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.2021年7月1日；24(7):102807.
doi:10.1016/j.isci.2021102807。 eCollection 2021年7月23日。

肿瘤细胞株中tankyrase抑制剂治疗反应特征的鉴定

Mygland线 1 2, Shoshy Alam Brinch公司 1 2, 马丁·弗兰克·斯特兰德 三, 彼得·安杰尔·奥尔森 1 2, 阿列克桑德拉·艾森施塔特 2, 卡贾·隆德 1, 尼娜·特蕾丝·索尔伯格 1, 马克斯·莱克 1, 托尔·埃斯彭·托瓦尔森 4, 桑德拉·埃斯帕达 1 2, 多尔娜·米萨基安 1, Christian M页面 5 6, 奥列格·阿加福诺夫 7, 圣勒尼格德 8, 奈文赤 9, 林伊娃 10, 詹妮尔·谭 10, Yihong余 10, 迈克·科斯塔 10, 斯特凡·克劳斯 1 2, 乔·瓦勒 1 2
附属公司

肿瘤细胞株中tankyrase抑制剂治疗反应特征的鉴定

Mygland线等。 i科学. .

摘要

小分子坦克酶1和坦克酶2（TNKS1/2）抑制剂在选定的肿瘤细胞系和小鼠模型中是有效的抗肿瘤药物。在这里，我们描述了tankyrase抑制（TNKSi）的反应特征和抗增殖作用的深入机制。使用TNKS1/2特异性抑制剂G007-LK筛选537人肿瘤细胞株，并鉴定出一组对TNKSi特别敏感的肿瘤细胞株。转录组、蛋白质组和生物信息学分析揭示了选定小组中TNKSi诱导的总体反应特征。TNKSi介导的对无翼型乳腺癌病毒整合位点/β-catenin、yes-associated protein 1（YAP）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶/AKT信号的抑制被证实，并与关键癌基因MYC的表达缺失和细胞生长受损相关。此外，我们发现TNKSi诱导含有TNKS1/2的β-在YAP信号衰减过程中，连环蛋白降解体作为核心复合物与YAP和血管运动蛋白相互作用。这些发现为TNKSi在抗癌治疗中的应用提供了一个背景和机制框架，需要进一步进行全面的临床前和临床评估。

