跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2021年3月24日；11(12):5650-5674.
doi:10.7150/thno.55482。 eCollection 2021年。

内源性谷氨酸通过ADCY10-依赖性YAP抑制确定肺腺癌对铁下垂的敏感性

小张 1 2, 柯克·余 三, 马丽芳 1 2, 钱子君 4, 田晓婷 2, 苗雅友 2, 牛永杰 4, Xin Xu（新旭） 4, 郭素素（Susu Guo） 5, 杨月月 5, 王志贤 4, 薛向飞 5, 顾传家 6 7, 方文涛 1, 孙嘉元 6 7, 于永春 2, 王佳怡 1 2 5
附属公司

内源性谷氨酸通过ADCY10-依赖性YAP抑制确定肺腺癌对铁下垂的敏感性

小张等。 治疗诊断科技. .

摘要

理论基础：铁下垂是一种新发现的调节性细胞死亡形式，可在胱氨酸-谷氨酸反转运系统X受到抑制后诱导C类-因为胱氨酸的摄取受损。然而，肺腺癌（LUAD）内源性谷氨酸积累后的结果尚未确定。Yes-associated protein（YAP）由己糖胺生物合成途径（HBP）依赖的O-连接β-N-乙酰葡萄糖胺基化（O-GlcNAcylation）维持，HBP的速率限制酶谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶（GFPT1）可被腺苷酸环化酶（ADCY）磷酸化和抑制-蛋白激酶A（PKA）的介导激活。然而，内源性谷氨酸积累是否通过影响LUAD细胞中的ADCY/PKA/HBP/YAP轴来决定铁下垂敏感性尚不清楚。方法：测量细胞活力、细胞死亡和脂质活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的生成，以评估X系统抑制后对诱导铁下垂的反应C类-采用串联质量标记（TMTs）研究LUAD细胞铁凋亡敏感性的潜在关键因素。免疫印迹（IB）和定量RT-PCR（qPCR）分析蛋白质和mRNA表达。共免疫沉淀（Co-IP）分析用于识别蛋白质相互作用和翻译后修饰。使用适当的试剂盒测量代谢物水平。使用荧光素酶报告分析、染色质免疫沉淀（ChIP）和电泳迁移率变化分析（EMSA）评估转录调控。使用细胞衍生异种移植（CDX）和患者衍生异种移植物（PDX）小鼠模型进行药物给药和限制稀释细胞移植。临床结果、药物疗效和ADCY10表达之间的相关性是根据接受治疗性手术的患者的数据确定的，并使用患者来源的原发性LUAD细胞和组织进行评估。结果：系统X后内源性谷氨酸的积累C类-抑制已被证明通过抑制LUAD细胞中的YAP来确定铁下垂敏感性。GFPT1受损后，LUAD细胞中的YAP O-GlcN酰化和表达无法维持。因此，YAP的河马路径样磷酸化和泛素化增强。ADCY10作为关键下游靶点，并使谷氨酸对PKA依赖性GFPT1抑制的作用多样化。我们还发现，ADCY10的促肿瘤和促铁蛋白降解作用是分别介导的。ADCY10高表达的晚期LUAD对铁凋亡敏感。此外，具有获得性抗药性的LUAD细胞也倾向于ADCY10的高表达，并且更有可能对铁下垂作出反应。最后，由于在后期无法维持YAP刺激的铁蛋白转录补偿，导致了不同程度的次级不稳定铁增加，这进一步解释了为什么LUAD细胞对铁凋亡的敏感性不同。结论：内源性谷氨酸对X系统抑制后的脱铁敏感性至关重要C类-对于晚期和/或耐药肿瘤的LUAD患者来说，以铁下垂为基础的治疗是一个很好的选择。

关键词：铁蛋白；GFPT1；HBP依赖性O-GlcNA酰化；河马通路；NCOA4；XBP1拼接。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
