Disruption of valosin-containing protein activity causes cardiomyopathy and reveals pleiotropic functions in cardiac homeostasis

doi:10.1074/jbc.RA119.007585

.2019年5月31日；294(22):8918-8929.

doi:10.1074/jbc。RA119.007585。 Epub 2019年4月21日。

含缬氨酸蛋白活性的破坏会导致心肌病，并揭示心脏稳态的多效性功能

马修·布罗迪¹, 戴维·范霍特¹, 钦梅五世·巴克什¹, 刘瑞杰^1 2, 罗伯特·科雷尔^1 三, 米歇尔·萨金特¹, 杰弗里·德·莫尔肯廷（Jeffery D Molkentin）^4 5

附属公司

¹来自俄亥俄州辛辛那提市辛辛那迪大学辛辛那蒂儿童医院医疗中心儿科，邮编：45229-3039。
²密歇根州阿伦代尔市Grand Valley州立大学生物医学科学系，邮编：49401。
^三阿拉巴马州塔斯卡卢萨阿拉巴马大学生物科学系，邮编：35487-0344。
⁴来自俄亥俄州辛辛那提市辛辛那迪大学辛辛那蒂儿童医院医疗中心儿科，邮编：45229-3039，Jeff.Molkentin@cchmc.org。
⁵俄亥俄州辛辛那提市霍华德·休斯医学院，邮编：45229-3039。

PMID： 31006653
预防性维修识别码：第655413页
内政部： 10.1074/jbc。RA119.007585元

含缬氨酸蛋白活性的破坏会导致心肌病，并揭示心脏稳态的多效性功能

马修·布罗迪等。生物化学杂志. 2019.

.2019年5月31日；294(22):8918-8929.

doi:10.1074/jbc。RA119.007585。 Epub 2019年4月21日。

作者

马修·布罗迪¹, 戴维·范霍特¹, 钦梅五世·巴克什¹, 刘瑞杰^1 2, 罗伯特·科雷尔^1 三, 米歇尔·萨金特¹, 杰弗里·德·莫尔肯廷（Jeffery D Molkentin）^4 5

附属公司

¹来自俄亥俄州辛辛那提市辛辛那迪大学辛辛那蒂儿童医院医疗中心儿科，邮编：45229-3039。
²大峡谷州立大学生物医学科学系，密歇根州艾伦代尔49401，和。
^三阿拉巴马州塔斯卡卢萨阿拉巴马大学生物科学系，邮编：35487-0344。
⁴来自俄亥俄州辛辛那提市辛辛那迪大学辛辛那蒂儿童医院医疗中心儿科，邮编：45229-3039，Jeff.Molkentin@cchmc.org。
⁵霍华德·休斯医学研究所，俄亥俄州辛辛那提，45229-3039。

PMID： 31006653
预防性维修识别码： PMC6552413型
内政部： 10.1074/jbc。RA119.007585元

摘要

含缬氨酸蛋白（VCP），也称为p97，是一种具有多种细胞功能的ATP酶，尽管其最显著的特征是将错误折叠或聚集的蛋白质靶向降解途径，包括内质网相关降解（ERAD）途径。然而，尽管VCP的人类突变会导致骨和额颞痴呆的Paget病，这是一种常染色体显性多系统蛋白病，包括心脏、骨骼肌、大脑和骨骼疾病，但VCP在心脏中的功能尚未得到仔细研究。在这里，我们生成了过度表达WT VCP或VCP的心脏特异性转基因小鼠^K524A公司ATP酶活性不足的突变体。过度表达WT VCP的转基因小鼠表现出正常的心脏结构和功能，而过度表达突变VCP的小鼠则发展为心肌病。从机制上讲，心脏中过度表达的突变VCP上调了ERAD复合物成分，并在心肌病出现之前升高了泛素化蛋白的水平，这表明ERAD的失调和蛋白酶体降解靶蛋白的清除效率低下。突变VCP转基因小鼠的心脏也表现出心肌细胞核形态的严重缺陷，核膜蛋白和核层粘连增加。蛋白质组学显示，内源性VCP与心脏中的核糖体、核糖体相关蛋白和RNA-结合蛋白之间存在大量相互作用，心脏VCP活性受损导致大核糖体亚单位蛋白聚集。这些数据确定了VCP调节心肌细胞蛋白质和RNA质量控制的多因子功能和多种机制，这些对心脏内稳态至关重要，这表明人类如何VCP公司突变对心脏有负面影响。

关键词：RNA转换；心肌肥厚；心肌细胞；心肌病；内质网相关蛋白降解（ERAD）；蛋白质聚集。

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利益冲突声明

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点

数字

**图1。**
**心肌细胞VCP活性受损会导致心肌病。** 一，用于诱导WT VCP或ATP酶缺陷型VCP突变体（VCP）心脏特异性表达的二元转基因系统示意图^K524A公司).B类2个月大时过度表达WT或K524A突变VCP的DTg小鼠和单转基因对照组的VCP心脏裂解物的Western blot。GAPDH被用作样品处理和装载控制。C类、6个月龄时所示基因型小鼠的心脏重量与体重的比值。D类，大体形态(顶部)和组织学（H&E，底部)DTgVCP的^K524A公司和tTA控制9个月大的心脏。*比例尺*=1毫米。*E–G公司*用超声心动图测量舒张期左室内径，评价不同年龄组小鼠的心脏结构和功能(*LVIDd公司*,E类)，收缩期左心室内径(*LVID（LVID）*,F类)和部分缩短百分比(*可行性研究*%,*G公司*)在指定年龄（以月为单位）的小鼠心脏中。分析的小鼠数量显示在柱在里面C类和*E–G公司*. *,第页与采用Tukey事后检验的单向方差分析的tTA对照组相比，<0.05。

