经变性和实验治疗中心，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。
²阿拉巴马大学伯明翰分校神经病学系，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。
^三阿拉巴马大学伯明翰分校神经工程博士项目，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。
⁴阿拉巴马大学伯明翰分校神经变性和实验治疗中心，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。mattgoldberg@uab.edu。
⁵阿拉巴马大学伯明翰分校神经病学系，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。mattgoldberg@uab.edu。
⁶阿拉巴马大学伯明翰分校神经生物学系，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。mattgoldberg@uab.edu。

PMID： 35606853
预防性维修识别码：项目经理9125944
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单侧纹状体内注射α-突触核蛋白预形成纤维对线粒体蛋白水平、动力学和功能的半球依赖性影响分析

玫瑰B信条等。神经病理学学报. 2022.

.2022年5月23日；10(1):78.

doi:10.1186/s40478-022-01374-z。

作者

玫瑰B信条^1 2, 阿黛尔A备忘录^1 2 三, 信德湖P Komaragiri^1 2, 桑迪普·K·巴罗迪亚^1 2, 马修·S·戈德堡^4 5 6

附属公司

¹阿拉巴马大学伯明翰分校神经变性和实验治疗中心，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。
²阿拉巴马大学伯明翰分校神经病学系，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。
^三阿拉巴马大学伯明翰分校神经工程博士项目，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。
⁴阿拉巴马大学伯明翰分校神经变性和实验治疗中心，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。mattgoldberg@uab.edu。
⁵阿拉巴马大学伯明翰分校神经病学系，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。mattgoldberg@uab.edu。
⁶阿拉巴马大学伯明翰分校神经生物学系，美国阿拉巴马州伯明翰，35294。mattgoldberg@uab.edu。

PMID： 35606853
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摘要

遗传和神经病理学证据强烈暗示神经变性中α-突触核蛋白的异常形式。丝氨酸129磷酸化的α-突触核蛋白（pS129）特异性抗体对帕金森氏病（PD）和其他突触核细胞病（如路易体痴呆（DLB）和多系统萎缩（MSA））特征的病理性蛋白聚集体具有选择性。尽管大多数同核蛋白病的病因尚不明确，但大量证据表明线粒体功能障碍。基于颅内注射α-突触核蛋白前形成纤维（PFFs）的动物模型的最新发展为研究α-突触核蛋白聚集体的扩散和神经毒性提供了一个有价值的实验系统，然而，PFF诱导的蛋白质聚集体对线粒体功能和动力学的影响尚未在体内进行严格检测。为了帮助填补这一知识空白，我们向小鼠纹状体单侧注射特征良好的小长度（<30 nm）PFF或单体α-突触核蛋白对照物，并测量pS129α-突触核蛋白免疫反应聚集物的分布和程度，黑质酪氨酸羟化酶免疫反应神经元的丢失，注射后3个月和6个月线粒体蛋白质丰度和线粒体呼吸链组分活性。早在注射后3个月，纹状体内注射小长度PFF（而非单体α-突触核蛋白对照）就在皮层、中脑腹侧和纹状体以及罕见的脑区（如海马）诱导了强大的pS129α-突触核蛋白免疫反应性内含物。注射PFF后3个月和6个月，在注射PFF的大脑半球观察到黑质酪氨酸羟化酶免疫反应神经元明显丢失。单侧纹状体注射小长度PFF还导致VDAC1、COX-IV和DRP-1等线粒体蛋白皮质水平的半球依赖性和治疗依赖性变化，以及对侧纹状体内线粒体复合体I活性的功能性变化。总之，这些数据表明，纹状体内注射具有小长度PFF的小鼠可诱导广泛的双侧蛋白质聚集、显著的单侧黑质细胞丢失，并改变对侧线粒体蛋白质水平和呼吸链活性。我们的数据表明，该动物模型可能有助于研究线粒体功能障碍在α-突触核蛋白疾病中的作用，研究α-突触核蛋白聚集体的半球依赖性效应，并测试针对线粒体功能障碍和蛋白质聚集体的神经保护疗法。

关键词：聚合；路易体；线粒体；帕金森病；预形成纤维；突触核蛋白。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的财务或非财务利益。