抑制YAP水平有助于LUAD细胞对铁凋亡的敏感性。（A-B）用含有或不含有Fer-1（1µM）或DFO（80µM。（C）在与A组相同的处理条件下，用相控显微镜监测LUAD细胞12小时的细胞形态。（D）使用或不使用橡皮素（10µM）处理12 h后LUAD细胞的典型TEM图像。比例尺，500 nm。（E-F）通过测量C11BODIPY染色、流式细胞术（E）和MDA检测试剂盒（F）检测LUAD细胞在与A组相同的治疗条件下16 h的脂质ROS和MDA生成。（G）在用或不用橡皮素（10µM）处理24小时后，在LUAD细胞中测量相对不稳定铁。（h-I）热图显示了用橡皮酶（10μM）处理24h后H1975细胞中排名前五位的上调和下调蛋白质（TMT测量）。火山图也用于显示改变的蛋白质（I）。（J）用二甲基亚砜或橡皮素（10µM）处理LUAD细胞24小时后的YAP IB。YAP的水平归一化为GAPDH的水平，DMSO处理A549细胞中YAP的归一化水平任意设置为1。（K）在橡皮素（10µM）处理24 h后，诱导细胞死亡与残留YAP水平之间的相关性。诱导细胞死亡和残留YAP浓度计算为DMSO处理的倍数或百分比。（长-米）细胞死亡（L）和MDA（M）在重量,βTrCP-/-和蓝色1-/-用含有或不含Fer-1（1μM）或DFO（80μM）的橡皮素（10μM）处理24小时后的H1975细胞。数据显示为三个生物复制品（包括IB）的平均值±SD**P＜0.01表示有统计学意义。使用双向方差分析测试分析A、B、E、F、G、J、L、M的数据。H和I的数据采用Student t检验进行分析。使用Spearman秩相关分析对K中的数据进行分析。
图2
图2
内源性谷氨酸的积累通过降低YAP O-GlcNAcylization来决定铁下垂敏感性。（A）谷氨酸吸收和代谢示意图。（B）GGG细胞结构示意图。（C）在有或无EGCG（5µM）的情况下，使用或不使用Dox（1µg/ml）处理24小时后，在GGG细胞中测量细胞内谷氨酸。（D-E）内源性谷氨酸有助于铁下垂敏感性。GGG细胞在用含有或不含Fer-1（1µM）或DFO（80µM。通过SYTOX绿色染色，然后通过流式细胞术测量处理24小时后的细胞死亡（D）。治疗16 h（E）后测量相对MDA。（F）内源性谷氨酸调节YAP的磷酸化和O-GlcNA酰化。用IB在H1975-based GGG细胞中测量S127处YAP的磷酸化、T241处YAP O-GlcNAcylation和总YAP，处理方式与面板D相同，但用橡皮素处理8h。蛋白质水平归一化为GAPDH的水平，DMSO处理细胞中蛋白质的归一化水平任意设置为1。（G）Thr241是YAP的主要O-GlcNA酰化位点，由内源性谷氨酸调节。将外源性YAP-FLAG（WT或T241A）转染到H1975-based GGG细胞中，然后以与面板D相同的方式处理，但用橡皮素处理8小时。使用抗FLAG抗体进行YAP-FLAG的免疫沉淀，并使用抗O-GlcNAc抗体通过IB测量YAP-O-GlcNA酰化。将蛋白质的水平标准化为FLAG的水平，并且将DMSO处理的细胞中的蛋白质的标准化水平任意设置为1。（H-J）内源性谷氨酸对YAP的修饰和调节至关重要。相对O-YAPT241型（H） 、总YAP水平（I）和p-YAP第127节（J） 用IB测量，并计算用橡皮素（10µM）和二甲基亚砜处理的GGG细胞与面板F中处理方法相同的细胞之间的差异。（K-L）YAP的Thr241 O-GlcNA酰化对铁凋亡敏感性至关重要。测定小鼠血清YAP水平（K）、细胞死亡、脂质ROS和MDA生成量（L）YAP公司-/-YAP重组H1975细胞重量或YAPT241A型在用含有或不含有Fer-1（1µM）或DFO（80µM。分别于治疗8h、24h和16h后测定YAP水平、细胞死亡、脂质ROS和MDA生成。数据显示为三个生物复制品（包括IB）的平均值±SD**P<0.01表示有统计学意义。使用双向方差分析测试分析C、D、E、H、I、J的数据。L中的数据采用单向方差分析测试进行分析。
