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.2016年8月1日；214(3):275-91.
doi:10.1083/jcb.201603105。 Epub 2016年7月25日。

Syntaxin-17将PINK1/parkin依赖的线粒体小泡传递到溶酶体系统

吉安·卢卡·麦克莱兰德 1, 悉尼A·李 1, 海蒂·M·麦克布莱德 2, 爱德华·A·丰 三
附属公司

Syntaxin-17将PINK1/parkin依赖的线粒体小泡传递到溶酶体系统

吉安·卢卡·麦克莱兰德等。 J细胞生物学. .

摘要

线粒体被认为是独立的细胞器，与内吞和生物合成途径物理上分离。然而，最近的研究揭示了PINK1/帕金依赖性小泡运输途径，其中氧化或受损的线粒体内容物选择性地传递到晚期内体/溶酶体进行降解，提供了线粒体确实整合在内膜系统中的证据。鉴于线粒体尚未被证明使用典型的可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）机制进行融合，线粒体衍生小泡（MDV）靶向内胚层室的机制尚不清楚。在本研究中，我们确定syntaxin-17是一种核心线粒体SNARE，是将应激诱导的PINK1/parkin依赖性MDV传递到晚期内体/溶酶体所必需的。Syntaxin-17仍与成熟MDV相关，并与SNAP29和VAMP7形成三元SNARE复合物，以依赖于同型融合和空泡蛋白分选（HOPS）系链复合物的方式介导MDV内溶酶体融合。Syntaxin-17可以追溯到最后一个真核生物的共同祖先，暗示去除受损线粒体内容物可能是细胞中最早的小泡运输途径之一。