**图2。**
**心脏特异性过度表达突变VCP的小鼠压力超载加重诱导的心脏病。** *A–C*舒张期左心室内腔尺寸(*LVIDd公司*,一)，收缩期左心室内径(*LVID（LVID）*,B类)和部分缩短百分比(*可行性研究*%,C类)通过超声心动图对8–10周龄无TAC小鼠（0周）和TAC手术后4周和8周进行评估。分析的小鼠数量显示在列中。*，第页与同一时间点的tTA对照组相比，使用Tukey的事后检验进行单向方差分析，结果<0.05。D类TAC术后12周，用H&E染色的小鼠指定行心脏切片的心脏大体形态和组织学分析。*比例尺*=1毫米。

**图3。**
**ERAD的失调和VCP-突变过度表达心脏中泛素化蛋白的积累。** 一和B类，Western blot检测2个月龄和6个月龄时心脏蛋白裂解物中的总泛素化（Ub）蛋白(一)并在2个月龄和6个月龄小鼠的指定基因型中对这些水平进行量化(B类).n个=4或3个样本。C类和D类，Western印迹(C类)和定量(D类)2个月龄和6个月龄小鼠心脏裂解物中所示内质网和ERAD蛋白的表达。n个=4或3个样本。**，第页< 0.01; *,第页与使用单尾Student’s的tTA对照组相比，<0.05t吨测试。

**图4。**
**VCP的急性抑制会破坏心肌细胞的蛋白质平衡。** 一和B类，Western印迹(一)和量化(B类)泛素化的(*Ub（英国）*)VCP抑制剂DeBQ（5μ米持续8小时）。α-微管蛋白显示为加工和负载控制。**，第页<0.01使用单尾学生t吨测试。

**图5。**
**VCP转基因心脏中UPR的激活。** 一和B类6个月大时心脏蛋白裂解物中UPR三个分支成分的Western blot(一)和蛋白质水平的量化(B类)在指定的小鼠基因型中。Gapdh显示为处理和加载控件。n个=每个基因型3个样本。**，第页< 0.01; *,第页与使用单尾Student’s的tTA对照组相比，<0.05t吨测试。

**图6。**
**VCP-ATP酶活性不足的心脏的心肌细胞核形态异常。** 一，所示基因型的转基因心脏在5个月龄和10个月龄时的透射电镜图像。*Nuc（数字）*，核心。#表示核碎裂。箭头表示核内膜结合结构，以及箭头指向核内无膜区域的低电子密度。这个星号表示线粒体异常。*比例尺*=2微米。B类和C类，Western印迹(B类)和量化(C类)在2个月龄和6个月龄时，使用所示基因型转基因小鼠的心脏蛋白裂解物检测核膜和核膜蛋白。Gapdh被用作处理和装载控制。n个=4或3个样本。**，第页< 0.01; *,第页与使用单尾Student’s的tTA对照组相比，<0.05t吨测试。

**图7。**
**VCP与心脏中的RBP、核仁蛋白和核糖体蛋白相互作用。** 一，VCP被免疫沉淀(*IP（IP）*)来自2月龄WT小鼠的心脏裂解物，免疫沉淀蛋白通过MS测序。RBP、核糖核蛋白和核糖体蛋白在VCP心脏相互作用组中大量富集。完整数据集位于支持信息.B类，用于酵母双杂交筛选的VCP的结构域示意图，以VCP的N末端辅因子结合域为诱饵，还鉴定了核糖体和翻译蛋白为VCP的直接相互作用体。该表列出了41个已鉴定的独特相互作用蛋白中所有被测序三次或三次以上的猎物质粒，以及总共66个被测序的猎物克隆。C类，从小鼠心脏蛋白裂解物中免疫沉淀VCP，然后进行NPM和核仁素的免疫印迹。IgG免疫沉淀作为对照。D类Western blot检测所示基因型小鼠6个月龄转基因心脏中的NPM和核仁蛋白。Gapdh被用作处理和加载控制。E类Western blot检测6个月大时所示基因型心脏提取物的Triton-soluble和-unsoluble蛋白颗粒（后来用尿素溶解）所示蛋白质的聚集。F类，指示的大核糖体亚单位蛋白的代表性免疫组织化学(绿色)在6个月龄转基因小鼠心脏冷冻切片中。*比例尺*=10微米。箭头在DTgVCP中指明具有聚合Rpl3或Rpl19的区域^K524A公司红心。

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1. Badadani M.、Nalbandian A.、Watts G.D.、Vesa J.、Kitazawa M.、Su H.、Tanaja J.、Dec E.、Wallace D.C.、Mukherjee J.、Caiozzo V.、Warman M.和Kimonis V.E.（2010）VCP相关包涵体肌病和骨敲除小鼠模型的Paget病展示了人类疾病的典型组织病理学。公共图书馆ONE 5，e13183 10.1371/journal.pone.0013183-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Watts G.D.、Wymer J.、Kovach M.J.、Mehta S.G.、Mumm S.、Darvish D.、Pestrong A.、Whyte M.P.和Kimonis V.E.（2004）与骨和额颞叶痴呆Paget病相关的包涵体肌病是由突变的缬氨酸蛋白引起的。自然基因。36、377–381 10.1038/ng1332-内政部-公共医学
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