数字

图1
纤维生成、质量控制和实验时间表。一用于纤维生成和质量控制分析的程序流程图。B类用于对纤维进行超声波处理的杯状声波仪。C类在PBS中稀释1:300的声波PFF的电子显微照片，并在涂有甲醛的EM网格上发现。比例尺为100 nm。D类显示EM显微照片测量的声波粒子长度分布的直方图。纤维长度通常均匀，平均长度为29.5nm。E类通过动态光散射测量的声波PFF半径直方图（中值13.5 nm）。F类在注射后3个月或6个月，经三方体内注射2μl单体或PFF，然后安乐死并采集大脑进行分析的示意图。Ctx：皮层，Str：纹状体，Thal：丘脑，vMB：腹侧中脑

图2
pS129 PFF注射小鼠的免疫荧光。一PFF注射小鼠在每次3个月时pS129α-突触核蛋白阳性聚集物的代表性皮层、纹状体、丘脑、海马和腹侧中脑图像。B类PFF注射小鼠在每次6个月时pS129α-突触核蛋白阳性聚集物的代表性皮层、纹状体、丘脑、海马和腹侧中脑图像。C类使用尼康NIS元件软件在3个月时测量的每个大脑区域中pS129α-突触核蛋白聚集体的数量（左）。与FDR校正值的多重t检验比较（Q设置为1%）表明，与对侧大脑半球杏仁核相比，同侧大脑半球pS129α-突触核蛋白聚集体的数量显著增加(第页 = 0.0003），丘脑(第页 = 0.0062），纹状体(第页 = 0.0015）和岛叶皮层(第页 = 0.0046），从N=3 PFF注射小鼠的3-5个切片中。6个月后（右），通过FDR校正的多重t检验（Q设置为1%）对pS129进行量化，结果显示，与对侧大脑半球杏仁核相比，同侧大脑半球的pS129α-突触核蛋白聚集体更大(第页 = 0.0099），丘脑(第页 < 0.000001），纹状体(第页 = 以及岛叶皮层(第页 = 0.000389).D类pS129α-突触核蛋白阳性聚集体在6个月时在杏仁核（同侧）的数量与3个月时相比显著减少第页 = 0.00365和对侧第页 = 0.019），以及对侧丘脑和岛叶皮层(第页 = 0.0378, 0.0170).E类下午3个月和6个月时大脑皮层、纹状体、丘脑、海马和中脑腹侧pS129α-突触核蛋白阳性包涵体形态的高分辨率共焦成像。F类纹状体内单体注射6个月后检测到pS129α-突触核蛋白阳性内含物。A、B和F的比例尺为1000µm，E为150µm

图3
PFF诱导SNc中TH+细胞的丢失。一单体和PFF注射小鼠3个月p.i.的代表性TH DAB IHC。B类使用无偏体视学对SNc中的TH+细胞进行计数，结果表明，与同侧单体相比，注射PFF的小鼠同侧半球的TH+淋巴细胞显著减少（双向方差分析，PFF的主要作用，F_(1,36) = 6.667,第页 = 0.014; 单体与PFF：同侧，Sidak的多重比较，第页 = 0.0451).C类当分别以单体和PFF注射小鼠对侧半球百分比标准化时，TH+细胞计数无变化（未配对学生t检验，第页 = 0.0874，N=11个单体，9个PFF）。D类单体和PFF注射小鼠6个月后TH DAB IHC的代表性图像。E类与对侧相比，注射PFF的小鼠同侧半球TH+细胞显著减少，单体无变化（双向方差分析，F半球的主要作用_(1,42) = 26.765,第页 = 0.0128; 对侧与同侧：PFF，Sidak的多重比较第页 = 0.0134，N=12单体，11 PFF）。F类当标准化为对侧半球的百分比时，与单体注射小鼠相比，PFF注射小鼠的TH+细胞显著减少（未配对的Student t检验，第页 = 0.0328). 比例尺为200µm

图4
PFF引起线粒体蛋白水平的改变。一单体和PFF注射小鼠3个月p.i.的均质皮质样品中线粒体蛋白VDAC1、COX-IV、Tomm-20和Ndusf4的代表性western blot图像。B类与注射PFF的小鼠同侧半球相比，对侧VDAC1水平增加（双向方差分析，PFF的主要作用，F_(1,28) = 6.355; 同侧与对侧：PFF，Sidak的多重比较第页 = 0.0424; N=8个单体，8个PFF），在单体和PFF注射小鼠之间比较对侧半球时保持不变（单体vs PFF：对侧，Sidak的多重比较第页 = 0.112).C类COX-IV水平显示PFF注射的主要影响（双向方差分析主要PFF影响，F_(1,28) = 7.425,第页 = 0.0110). 未检测到Tomm-20水平的变化(D类)或Ndusf4(E类)通过双向方差分析或多重比较。F类单体和PFF注射小鼠6个月后的线粒体膜蛋白VDAC1、COX-IV、Tomm-20和Ndusf4的典型western blot图像。**G公司**VDAC1等级无变化。**H（H）**与单体相比，同侧PFF注射小鼠的COX-IV水平增加（双向方差分析，Sidak的多重比较第页 = 0.0299，N=9单体，9 PFF）。Tomm-20中未检测到任何变化(我)或Ndusf4(J型)级别。GAPDH被用作加载/标准化控制

