AMPK/ULK1-mediated phosphorylation of Parkin ACT domain mediates an early step in mitophagy

doi:10.1126/sciadv.abg4544

.2021年4月7日；7（15）：eabg4544。

doi:10.1126/sciadv.abg4544。打印日期：2021年4月。

AMPK/ULK1介导的Parkin ACT结构域磷酸化介导有丝分裂早期步骤

附属公司

¹美国加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所分子和细胞生物学实验室，邮编92037。
²美国加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所干细胞核心设施，邮编92037。
^三美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心质谱核心。
⁴美国加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所分子和细胞生物学实验室，邮编92037。shaw@salk.edu。

PMID： 33827825
预防性维修识别码：项目管理委员会8026119
内政部： 10.1126/sciadv.abg4544

AMPK/ULK1介导的Parkin ACT结构域磷酸化介导线粒体自噬的早期步骤

钱敏洪等。科技进步. 2021.

.2021年4月7日；7（15）：eabg4544。

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附属公司

¹美国加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所分子和细胞生物学实验室，邮编92037。
²美国加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所干细胞核心设施，邮编92037。
^三美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心质谱核心。
⁴美国加利福尼亚州拉霍亚市索尔克生物研究所分子和细胞生物学实验室，邮编92037。shaw@salk.edu。

PMID： 33827825
预防性维修识别码：项目管理委员会8026119
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摘要

丝氨酸/苏氨酸激酶ULK1介导自噬的启动，以应对各种细胞应激，ULK1的基因缺失导致受损线粒体的积累。这里我们确定Parkin（线粒体吞噬中的核心泛素连接酶）和家族性帕金森病中突变的PARK2基因产物作为ULK1底物。最近的研究发现了一个对Parkin激活很重要的九残基（“ACT”）结构域，我们证明AMPK依赖性ULK1在响应线粒体应激时迅速磷酸化ACT结构域中的保守丝氨酸108。与30至60分钟后观察到的PINK1和TBK1的激活不同，Parkin Ser108的磷酸化在线粒体损伤后5分钟内发生最大。Parkin中ULK1磷酸化位点的突变、基因AMPK或ULK1缺失或药物ULK1抑制，都会导致Parkin激活延迟，Parkin功能和下游有丝分裂事件的分析出现缺陷。这些发现揭示了有丝分裂级联反应中一个意想不到的第一步。

PubMed免责声明

数字

**图1。Parkin Ser公司¹⁰⁸由AMPK/ULK1信号调节。**
(一)在人类胚胎肾（HEK）293T细胞中与myc标记的野生型（WT）或激酶激活型（KI）ULK1共同转染Parkin的免疫印迹。(B类)免疫印迹如（A）所示，但在此，如图所示，用lambda-phosphatase（PPase）处理细胞裂解物。(C类)Parkin Ser公司¹⁰⁸和Ser¹¹⁰与已知的ULK1磷酸化位点对齐。突出显示符合最佳ULK1基底图案的残留物。(D类)Parkin Ser周围进化保护的ClustalW排列¹⁰⁸. (E类)指示Parkin和ULK1 cDNA的免疫印迹共转染到HEK293T细胞。通过Parkin迁移率转移监测磷酸化。(F类和**G公司**)如（E）所示，但用Parkin phospho-ser监测¹⁰⁸抗体。(**H（H）**)转染Parkin的细胞的免疫印迹，并用载体（D）、20μM CCCP（C）、10μM 991、10μM 6965 ULK1抑制剂（65）或6965与CCCP或991（65/C:65/991）联合处理1小时。(我)用载体或AMPK激活剂MK8722处理2小时的AMPKa1/a2（AMPK DKO）小鼠的对照或诱导敲除小鼠肝裂解物的免疫印迹。有关详细信息，请参见材料和方法。(J型)免疫印迹如（I）所示，但控制或诱导Ulk1/Ulk2的KO。(**K（K）**)使用赋形剂或二甲双胍治疗1小时的WT或AMPK肝DKO小鼠的原代小鼠肝细胞裂解物的免疫印迹。

**图2。Parkin Ser公司¹⁰⁸磷酸化在AO和CCCP后迅速诱导，并先于PINK1和TBK1的激活。**
(一)整体Parkin结构域结构示意图，插入人类Parkin残基59至115的ClustalW排列。PINK1位点Ser的进化保护⁶⁵和ULK1站点Ser¹⁰⁸在Parkin中，脊椎动物之间的关系显示为红色¹⁰⁸是最近描述的ACT元件中仅有的两个完全保守的丝氨酸之一(7)参与Parkin活化（残基101至110）。右侧是Ser的结构模型¹⁰⁸在ACT元素中，以红色显示，Arg¹⁰⁴绿色所示为家族性帕金森病患者（R104W）的突变。(B类)稳定表达YFP-Parkin的HEK293T细胞的免疫印迹经过AO（2.5μM抗霉素A和5μM寡霉素）处理，处理时间为指定时间。(C类)对稳定表达YFP-Parkin的HEK293T细胞的免疫印迹进行10μM CCCP处理，处理时间为指定时间。