图3
图3
GFPT1对内源性谷氨酸对测定铁下垂敏感性至关重要。（A）从葡萄糖到O-GlcNA酰化的HBP信号的示意图概述。（B）内源性谷氨酸影响HBP代谢物。在与图2D相同的处理下，在基于H1975的GGG细胞中测量指示代谢物。（C）在与图2D相同的处理条件下，测量GGG细胞中的相对GFPT1活性，但用或不用橡皮素（10µM）处理8小时。用橡皮素和DMSO处理的细胞之间的GFPT1活动标准化。（D）GFPT1下游的代谢物通过橡皮素恢复YAP的改变。p-YAP（对-YAP）第127节、O-YAP第241页用IB测定用或不用橡皮素（10µM）、葡萄糖（25 mM）、GlcN（5 mM）或GlcNAc（5 mM）处理8 h的H1975细胞的YAP。（E-F）GlcN和GlcNAc降低了铁下垂敏感性。在存在或不存在GlcN（5mM）或GlcNAc（5mM）的情况下，用erastin（10µM）处理LUAD细胞，加入或不加入Fer-1（1µM）或DFO（80µM）。在治疗24小时（E）后测量细胞死亡。在处理16小时后测量MDA（F）。（G）GFPT1型S205A型通过擦除恢复YAP更改。GFPT1标记S205A型在使用或不使用橡皮素（10µM）处理8 h之前，在H1975细胞中体外表达。用IB分析指示蛋白。（H）GFPT1增强YAP的蛋白质稳定性。在有或无GFPT1过度表达或敲除的H1975细胞中进行CHX（10µg/ml）追踪实验。YAP的相对蛋白水平显示为YAP和GAPDH的比值，“0 h”点任意设置为100%。（一）GFPT1减少YAP的泛素化。在使用抗YAP抗体进行免疫沉淀后，使用抗Ub抗体在GFPT1过度表达或敲除的对照细胞和H1975细胞中测量YAP的泛素化。IgG抗体用作阴性对照。（J-K）GFPT1的恢复降低了细胞凋亡的敏感性。GFPT1标记S205A型在用含有或不含有Fer-1（1µM）或DFO（80µM。用SYTOX绿染色和流式细胞术（J）检测治疗24 h后细胞死亡情况。治疗16h（K）后测定MDA。数据显示为三个生物复制品（包括IB）的平均值±SD**P<0.01表示有统计学意义。B组数据采用单因素方差分析进行分析。使用双向方差分析测试分析C、E、F、J、K的数据。
图4
图4
LUAD细胞中无效的XBP1剪接促进了谷氨酸对GFPT1的抑制。（A）用二甲基亚砜或橡皮素（10µM）处理LUAD细胞8小时后，GFPT1的IB值。GFPT1水平归一化为GAPDH水平，DMSO处理A549细胞中GFPT1归一化水平任意设置为1。（B）橡皮素对GFPT1活性的降低与GFPT1的表达密切相关，计算为与DMSO处理8h的GFPT1表达的百分比。（C）使用IB和GDH分析方法分析GFPT1的表达和活性重量和GFPT1型-/-A549和H1975细胞。（D）拼接或未拼接形式的XBP1型通过琼脂糖凝胶电泳通过半RT-qPCR测量的LUAD样本中的mRNA。（E）显示的LUAD样本百分比XBP1型拼接条件。（F）无效的XBP1剪接有助于GFPT1降低。将具有或不具有异位表达XBP1的基于H1975的GGG细胞置于与图2D中相同的处理下，但用或不用erastin（10µM）处理8小时。将MDA-MB-231细胞作为平行对照处理。利用GDH分析法分析GFPT1的相对活性。使用正常凝胶或含有phostag™的凝胶，通过IB分析细胞核和胞质部分中的总GFPT1和磷酸化GFPT1。