图5
PFF种子病理学对线粒体动力学相关蛋白皮质水平的影响。一单体和PFF注射小鼠3个月p.i.的线粒体融合和裂变蛋白DRP1、OPA1、FIS1和MIRO1的代表性western blot图像。B类在DRP1水平上观察到PFF注射的主要影响（双向方差分析，F_(1,28) = 7.005,第页 = 0.0132，N=8单体，8 PFF）。未检测到OPA1水平的变化**（C）**，第一次(D类)，或MIRO1(E类).F类单体和PFF注射小鼠6个月p.i.线粒体融合和裂变蛋白DRP1、OPA1、FIS1和MIRO1的典型western blot图像。**G–J**单体或PFF注射小鼠6个月p.i.（N=9单体，9PFF）的线粒体蛋白皮质水平没有变化。GAPDH被用作加载/标准化控制

图6
PFF诱导TH+神经元丢失与皮质线粒体蛋白水平的相关性分析。一体视学测定的SNc TH+神经元数量与术后3个月同侧（左）和对侧（右）皮层线粒体蛋白VDAC1水平的比较。简单线性回归分析显示TH+神经元的显著相关性PFF注射小鼠对侧半球神经元数量和皮层VDAC1水平。**B、 C类**在同侧或对侧半球，COX-IV或DRP1皮质蛋白水平和SNc-TH+细胞数量均未观察到相关性。D类在p.i.6个月时，虽然皮层COX-IV和SNc TH+细胞数量之间没有显著相关性，但对侧半球（右侧）的相关性明显较弱

图7
PFF注射小鼠纹状体线粒体呼吸链复合体活性改变。线粒体呼吸链复合物I和复合物IV的活性，以及柠檬酸合成酶活性，在每次3个月时测量(**A–C**)和每次6个月(**D、 E类**). 每次3个月时未发现显著差异(**A–C**).D类在p.i.6个月时，与单体相比，PFF注射动物对侧半球的复合物i活性显著增加（双向方差分析，PFF的主要作用，F_(1,32) = 14.72,第页 = 0.0006; 单体vs PFF：对侧，Sidak多重比较试验，第页 = 0.0018，N=9单体，9 PFF）。**E、 F类**在术后6个月，复合物IV或柠檬酸合成酶活性没有显著差异

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1. Abdelmotilib H、Maltbie T、Delic V、Liu Z、Hu X、Fraser KB、Moehle MS、Stoyka L、Anabtawi N、Krendelchtchikova V等。α-同核蛋白纤维诱导的大鼠和小鼠包涵体扩散与多巴胺能神经变性相关。神经生物学疾病。2017;105:84–98. doi:10.1016/j.nbd.2017.05.014。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Ahn TB、Kim SY、Kim JY、Park SS、Lee DS、Min HJ、Kim YK、Kim SE、Kim JM和Kim HJ等。α-突触核蛋白基因重复存在于散发性帕金森病中。神经病学。2008;70:43–49. doi:10.1212/01.wnl.0000271080.53272.c7。-内政部-公共医学
1. Bantle CM、Hirst WD、Weihofen A、Shlevkov E.星形胶质细胞线粒体功能障碍：在帕金森病中的作用？前细胞发育生物学。2020;8:608026. doi:10.3389/fcell.2020.608026。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Becker JB、Adams F、Robinson TE。脑室内微透析：一种测定自由运动大鼠脑脊液中单胺代谢物浓度的新方法。神经科学方法杂志。1988;24:259–269. doi:10.1016/0165-0270（88）90171-9。-内政部-公共医学
1. Blesa J、Juri C、Garcia-Cabezas MA、Adanez R、Sanchez-Gonzalez MA、Cavada C、Obeso JA。黑质纹状体多巴胺能损伤的化学层间不对称性：帕金森病的一种可能代偿机制。前系统神经科学。2011;5:92. doi:10.3389/fnsys.2011.00092。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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