关键词：癌症；蛋白质组学；转录组学。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
增殖筛选确定对选择性tankyrase抑制剂G007-LK的生长抑制敏感的人类肿瘤细胞系。（A）增殖/活性筛选：NCI-60和Genentech肿瘤细胞系分别用G007-LK处理48和72小时。GI的数量（表）和百分比（图）25数值命中（浓度<1μM G007-LK时25%的细胞生长抑制）与从各种组织建立的肿瘤细胞系总数（仅显示由≥14个细胞系代表的组织）。（B） 选择肿瘤细胞系进行进一步分析（GI50<200 nM G007-LK时的值[50%细胞生长抑制]，浅蓝色），包括COLO 320DM细胞（Lau等人，2013），并与RKO对照细胞（蓝色）进行比较。（C） 使用终点MTS增殖试验（Abs）重新筛选492)相对于对照组（100%，0.01%二甲基亚砜）和实验时间0值（t0，设置为0%）。单向方差分析测试（Holm-Sidak方法与对照）用***表示（p<0.001），单向秩检验方差分析（Dunn方法与对照组）用†表示（p<0.05）。显示了至少两次重复分析的一个代表性实验的平均值±SD，每个重复分析有六个重复。（D） 终点MTS增殖试验GI 50值。（E） 与二甲基亚砜（0.01%）相比，G007-LK（1μM）处理7-11天后的相对菌落数（%）。显示了来自至少三个独立实验的组合数据的平均值±SD，每个实验有三个重复。对于E–G公司,我，和K（K），双尾t检验用***（p<0.001）、***（p<0.01）和*（p<0.05）表示，而Mann-Whitney秩和检验用（p<0.01）和†（p<0.05）来表示。（F） 细胞周期相对于对照组的变化（%）。G=间隙1相位，S=合成相位，G2/M=间隙2/有丝分裂期。显示了由至少四个独立实验组成的组合数据的平均值。对于F类和G公司经G007-LK（1μM）处理72小时后，与对照组相比（设置为0%，0.01%二甲基亚砜）。（G） 相对于对照组诱导细胞凋亡。显示了由至少三个独立实验组成的组合数据的平均值。（H） 细胞周期调控基因的RNA序列分析MYC公司和CCND1号机组（日志2，n=2）。对于H–J型用G007-LK（1μM）或对照（0.01%二甲基亚砜）处理24小时后。（一） 实时RT-qPCR分析MYC公司和CCND1号机组显示了来自至少两个独立实验和测量（每个实验有三个重复）的组合数据的平均值±SD。（J） 核MYC和CCND1的免疫印迹使用层粘连蛋白B1记录蛋白质负荷，而#表示相同的层粘连B1免疫印迹用作MYC与CCND1负荷控制。显示了两个或多个独立实验的代表性数据。（K） 终点MTS增殖试验（Abs492)相对于对照组（100%）和实验时间0值（t0，设置为0%），转染siRNA后5天MYC公司和EGFP公司（控制）。显示了代表至少两个独立分析的一个实验的平均值±SD。另请参见表S1和图S1。
图2
图2
基因表达分析表明，TNKSi可减弱MYC和WNT/β-catenin、YAP和PI3K/AKT信号通路（A），主成分分析图显示基因表达多样性。对于一–C类与对照组（0.01%DMSO，n=2）相比，G007-LK处理24小时的选定人类肿瘤细胞株面板的mRNA测序数据。（B） 火山图显示G007-LK处理对基因表达的影响。根据对数绘制转换后的NOISeq概率值（-log10[1-概率]）2折叠变化。概率值大于0.8的基因以红色突出显示。（C）对数热图2一个或多个细胞系中差异表达基因的折叠变化。（D） 基于识别的差异表达基因预测上游信号通路蛋白调节器（IPA核心分析）B类并使用维恩分析进行分类。阈值：概率值>0.8，重叠p值<1×10−8和绝对激活Z得分>0.5或<-0.5。识别的关键信号通路蛋白以红色突出显示。（E）预测主要下调的信号通路。另请参见表S2–S4和图S2。
图3
图3
G007-LK抑制依赖β-连环蛋白维持细胞生长的肿瘤细胞系亚群中的WNT/β-连环蛋白信号传导（a）终点MTS增殖测定（Abs492)相对于对照组（100%）和实验时间0值（t0，设置为0%）。显示了代表至少两个独立分析的一个实验的平均值±SD。对于一–C类，转染siRNA后5-8天CTNNB1公司和EGFP公司（控制）。对于一–C类,E类,F、，和H（H），双尾t检验，如***（p<0.01）、***（p<0.01）和*（p<0.05）所示，而Mann-Whitney秩和检验用†表示（p<0.05）。（B） 细胞周期变化（%）相对于对照（设置为0%）。显示了由至少四个独立实验组成的组合数据的平均值。（C） 相对于对照组（设为0%），诱导凋亡（%）。显示了由至少三个独立实验组成的组合数据的平均值。（D） 与对照组（0.01%二甲基亚砜）相比，G007-LK（1μM）治疗24或72小时后，细胞质TNKS1/2、AXIN1和AXIN2（上面板）的免疫印迹，以及β-连环蛋白的核活性形式（非磷酸[Ser33/37/Thr41]）和总β-连环素（下面板）。肌动蛋白（细胞质）和层粘连蛋白B1（核）记录蛋白质负荷。显示了两个或多个独立实验的代表性数据。