**图3。Parkin在Ser被磷酸化¹⁰⁸在细胞溶质中及其及时转移到线粒体需要Ser¹⁰⁸-序号¹¹⁰.**
(一)用20μM CCCP处理指定时间后，通过细胞膜破坏和差速离心从表达HEK293T细胞的YFP-Parkin-WT和YFP-Parkin-SA3的细胞质和线粒体提取物中分离的免疫印迹。分析每条通道的细胞质蛋白（30μg）和线粒体蛋白（20μg）。(B类)瞬时转染YFP-Parkin或YFP-Parkin-SA3或YFP-Parkin-R104W的HEK293T细胞的免疫印迹，然后用20μM CCCP处理指定时间。添加MG132（10μM）以防止蛋白酶体介导的降解。(C类)通过免疫荧光定量Parkin线粒体易位表型。中图像中的单个单元格(D类)通过ImageJ软件进行人相关系数（PCC）分析。数据显示在小提琴图中。n个=19，适用于YFP Parkin WT；n个YFP-Parkin-SA3=24***P（P）*< 0.01, *****P（P）*通过双向方差分析（ANOVA）得出<0.0001。（D）用二甲基亚砜（DMSO）或CCCP（20μM）处理150分钟后，稳定表达WT或SA3 YFP-Parkin的U2OS细胞的时间跨度活细胞图像。YFP-Parkin显示为绿色，线粒体用MitoTracker染色（红色）。带有易位YFP-Parkin的成簇线粒体用白色箭头表示。比例尺，20μm。

**图4。CCCP后AMPK/ULK1信号控制Parkin和下游有丝分裂效应器向线粒体的募集。**
(一)稳定表达WT或SA3 YFP-Parkin的HEK293T细胞线粒体经20μM CCCP处理指定时间后的Mito-tag纯化线粒体免疫印迹。所有细胞也用10μM MG132处理4小时。(B类)NDP52（白色）和Tom20（红色）在稳定表达WT或SA3 YFP-Parkin的HeLa细胞中的代表性免疫细胞化学。用DMSO或CCCP处理细胞4小时。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（蓝色）染色。用ImageJ分析NDP52点刺数和点刺大小，每种情况各10张图像。数据显示为平均值±SEM***P（P）*< 0.001; *****P（P）*通过双向方差分析，<0.0001。比例尺，20μm。不另作说明，不重要。(C类)在CCCP处理指定时间之前，用DMSO或10μM 6965处理15分钟的WT YFP Parkin表达细胞的Mito-tag纯化线粒体的免疫印迹。用MG132处理的细胞如（A）所示。(D类)如图所示，经50μM 991或10μM 6965预处理的CCCP±15 min处理的WT-YFP-Parkin表达细胞的细胞裂解物的免疫印迹。(E类)稳定表达WT或SA3 YFP-Parkin的细胞纯化线粒体的免疫印迹，用CCCP±50μM 991处理1小时。所有细胞也用10μM MG132处理1小时。(F类)对照组或CRISPR介导的AMPK KO细胞经20μM CCCP处理指定时间后的上清液（顶部）和纯化线粒体（底部）的免疫印迹。用MG132处理的细胞如（A）所示。

**图5。最大Parkin活性需要依赖于ULK1的Parkin磷酸化。**
(一)转染YFP-Parkin-C431S或YFP-Pargin-C431S/SA3的HEK293T细胞的免疫印迹。转染后2h，用CCCP（20μM）、缬霉素（5μM）和AO（2.5μM抗霉素A+5μM寡霉素）或载体（DMSO）处理细胞2h。红色箭头表示分子量较高的帕金-泛素硫酯物种。(B类)YFP-Parkin-C431S–表达HEK293T细胞，按（A）±SBI-0206965（10μM）处理2小时。(C类)帕金介导的HEK293T细胞有丝分裂活性的功能分析。图中显示了流式细胞术定量的有丝分裂阳性细胞群。数据显示为两个独立实验的平均值±SEM**P（P）*通过双向方差分析，分别在2小时或4小时时与对照细胞相比，<0.05。(D类)对经AO处理指定时间或60分钟（10或50μM 6965预处理）的人胚胎干细胞源性诱导神经元内源性Parkin进行免疫印迹分析。(E类)驻车激活模型。CCCP处理导致AMP和mtROS迅速增加，这两种物质在几分钟内激活AMPK磷酸化并激活ULK1。ULK1反过来在Ser最大程度地磷酸化Parkin¹⁰⁸在CCCP处理的2分钟内在细胞质中。同时，通过检测泛素和Parkin Ser的磷酸化，PINK1在CCCP后逐渐稳定在线粒体外膜上⁶⁵30分钟左右出现，60分钟或之后达到最大值。

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