（G）在用橡皮素（10µM）处理8小时之前，在MDA-MB-231细胞中敲除XBP1。将H1975细胞作为平行对照。GFPT1活性、总GFPT1和磷酸化GFPT1的分析方法与图4F相同。（H）GFPT1在S205被erastin和Sorafenib磷酸化。使用含有phostag™的凝胶在H1975细胞中使用或不使用橡皮素（10μM）、索拉非尼（5μM）和RSL3（5µM）处理8小时后，通过IB分析所示GFPT1-FLAG的磷酸化。（一）S205处的磷酸化对GFPT1降解至关重要。在使用或不使用Dox和EGCG预处理24小时后，再使用橡皮素（10µM）进一步处理指定小时，用IB在H1975-based GGG细胞中测量所示GFPT1-FLAG的降解。GFPT1水平归一化为GAPDH水平。数据显示为三个生物重复（包括IB和半RT-qPCR）的平均值±SD**P<0.01表示有统计学意义。C、F、G组数据采用单因素方差分析。我的数据采用双向方差分析测试进行分析。B组数据采用Spearman秩相关分析进行分析。
图5
图5
ADCY10 PKA依赖性决定LUAD细胞的铁凋亡敏感性。（A）内源性谷氨酸通过PKA磷酸化GFPT1。基于H1975的GGG细胞在进一步使用或不使用橡皮素（10µM）之前，在存在或不存在H89（10μM）和Rp-cAMPs（200μM）的情况下，接受与图2C中相同的处理8小时。通过IB分析指示蛋白。（B）在与A组相同的处理下，用GDH法分析H1975基GGG细胞中GFPT1的活性。（C-F）PKA促进橡皮素诱导的铁下垂。用橡皮素（10µM）处理体外表达PKACα的A549和H1975细胞，在存在或不存在PKI（10μM）、Fer-1（1μM）或DFO（80μM）的情况下。在治疗24 h后分析细胞活力（C）和细胞死亡（D），并在治疗16 h后分析脂质ROS（E）和MDA生成（F）。（G）对90对LUAD及其邻近标本进行ADCY10水平分析。（H） 重量或ADCY10年-/-基于H1975的GGG细胞受到与图2D相同的处理，但使用或不使用橡皮素（10µM）处理8 h。使用GDH方法分析相对GFPT1活性，并使用IB分析ADCY10。蛋白质水平归一化为GAPDH的水平，DMSO处理细胞中蛋白质的标准化水平被任意设置为1。（I-K）在用橡皮素（10µM）进一步处理8 h之前，用或不用EGTA（0.1 mM）、Dox（1µg/ml）和EGCG（5µM2+（一） 然后测量cAMP浓度（J）和GFPT1活性（K）。（长-米）ADCY10的表达与erastin（10µM）处理8 h后GFPT1活性降低和诱导cAMP相关。GFPT1活力降低（L）和诱导cAMP（M）显示为DMSO处理对照的百分比，ADCY10通过IB在指示的LUAD细胞中测量。（N）不同ADCY10水平的LUAD组织切片的代表性显微照片，用erastin（10µM）加或不加Fer-1（1µM）处理24小时。通过IHC测量ADCY10水平。用PI（红色）和DAPI（蓝色）观察铁中毒细胞和细胞核。每个样本的PI阳性面积也计算为占整个截面的百分比，并在右侧绘制。比例尺，1 mm。（O）在与面板N中相同的样品中测量MDA浓度（N＝20/组）。数据显示为三个生物复制品（包括IB）的平均值±SD**P＜0.01表示有统计学意义。采用单因素方差分析对B、C、D、E、F、H、I、J、K、N、O的数据进行分析。G中的数据采用Student t检验进行分析。L、M的数据采用Spearman秩相关分析进行分析。
图6
图6
