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.2016年9月；4（17）：e12915。
doi:10.14814/phy2.12915。

EZH2促进特发性肺纤维化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化

肖肖 1, Lakmini K Senavirathna公司 1, 徐徐沟 1, 黄朝群 1, 梁玉荣 1, 林刘（Lin Liu） 2
附属公司

EZH2增强特发性肺纤维化成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化

肖肖等。 生理学代表. 2016年9月.

摘要

成纤维细胞/肌成纤维细胞在纤维化灶中的积聚是特发性肺纤维化（IPF）的特征之一。玉米淀粉同系物2增强子（EZH2）是多蛋白复合物、多梳抑制复合物2的催化成分，参与组蛋白H3在赖氨酸27处的三甲基化。在本研究中，我们研究了EZH2在成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中的作用和机制。我们发现EZH2在IPF患者和博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺中上调。EZH2在肌成纤维细胞中表达上调。肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白和纤维连接蛋白的表达以及收缩性表明，EZH2通过其抑制剂3-二氮杂脱氧核糖核酸（DZNep）或shRNA的抑制作用减少了TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞向肌成纤维纤维细胞的分化。DZNep抑制Smad2/3核转位而不影响Smad2/3磷酸化。DZNep治疗减轻博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。我们得出结论，EZH2通过增强Smad2/3核移位诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。

关键词：EZH2；IPF；Smad2/3；成纤维细胞；肌成纤维细胞。

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数字

图1
图1
EZH2在IPF患者肺部和博来霉素攻击小鼠中的表达。（A） IPF患者的肺组织按其用力肺活量（FVC）进行分组：轻度、>80%（8例）、中度、50-80%（10例）、重度、<50%（10名）。通过实时PCR分析EZH2 mRNA的表达，并将其归一化为β肌动蛋白水平。结果显示为平均值±SE*P（P）<0.05与>80%FVC组（学生t吨‐测试）。（B） 用抗EZH2抗体和ABC对PBS（对照）和博莱霉素激发小鼠的肺组织切片进行染色。EZH2显示为棕色。比例尺：左100μm和右侧50μm.（C）使用抗EZH2抗体用ABC染色对肺组织切片进行双重标记，使用抗αSMA抗体。细胞核用DAPI染色。EZH2和α‐SMA染色显示这两种蛋白共定位。比例尺：50μm.（D）从PBS对照组和博莱霉素激发的小鼠中分离出初级成纤维细胞/肌成纤维细胞。western blotting法测定EZH2蛋白水平。使用ImageJ软件对western blot结果进行量化，并将其归一化为GADPH水平。结果显示为三个独立实验的平均值±SE，其中每个实验使用四只动物（两个对照组和两个博莱霉素激发小鼠）不同世代的原代成纤维细胞/肌成纤维细胞**P（P）<0.01（学生的t吨‐测试）。IPF，特发性肺纤维化；PBS，磷酸盐缓冲盐水。
图2
图2
TGF‐βEZH2抑制剂DNZep抑制1诱导的肌成纤维细胞标记物表达。用DZNep（4μmol/L），然后使用DZNep和TGF‐β1（5 ng/mL）额外24小时。未经DNZep处理的细胞作为对照（CON）。EZH2和α通过western blotting测定SMA蛋白水平。GAPDH被用作负荷控制。代表性斑点如（A）所示，使用ImageJ软件对水平进行量化，并将其归一化为GAPDH水平；结果如（B）和（C）所示。The levels of theα‐SMA（D）和纤维连接蛋白（FVC）。（E） 使用实时PCR测定mRNA，并将其归一化为β肌动蛋白水平。所有结果均表示为三个独立实验的平均值±SE，每个实验重复进行*P（P）< 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001, ****P（P）<0.0001（方差分析和费希尔LSD）。
图3
图3
转化生长因子‐β1诱导的收缩性被EZH2抑制剂DZNep抑制。（A） 用DZNep（4μmol/L），然后使用DZNep和TGF‐β1（5 ng/mL）额外24小时。将细胞与胶原蛋白1混合并添加到12孔板中。凝胶从井壁和井底分离，48小时后拍摄图像。（A） 代表性图像。（B） 使用ImageJ软件测量凝胶表面积。结果显示为三个独立实验的平均值±SE(n个 = 3); 每个实验重复进行**P（P）<0.01（方差分析和费希尔LSD）。
图4
图4
EZH2基因敲除降低肌成纤维细胞标记物的表达αSMA公司。将含有shEZH2或其对照shCON的慢病毒以100的MOI感染LL29细胞24小时。感染48小时后，用5 ng/mL TGF‐β1，再延长24小时。EZH2和α通过western blotting测定SMA蛋白。（A） 代表性印迹。（B，C）使用ImageJ软件定量蛋白质印迹结果。将结果归一化为GAPDH，并表示为shCON的百分比。数据显示为三个独立实验的平均值±SE，每个实验重复进行*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（方差分析和费希尔LSD）。
图5
图5
DZNep不影响Smad2/3磷酸化，但抑制Smad2/3核移位。（A） LL29细胞用4μDZNep摩尔/升48小时，然后使用TGF‐β1（5 ng/mL）持续30、60或120分钟。Western blotting检测EZH2、p‐Smad2/3、Smad 2/3和β肌动蛋白。显示了三个独立实验的代表性结果。（B） 用DZNep（4μmol/L）或溶媒（CON）48小时，然后使用TGF‐β1（5 ng/mL）持续60分钟。通过western blotting测定细胞质和核组分中EZH2、p-Smad2、p-Smad3和Smad2/3蛋白的水平。GAPDH和层粘连蛋白B1分别用作胞浆和细胞核的负荷控制。显示了三个独立实验的代表性结果。
图6
图6
DZNep可减轻肺纤维化。雌性C57BL/6小鼠用PBS或博莱霉素进行气管内激发，并在博莱霉素激发前1天开始每天腹腔注射一次PBS或DZNep。第17天，收集左肺组织进行RNA和蛋白质提取，并固定右肺组织进行苏木精和伊红染色。（A） 使用实时PCR测定EZH2 mRNA的水平，并将其归一化为18S rRNA。通过western blotting测定EZH2蛋白的水平。代表性斑点和定量如（B，C）所示。将结果归一化为GAPDH。数据显示为平均值±SE。n个=每组6只动物*P（P） < 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001（方差分析和费希尔LSD）。（D） H&E染色的代表性图像。比例尺：200μm.（E）阿什克罗夫特量表用于量化肺纤维化。所有结果均表示为平均值±SE。n个=每组6只动物*P（P）<0.05（学生的t吨‐测试）。纤维化标记物的mRNA水平α使用实时PCR测定SMA（F）、COL1A1（G）和COL3A1（H），并将其归一化为18S rRNAα使用蛋白质印迹法测定SMA蛋白。代表性印迹和定量显示在（B，F）中。将数据归一化为GAPDH。所有结果均显示为平均值±SE。n个=每组6只动物*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ****P（P）<0.0001（方差分析和费希尔LSD）。PBS，磷酸盐缓冲盐水。
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