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.2019年4月4日；177（2）：428-445.e18。
doi:10.1016/j.cell.2019.02.029。

外显子组成的重新评估

丹尼斯·K·杰佩森 1, Aidan M Fenix公司 2, 杰弗里·富兰克林 三, 詹姆斯·希金波坦 1, 秦章 1, 丽莎·齐默尔曼 4, 丹尼尔·利伯勒 4, 杰平 5, 齐柳 5, 蕾切尔·埃文斯 6, 威廉·菲塞尔 6, 詹姆斯·巴顿 7, 伦纳德·H·罗马 8, 迪伦·T·伯内特 2, 罗伯特·J·科菲 9
附属公司

外显子组成的重新评估

丹尼斯·K·杰佩森等。 单元格. .

摘要

小细胞外囊泡的异质性和非囊泡性细胞外物质的存在导致了关于外泌体内容物和功能性质的争论。在这里，我们采用高分辨率密度梯度分离和直接免疫亲和捕获来精确表征外泌体和其他非囊泡材料的RNA、DNA和蛋白质成分。细胞外RNA、RNA-结合蛋白和其他细胞蛋白在外泌体和非囊泡室中有差异表达。在外泌体中未检测到精氨酸1-4、糖酵解酶和细胞骨架蛋白。我们确定膜联蛋白A1是直接从质膜脱落的微泡的特异性标记物。我们进一步表明，细胞外小泡不是活性DNA释放的载体。相反，我们提出了一种新的模型，通过自噬和多囊泡-内切体依赖但外切体依赖的机制来主动分泌细胞外DNA。这项研究表明需要重新评估胞外体组成，并为更清楚地了解胞外囊泡异质性提供了一个框架。