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数字

图1。
图1。
Stx17在线粒体衍生小泡（MDV）上进行生化富集。（A） 无细胞MDV芽殖试验流程图（有关完整详细信息，请参阅材料和方法）。（B） 分离小鼠肝脏（见材料和方法），用SDS-PAGE分离40µg重膜（HM）、可溶性（S）和轻膜（LM）组分，并用免疫印迹法进行分析。（C） 通过SDS-PAGE分离在细胞液和/或50µM抗霉素A（anti-A）存在下培养的体外MDV出芽试验中的胰蛋白酶化上清液和颗粒，以及反应颗粒（线粒体），并通过免疫印迹分析。星号表示非特定带。（D） 在不连续的蔗糖梯度上分馏大规模芽变反应（与胞浆和50µM抗霉素A孵育），用SDS-PAGE分离并用免疫印迹分析。（E） D中探测的蛋白质的强度分布，表示为其最大强度的一部分。
图2。
图2。
线粒体Stx17病灶的动力学和超微结构。（A） 通过旋转圆盘共焦显微镜对表达YFP-Stx17（绿色，800ms暴露时间）并用MitoTracker深红色FM（红色，50ms暴露时间）染色的未处理COS7细胞中Stx17囊泡形成和释放的活细胞观察。经过的时间显示在每个合并图像的右下角。白色箭头表示Stx17+在小管上形成并随后与小管分离的结构。棒材：（全图）10µm；（放大）0.5µm。（B） Stx17在释放前集中于小管。在来自A的同一时间序列中，YFP-Stx17信号（右）集中于MitoTracker标记的小管（左）。YFP-Stx17图像表示为热图，亮度/对比度已调整（从a开始），因此完全形成的结构几乎饱和，可以清楚地看到信号的浓度。棒材，0.5µm。（C） 用GFP-Stx17转染的活细胞的SD-OSR图像。Stx17信号位于线粒体外膜上，白色箭头表示Stx17位于OMM上。蓝色虚线描绘了线粒体内部。条形，200 nm。（D） 表达YFP-Stx17的COS7细胞的代表性透射电镜照片，对YFP进行免疫染色，并用1.4 nm金颗粒和银增强（SE）标记。固定前用25µM抗霉素A处理细胞45分钟。黑色箭头表示YFP-Stx17位于线粒体外膜的细胞溶质表面。条形图：（左上角）250 nm；（左上角插图），50 nm；（右上角）250 nm；（左下）200 nm；（右下角）500 nm。（E） 在抗霉素A处理和未处理的表达YFP和YFP-Stx17的细胞中，来自D.Bars的细胞中线粒体外膜每距离YFP阳性病灶数量的定量表示平均值±SEM；n个=每种情况下80–112个线粒体；***，P<0.001。（F） 来自D.Bars的细胞中带有YFP-Stx17病灶的线粒体比例的量化表示平均值。（G） 表达YFP-Stx17的COS7细胞的代表性透射电镜照片，对YFP进行免疫染色，并用10 nm金颗粒标记。红色箭头表示存在于线粒体外膜胞质表面的线粒体膜变形上的金颗粒。棒材，50 nm。
图3。
图3。
Stx17定位于依赖泊车/PINK1的MDV。（A） 固定前用25µM抗霉素A处理45分钟的COS7细胞的透射电子显微照片。插图（黑框）显示了与线粒体外膜相连的出芽轮廓。白色和黑色箭头分别表示囊泡内膜和外膜，黑色箭头表示囊泡颈。条形图：（全图像）100 nm；（插入）50 nm。（B） 用指示的siRNA转染COS7细胞，用SDS-PAGE分离未处理细胞中的60µg裂解物，并对指示的蛋白质进行免疫印迹。星号表示非特定带。（C） 抗霉素A处理细胞PDH E2/E3bp（绿色）和TOM20（红色；Hoescht，蓝色）免疫染色的典型共焦图像。选择性，PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−与MDV对应的结构用红色箭头表示。棒材：（左）10µm；（右）2µm。（D） PDH E2/E3bp数量的量化+/TOM20（TOM20）−经或不经25µM抗霉素A处理45分钟的C细胞中每细胞的MDV。条形代表平均值±SEM，n个=每个条件下23–29个细胞。***，P＜0.001；不另作说明，不重要。（E） U2OS:GFP-parkin（青色）细胞的共聚焦图像，表达Flag-Stx17（品红色），用25µM抗霉素a处理2 h，固定并免疫染色PDH E2/E3bp（黄色）和TOM20（蓝色）。插图中的红色箭头表示PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−与GFP-parkin和Flag-Stx17共同定位。棒材：（全图）10µm；（插图）1µm。（F） 通过合并插图E中绘制的3-µm线绘制的强度图。E中显示的MDV以及线粒体（mito）。A.U.，任意单位。（G） 用对照siRNA（ctrl-siRNA）或siRNA靶向parkin（siParkin）或PINK1（siPINK1）转染COS7细胞的代表性透射电镜照片，表达YFP-Stx17，对YFP进行免疫染色，并用1.4 nm金颗粒和银增强（SE）标记。细胞在固定前用25µM抗霉素A处理45分钟或不处理。红色箭头表示YFP-Stx17信号簇。M、 线粒体；C、 胞质溶胶。条形，100 nm。（H） 在抗霉素A处理和未处理的表达YFP-Stx17的细胞中，在来自G的细胞中，每线粒体外膜距离的YFP阳性灶数量的定量。条形表示平均值±SEM；n个=每种情况下105–207个线粒体；***，P<0.001。
图4。
图4。
帕金/PINK1依赖型MDV的溶酶体周转需要Stx17。（A） 使用两种不同的抗体通过免疫印迹检测COS7细胞中的Stx17沉默。（B） 表达用抗霉素A处理的LAMP1 mRFP（品红色）的细胞的代表性共聚焦图像，并对PDH E2/E3bp（黄色）和TOM20（青色；Hoescht，蓝色）进行固定和免疫染色。PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−指示LAMP1的正（红色箭头）或负（蓝色箭头）结构。棒材：（主要）10µm；（插图）2µm。（C） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−在来自B.Bars的抗霉素A处理细胞中与LAMP1-mRFP共定位的MDV代表平均值；n个=对照siRNA和siStx17分别为29和25个细胞；****，P<0.0001。（D） siStx17细胞中MDV转换的脉冲相分析。在转染对照siRNA（红线）或靶向Stx17（蓝线）的siRNA的COS7细胞中，用25µM抗霉素A脉冲细胞45分钟，然后在固定前用缺乏药物的培养基追踪0.5至2小时。