ADCY10表达较高的LUAD更容易发生铁凋亡。（A）接种指定天数后，监测H1975细胞形成的异种移植物体积，包括是否敲除ADCY10。从接种后第18天开始，每天给药一次DMSO或IKE（50 mg/kg），共14天。（n=5/组）。（B）接种后监测携带H1975细胞形成的异种移植物的小鼠存活情况，无论是否敲除ADCY10，每天给药一次DMSO或IKE（50 mg/kg），持续14天，从接种后第18天开始。（n=8/组）。（C）治疗性手术后ADCY10高表达（n=53）或低表达（n=33）的LUAD患者的生存率。（D）在第一、二和三期LUADs中测量ADCY10水平（n=20/组）。（E）在用增加浓度的橡皮素处理指定小时后，通过测量原代LUAD细胞中的细胞ATP来测定细胞活力。（F）在与E组相同的处理下，测量BEAS-2B或MRC-5细胞的细胞活力。（G）用IKE（50 mg/kg）加或不加Lipro-1（10 mg/kg）治疗后指定时间的PDX体积，每天一次，持续14天（n=8/组）。（H）用IKE（50 mg/kg）加或不加Lipro-1（10 mg/kg）治疗PDX荷瘤小鼠14天，每天一次后的存活率（n=8/组）。（一）小鼠胸膜内注射PLUADC-I/III细胞36天后肺切片的典型显微照片。蛋白质按指示染色。虚线分隔了原发肿瘤和正常肺。DAPI（蓝色）显示细胞核。图中间的箭头指向继发肿瘤。右图中的箭头指向ADCY10和CD31共同表达的促血管性肿瘤（n=8/组）。比例尺，500µm。（J-K）hVIM数量的量化+继发性肿瘤（J）与ADCY10+/CD31型+全肺检测到血管性肿瘤（K），与第一组相同（n=8/组）。（左）在IKE（50 mg/kg）加或不加Lipro-1（10 mg/kg）再给药14天之前，将PLUADC-III细胞注射24天的小鼠肺切片的代表性显微照片。（n=8/组）。比例尺，500µm。（M-N）形成hVIM的PLUADC-III数量的量化+继发性肿瘤（M）和ADCY10+/CD31型+促血管性肿瘤（N）接受与L组相同的治疗（N=8/组）。（O-P）在A549顺铂耐药（C雷斯)以及用或不用顺铂（10µM）、erastin（10µM）或Sorfenib（5µM）处理指定小时的亲代细胞。（问）通过IHC检测同一患者对伊可替尼耐药前后LUAD组织中ADCY10的表达。（R-S）在父母和AZD9291耐药（A雷斯)H1975和HCC827细胞用或不用AZD9291（10µM）、橡皮素（10μM）或索非尼（5µM。（T）ADCY10促进EMT。用IB法检测ADCY10敲除前后H1975和HCC827细胞的EMT指标。数据显示为三个生物复制品（包括IB）的平均值±SD*P<0.05，**P<0.01表示有统计学意义。采用单因素方差分析对D、J、K、M、N的数据进行分析。使用双向方差分析测试分析A、E、F、G、P、S的数据。B、C、H的数据采用对数秩分析进行分析。
图7
图7
YAP的还原通过FTH1升高铁来敏化铁下垂。（A）相对活性铁的测量单位为重量和βTrCP-/-使用或不使用橡皮素（10µM）处理24小时后的H1975细胞。（B）在与图2D相同的处理下，在GGG细胞中测量相对不稳定铁。用橡皮素和二甲基亚砜处理的人之间的活性铁被归一化。（C）p-YAP（对-YAP）第127节、O-YAPT241型用IB在用橡皮素（10µM）处理的H1975细胞中测量指定小时的总YAP。（D-F）用橡皮素（10µM）处理LUAD细胞数小时后，测量相对不稳定铁（D）、脂质ROS生成（E）和细胞死亡（F）。在擦除后处理10 h时添加DMSO或DFO（A549，2µM；H358，15µM，H1299，5µM。（G）在橡皮素（10µM）处理24小时后，诱导的细胞死亡和剩余FTH1水平之间的相关性。诱导的细胞死亡率和剩余FTH2水平计算为DMSO处理的倍数或百分比。