关键词：Argonaute；两性体；膜联蛋白；自噬；外显子；外泌体；细胞外DNA；细胞外RNA；细胞外小泡；微泡。

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数字

图1。
图1.高分辨率密度梯度分馏将小的细胞外囊泡与非囊泡成分分离
（A） 本研究中使用的细胞外囊泡和颗粒的命名。（B） DKO-1和Gli36全细胞裂解物、大EV（P15）和粗小EV（P20）的免疫印迹（STAR方法）。在SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质，并用指示的抗体对膜进行印迹。（C） DKO-1和Gli36原油小型EV的密度梯度分馏（P120）。样品在高分辨率碘xanol梯度（STAR方法）中浮选后，在SDS-PAGE凝胶上加载等体积的每个组分，并用指示的抗体对膜进行印迹。NV，非泡状；sEV，小EV。（D）混合低（sEV）和高（非泡状）密度组分的纳米粒子追踪分析，使用或不使用Triton X-100洗涤剂进行预处理。对于方框图，中心线标记中间值；框限表示第25和75个百分位；胡须从第25和75百分位延伸到四分位范围的1.5倍；n=18个采样点；来自三个独立实验的数据。通过单因素方差分析和Holm-Bonferroni方法调整的两两比较评估显著差异*p＜0.001；N.S.，不重要。（E） DKO-1大EV（P15）和从高分辨率密度梯度获得的混合低（sEV）和高（NV）组分的负染透射电镜（TEM）。（F） Gli36的阴性染色TEM显示低（sEV）和高（NV）馏分。参见图S1和表S1。
图2。
图2小细胞外囊泡和非囊泡组分中蛋白质和RNA的差异表达
（A） 维恩图表示唯一和重叠蛋白质的数量。（B） 光谱计数定量差异的主成分分析。（C） DKO-1样品sEV和NV组分中蛋白质数量差异的火山图。黑色圆点表示四倍或更大的浓缩，而橙色圆点表示少于四倍的浓缩。虚线上方的点表示差异显著的蛋白质（FDR<0.05）。（D） 通过免疫印迹选择用于验证的选定蛋白质的sEV和NV合并级分之间的蛋白质组学分析的光谱计数的倍数变化表。（E） 蛋白质组分析的免疫印迹验证。NV，非泡状；sEV，小EV。（F）来自ExoCarta外显子体数据库的25种最常见的外体蛋白的热图形成了来自DKO-1的sEV和NV的蛋白质组分析。刻度表示强度，定义为Δ（光谱计数-平均光谱计数）/标准偏差。（G） 细胞和细胞外DKO-1（左）和Gli36（右）样本的短RNA读取映射到不同类型的小ncRNA的百分比。（H） 基于定量miRNA图谱的主成分分析。（一） 所有样本类型中50个最丰富的miRNAs的热图。刻度表示强度，定义为Δ（读取计数-平均读取计数）/标准偏差。另请参见图S2和表S2-7。
图3。
图3人类精氨酸和miRNA生物发生机制的分泌
（A） 人类miRNA生物发生示意图。Pri-miRNA由RNA聚合酶II转录，并由Drosha/DGCR8微处理器复合体剪切以生成前miRNA。在输出到细胞质后，Dicer切割由TRBP支持的茎环。然后以HSP90/HSC70依赖的方式将miRNA/miRNA双链加载到Ago中。miRNA双链被解开，乘客链被弹出。Ago和GW182形成基因沉默所必需的成熟RISC复合物。插入物显示了在“GW体”、加工体和应激颗粒中发现的常见蛋白质，*表示细胞应激条件下蛋白质丰度增加。（B） 全细胞裂解物、大EV（P15）和粗小EV（P20）的免疫印迹。（C） 四种结直肠癌（CRC）、邻近正常和淋巴结转移的细胞裂解物的免疫印迹，以及从匹配组织/间质液中分离的粗制小EVs（P120）（STAR方法）。N、 正常；T、 肿瘤；LM，淋巴结转移。（D） 从三名正常人血浆中分离的高分辨率密度梯度纯化sEV和NV样品的免疫印迹（见图S3D）。（E） 粗小EV高分辨率密度梯度分级的免疫印迹（P120）。另请参见图S3。
图4。
图4.RNA-结合蛋白和蜂房的细胞外释放
（A） 直接免疫亲和捕获（DIC）程序示意图。直接与抗CD63、抗CD81、抗CD9抗体或IgG结合的磁珠直接添加到预先清除的细胞培养基（STAR方法）中，无需预先超速离心或浓缩。同时，从相同的预先清除的细胞培养基中制备常规粗sEV（P120）。来自（B）DKO-1或（C）Gli36的CD81-、CD63-和CD9-阳性外显体的（B-C）DIC。粗sEV颗粒（P120）和珠捕获外泌体的免疫印迹。（D） 通过超速离心获得的全细胞裂解物、大EV（P15）和粗小EV（P20）的免疫印迹。（E） 粗小EV高分辨率密度梯度分级的免疫印迹（P120）。CD81-、CD63-和CD9-阳性外泌体的（F-H）DIC。来自（F）DKO-1、（G）Gli36和（H）培养的原代人肾上皮细胞的sEV粗颗粒（P120）和珠捕获的外泌体的免疫印迹。例如，接触更多。（I） 拱顶的结构和分子组成。（J） DKO-1和Gli36 NV组分的非固定阴性染色TEM。红色箭头表示拱顶结构。（K） 梯度密度离心法产生的纯化sEV和NV中vault相关蛋白的蛋白质组学分析。数据为准FDR的平均值±SD。*p<0.00001。（五十） DKO-1细胞、大EV（lEV）、sEV和NV混合组分中穹窿RNA的短RNA-seq数据。RPM，读/百万。（M） DKO-1细胞、大EV（lEV）、纯化sEV和非囊泡（NV）混合组分中穹窿RNA的长RNA-seq数据。FPKM，碎片/千基百万。另请参见图S4。
图5。
图5：膜联蛋白A1是一种区别于外显体和ARMM的新型和特异性微泡标记物