（E） 基于荧光素酶的报告分析，用于比较基线WNT/β-catenin信号活性。将这些细胞与superTOPflash（具有7个TCF启动子结合位点驱动萤火虫荧光素酶的载体）或FOPflash（具有突变TCF结合位点的对照载体）以及雷尼利亚荧光素酶（用于正常化）。所有样本都与RKO电池的归一化超TOP闪光信号有关（=1）。显示了2-4个独立实验（每个实验有三个重复）的组合数据的平均值±SD。显示了SuperTOPflash和FOPblash活动之间的统计显著差异（TOP/FOP比率）。（F） 集成电路50和IC25基于荧光素酶的WNT/β-catenin信号报告分析的数值（nM）（用SuperTOPflash和雷尼利亚荧光素酶）暴露于不同浓度的G007-LK 72小时。（G） WNT/β-catenin信号靶基因转录（RNA测序，log2)与对照组（0.01%二甲基亚砜）相比，G007-LK（1μM）处理24小时后（n=2）。NA=不可用，无RNA检测。（H） 实时RT-qPCR分析AXIN2型G007-LK处理24小时后（1μM），相对于对照组（0.01%二甲基亚砜）。显示了两个独立实验的组合数据的平均值±SD，每个实验有三个重复。另请参见图4、S3和S4。
图4
图4
G007-LK治疗对肿瘤细胞系中β-catenin和TNKS1/2定位的影响所示细胞系的载体对照（0.01%DMSO）和G007-LK（1μM）治疗（24 h）的免疫荧光染色、β-catentin（品红色）和TNKS1/2（绿色）的典型共聚焦图像以及核DAPI染色（蓝色）。箭头表示包含点的TNKS1/2示例。比例尺=10μm。另请参见图3和S3。
图5
图5
G007-LK抑制所选细胞系面板中的YAP信号，所有细胞系依赖YAP进行持续增殖（A）终点MTS增殖试验（Abs492)转染siRNA后5-8天YAP公司相对于对照组（100%，EGFP公司)和实验时间0值（t0, 0%). 显示了至少三次重复测定的一个代表性实验的平均值±SD，每个重复测定六次。对于一和D类，双尾t检验用∗表示（p<0.01），Mann-Whitney秩和检验用表示（p<0.01）和†表示（p<0.05）。（B） 与对照组（0.01%二甲基亚砜）相比，G007-LK（1μM）处理24或72小时后细胞质AMOT、AMOTL1和AMOTL2（上面板）以及核YAP和TAZ（下面板）的免疫印迹。肌动蛋白和层粘连蛋白B1记录了两个或多个独立实验的蛋白质负荷和代表性数据。（C） YAP信号靶基因转录（log2)与对照组（0.01%二甲基亚砜）相比，G007-LK（1μM）处理24小时后（n=2）。NA=不可用，无RNA检测。（D） YAP信号靶基因的实时RT-qPCR分析，CCN1型,CCN2，和AMOTL2型G007-LK处理24小时后（1μM），相对于对照组（0.01%二甲基亚砜）。显示了来自至少两个独立实验的组合数据的平均值±SD，每个实验有三个重复。另请参见图6、S5和S6。
图6
图6
G007-LK处理对YAP、TNKS1/2和AMOTL2在肿瘤细胞系中定位的影响免疫荧光染色和YAP（红色）和TNKS1/2（绿色）、YAP（红色）和AMOTL2（绿色）或AMOTL2（红色）和TNKS1/2（绿色）的代表性共聚焦图像，以及载体对照（0.01%二甲基亚砜）上的核DAPI染色（蓝色）以及G007-LK（1μM）处理所示细胞系（24小时）。红色，使用了抗鼠抗体。绿色，使用了抗兔抗体。箭头表示同位化。比例尺=20μm。另请参见图5、S5和S6。
图7
图7
G007-LK抑制ABC-1细胞中依赖PI3K/AKT信号传导以实现持续细胞生长（A）FOXO诱导的信号靶基因转录（RNA测序，log2)与对照组（0.01%二甲基亚砜）相比，G007-LK（1μM）处理24小时后（n=2）。*描述了FOXO激活的靶基因，而FOXO活化的基因是非表观的。NA=不可用，无RNA检测。（B） 与对照组（0.01%二甲基亚砜）相比，用G007-LK（1μM）处理24或72小时后，ABC-1细胞中细胞质活性AKT（磷酸化[Ser473]和磷酸化[Thr308]）、总AKT和PTEN的免疫印迹。肌动蛋白记录蛋白质负荷。显示了两个或多个独立实验的代表性数据。（C） 左侧面板，终点MTS增殖试验（Abs492相对于对照组[100%，0.01%DMSO]和实验时间0值[t0, 0%]). 右侧面板，AKT（磷酸化[Ser473]）和总AKT的细胞质激活形式的代表性免疫印迹。在ABC-1细胞中使用指定浓度的BKM120（PI3K抑制剂）和API-2（AKT抑制剂）治疗8天（MTS分析）或24小时（免疫印迹）。单向方差分析测试（Holm-Sidak方法与对照）用**表示（p<0.01）和*表示（p<0.05）。对于MTS数据，显示了一个代表性实验的平均值±SD，该实验至少有两次重复分析，每次重复五次。（D） TNKSi诱导的信号通路减少和信号通路对持续细胞生长的依赖性概述。另请参见图S7。
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