（H）FTH1于年被击倒βTrCP-/-用含有或不含Fer-1（1µM）的橡皮素（10μM）处理H1975细胞24小时。使用SYTOX绿色染色法和流式细胞术测量细胞死亡。（I-J）在用橡皮素（10µM）进一步处理指定小时之前，用或不用Dox（1µg/ml）和EGCG（5µM）预处理24小时的H1975-based GGG细胞中的FTH1蛋白（I）和mRNA（J）。蛋白质水平被归一化为GAPDH的水平，经橡皮素处理的0 h细胞中蛋白质的归一化水平被任意设置为1（I）。（K）铁蛋白噬菌体增强YAP与英尺1英寸发起人。用橡皮素（10µM）处理有或没有NCOA4敲除的H1975细胞4小时英尺1英寸用ChIP-qPCR检测启动子。（长-米）动态YAP和TFCP2绑定到FTH1（飞行时间1）由橡皮素触发的启动子。重量或βTrCP-/-以H1975为基础的GGG细胞受到与第一组相同的处理FTH1（飞行时间1）在指定时间用ChIP-qPCR检测启动子。数据显示为三个生物复制品（包括IB）的平均值±SD*P<0.05，**P<0.01表示有统计学意义。A、H、K的数据通过单因素方差分析进行分析。使用双向方差分析测试分析B、J、L、M的数据。G组数据采用Spearman秩相关分析进行分析。
图8
图8
研究模型。在基础条件下，GFPT1维持YAP的O-GlcNA酰化，以防止YAP受到河马路径依赖性抑制，如βTrCP介导的泛素化。同时，FTH1的基础转录由TFCP2控制，以调节铁稳态。当系统XC类-被抑制，内源性谷氨酸积累，从而促进钙2+-ADCY10产生依赖性cAMP以刺激PKA相关的磷酸化和GFPT1的抑制。随后，YAP不可避免地受到抑制，并且在后期无法维持铁蛋白噬菌体触发的FTH1转录代偿。这也导致LUAD细胞中不稳定铁升高和铁下垂敏感性不同。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Dixon SJ、Lemberg KM、Lamprecht MR、Skouta R、Zaitsev EM、Gleason CE。等。铁下垂：非凋亡细胞死亡的一种铁依赖形式。单元格。2012;149:1060–72.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Stockwell BR、Friedmann Angeli JP、Bayir H、Bush AI、Conrad M、Dixon SJ等。《铁下垂：一种与代谢、氧化还原生物学和疾病相关的调节性细胞死亡联系》。单元格。2017;171:273–85.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kagan VE、Mao G、Qu F、Angeli JP、Doll S、Croix CS。等。氧化花生四烯酸和肾上腺素PE引导细胞发生铁下垂。自然化学生物。2017;13:81–90.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 高敏，莫尼安·P，Quadri N，Ramasamy R，Jiang X.谷氨酰胺水解和转铁蛋白调节铁下垂。分子细胞。2015;59:298–308.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Mai TT、Hamai A、Hienzsch A、Caneque T、Muller S、Wicinski J等人。盐霉素通过在溶酶体中隔离铁来杀死癌症干细胞。自然化学。2017;9:1025–33.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语