（A） 细胞外膜联蛋白的蛋白质组学分析。（左）细胞膜联蛋白的光谱计数，DKO-1的lEV（P15）和梯度纯化sEV和NV样品，以及Gli36的梯度纯化sEV和NV样品。数据表示平均值±标准偏差。n=6。（B） 细胞、lEVs（P15）和粗sEVs（P20）中Annexin表达的免疫印迹分析。（C） 粗DKO-1 sEV的高分辨率（12–36%）密度分级（P120）。（D） 粗DKO-1 sEV（P120）的梯度（6–30%）密度分馏。（E） DKO-1细胞CD81-a和CD9-阳性外泌体的DIC。sEV粗颗粒（P120）和珠捕获的外泌体的免疫印迹。例如，接触更多。（F） 膜联蛋白A1阳性经典微泡。（左）DKO-1细胞的3D结构照明显微镜（SIM），Annexin A1和DAPI染色。放大的插页以灰色显示在底部。（右）DKO-1细胞3D SIM成像的Annexin A1阳性经典微泡的大小分布。囊泡在质膜上脱落的最大宽度直方图。n=221；来自四个独立实验的数据。（G） 膜联蛋白A1阳性大瘤体。（左）DKO-1细胞的3D SIM，Annexin A1和DAPI染色。放大的插页以灰色显示在底部。（右）DKO-1细胞3D SIM成像的Annexin A1阳性经典大瘤体的大小分布。质膜处大瘤体最大宽度的直方图。n=82；来自四个独立实验的数据。（H） 对DKO-1细胞、lEV（P15）、密度梯度纯化sEV和NV组分池中的ARF6、ARRDC1和TSG101进行蛋白质组学分析。数据为平均值±标准偏差。n=6。来自（I）DKO-1、（J）Gli36和（K）人血浆的CD81和CD9阳性外泌体的（I-K）DIC。例如，接触更多。另请参见图S5。
图6。
图6：人类细胞中细胞外dsDNA和组蛋白的释放独立于胞外小泡和胞外小囊泡
（A） 粗小EV高分辨率密度梯度分级的免疫印迹（P120）。（B） 对提取DNA的梯度分馏sEV和NV池中的DNA进行量化，并用DNase I或RNase A/T1处理提取后的DNA，以确认其为DNA。数据为平均值±标准偏差。N.D公司.，未检测到；NV，非泡状；sEV，小EV。（C）在密度梯度分馏和提取DNA之前，用DNase I预处理样品的DNA定量（以消除未受保护的DNA）。数据为平均值±标准偏差。N.D公司.，未检测到。（D） 来自DNase I预处理密度梯度纯化sEV和NV的纯化DNA碱基对（bp）大小分布的生物分析仪电泳图。DNA标记在35 bp和10380 bp处达到峰值。FU：荧光单位。（E） CD81-和CD63阳性外泌体的DIC。（F） CD81阳性外泌体的DIC。从捕珠材料和以120000×g（P120）造粒的流通材料中提取DNA。数据为平均值±SD。另请参见图S6。
图7。
图7通过Amphisome依赖机制主动分泌DNA和组蛋白
（A） DKO-1细胞进行DAPI、内源性CD63和CD9染色，并用3D SIM成像。（顶部）Z堆叠投影。（底部）放大插件。另请参见图S7A。（B） 来自（A）的Z切片图像和灰度放大插入。（C） 三维SIM检测CD63阳性多泡内体（MVE）的大小和结构。（上图）两种CD63阳性MVE结构。DKO-1细胞CD63染色的裁剪图像。（底部）数据为平均值±SD。n=57，来自五个独立实验的数据。（D） 定位于CD63和双链DNA（dsDNA）的DKO-1细胞的裁剪图像。（左）灰度CD63和dsDNA，以及彩色合并。dsDNA通道中的黄色箭头表示行扫描中的dsDNA峰值强度。在彩色合并的黄色虚线处进行线扫描。（右）线扫描显示CD63信号在dsDNA峰值强度处下降。对于线扫描图，将各个通道归一化以显示在图上。比例尺，250纳米。（E） 通过3D SIM定位CD63和组蛋白H3的DKO-1细胞的裁剪图像。（左）灰度CD63和组蛋白H3，以及彩色合并。显示的是通过Z堆栈的序列图像切片（125 nm）。（右）CD63阳性MVE的放大图像，黄线表示最长轴。比例尺，200 nm。（F） 通过3D SIM定位CD63和p62的DKO-1细胞的裁剪图像。（左）灰度CD63和p62以及彩色合并。显示的是通过Z堆栈的序列图像切片（125 nm）。（右）CD63阳性MVE的放大图像，黄线表示最长轴。比例尺，200 nm。（G） DKO-1细胞中的CD63和LC3B阳性两性体。对细胞进行内源性CD63和LC3B染色。灰度CD63和LC3B，彩色合并和放大插入。LC3B通道中的黄色箭头和放大的插入物表明LC3B定位于CD63阳性腔室。放大插入的比例尺，200 nm。（H） dsDNA在DKO-1细胞CD63-、LC3B-阳性两性体中的定位。（左）定位于内源性CD63、LC3B和dsDNA的细胞裁剪图像，并通过三色3D SIM成像。灰度CD63、LC3B和dsDNA的X-Y轴“俯视图”，以及彩色合并。（右）X-Z轴“侧视图”。黄色箭头表示CD63阳性室，蓝色箭头表示LC3B阳性室，两者共同定位于质膜。比例尺，200 nm。（一） 检测LC3B-PE阳性EV。（左）DKO-1全细胞裂解物、大EV（P15）和粗小EV（P20）的免疫印迹。（右）从结直肠癌（CRC）、邻近正常和淋巴结转移的匹配组织/间质液中分离出的全细胞裂解物和粗制小EV（P120）的免疫印迹。N、 正常；T、 肿瘤；LM，淋巴结转移。（J） 粗DKO-1 sEV的梯度（6–30%）密度分级（P120）。（K） CD81-、CD63-和CD9-阳性外泌体的DIC。粗sEV颗粒（P120）的免疫印迹和从DKO-1（顶部）和Gli36细胞（底部）捕获的珠状外泌体。（五十） 两性体依赖性、外显体依赖性分泌模型。对于自噬，细胞溶质LC3通过与磷脂酰乙醇胺结合而被脂化，形成LC3-PE。1）核膜可以在依赖LC3B和核膜蛋白Lamin B1的过程中起泡，导致出现细胞质染色质碎片。2） 在自噬过程中，随着吞噬体开始吞噬物质，细胞质成分被隔离。3） 自噬膜的持续扩张需要LC3-PE，并导致双膜自噬体的形成。4） 随着早期内体发育为晚期内体，pH值降低，限制膜的持续内陷产生腔内小泡（ILV）。充分发育的CD63阳性多泡内体（MVE）含有大量ILV。5） 自噬体与MVE融合导致内部自噬体膜降解，产生两性体，即单膜杂交室。6） 两性体与溶酶体室融合形成自溶体，随后货物降解，或者7）两性体与质膜融合，导致dsDNA和组蛋白的胞外释放，ILV单独作为外体。另请参见图S7。
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