PDH E2/E3bp的数量+/TOM20（TOM20）−对所指示的时间的结构进行计数。条形代表平均值±SEM；n个=每种情况19–23个细胞；**，P<0.01；***，P<0.001。根据拟合的衰变图计算MDV半衰期（见材料和方法；r2=0.98，对于对照siRNA和r2=0.91（对于siStx17）。（E） Stx17沉默延迟了驻车蛋白与MDV的分离。U2OS:GFP-parkin细胞转染所示siRNA，用25µM抗霉素A处理4 h，然后固定并免疫染色PDH E2/E3bp（红色）和TOM20（蓝色）。PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−GFP-parkin（绿色）的MDV也显示为正（箭头）或负（圆圈）。棒材，5µm。（F） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−在E.Bars细胞中与GFP-parkin共定位的MDV代表平均值；n个=对照siRNA和siStx17分别为22和19个细胞；****，P<0.0001。（G） 抗霉素A处理的U2OS:GFP parkin细胞的透射电子显微照片，对GFP进行免疫染色，并用1.4 nm金颗粒标记。黑盒子（左）放大了OMM（右）细胞溶质表面上的GFP-parkin簇。M、 线粒体。条形图：（左）100 nm；（右）50 nm。（H） 抗霉素A处理的U2OS:GFP-parkin细胞的透射电镜照片，转染对照siRNA（左）或靶向Stx17的siRNA（siStx17，右），对GFP进行免疫染色，并用1.4 nm金颗粒标记。黑色箭头表示GFP-parkin.M，线粒体的细胞溶质簇；LD，脂滴。棒，500纳米。
图5。
图5。
MDV营业额需要Stx17相关SNARE SNAP29和VAMP7。（A） COS7细胞中内源性SNAP29和Flag-VAMP7或Flag-VAMP8与YFP-Stx17的共免疫沉淀，使用抗GFP抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物（IP）以及8%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（B） U2OS:GFP-parkin细胞表达标记的VAMP7或VAMP8（黄色），用25µM抗霉素A处理2 h，然后固定并免疫染色PDH E2/E3bp（青色）和TOM20（洋红）。箭头表示PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−与相关VAMP共同定位的结构。棒材：（主要）20µm；（变焦）1µm。（C） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−与B的U2OS细胞中的VAMP7（红点）或VAMP8（蓝点）共定位的结构，处理2和4小时。条形代表平均值；n个=20–22个单元格；**，P<0.01；***，P<0.001。（D） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−用25µM抗霉素A处理COS7细胞45分钟后，与VAMP7（红点）或VAMP8（蓝点）共定位的结构。条形代表平均值；n个=VAMP7和VAMP8分别为27和29个单元格；****，P<0.0001。（E） Stx17-相关SNARE在U2OS:GFP-parkin细胞中沉默，并通过免疫印迹证实沉默。（F） U2OS的典型共焦图像：转染有指示siRNA和LAMP1-mRFP（品红色）的GFP-parkin细胞，用25µM抗霉素A处理2 h，然后固定并免疫染色PDH E2/E3bp（黄色）和TOM20（青色）。PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−指示LAMP1的正（红色箭头）或负（蓝色箭头）结构。棒材：（主要）10µm；（变焦）1µm。（G） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−在来自F.的U2OS细胞中与LAMP1-mRFP共定位的结构。Bars表示平均值；n个=每种情况23–26个细胞；***，P<0.001。（H） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−在抗霉素A处理的COS7细胞中与LAMP1-mRFP共定位的结构。条形代表平均值；n个=每种情况24–27个细胞；*，P<0.05；***，P<0.001。（I） 在内源性Stx17和VAMP7被沉默的COS7细胞中，GFP-Stx17和Flag-VAMP7与LAMP1-mRFP以1:3的比例表达。GFP和pcDNA作为对照质粒。对细胞进行裂解，用SDS-PAGE分离20µg细胞裂解液，并对所示蛋白进行免疫印迹。星号表示非特定带。注意，抗内源性VAMP7的抗体不能识别Flag-VAMP7，因为该结构是使用小鼠的cDNA创建的。（J） PDH E2/E3bp的定量+/TOM20（TOM20）−在GFP阳性、抗霉素A处理的I.Bars细胞中与LAMP1-mRFP共定位的结构代表平均值；n个=每种情况24–29个细胞；***，P<0.001。
图6。
图6。
操纵Stx17/VAMP7零层会影响复杂地层和MDV周转。（A） 人类R-SNARE蛋白SNARE结构域的一级序列比对。箭头表示参与SNARE三元复合物中心离子层的保守精氨酸。（B） 内源性SNAP29和VAMP7与内源性Stx17免疫沉淀与抗Stx17抗体共免疫沉淀，从未经治疗和抗霉素A处理的COS7细胞共免疫沉淀。Anti-GFP用作控件。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及5%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。请注意，由于免疫沉淀样品中甘油含量与输入相比增加，VAMP7带在免疫沉淀通道中发生移动，导致SDS-PAGE迁移较慢。（C） Diao等人（2015）（PDB ID 4WY4）中解决的由Stx17（黄色）、SNAP29（绿色）和VAMP8（洋红）形成的三元SNARE络合物的中心离子层结构。显示参与残留物。注意，VAMP8中的精氨酸-37等同于VAMP7中的精胺酸-150。（D） 野生型（WT）或突变型（Q196R）YFP-Stx17在COS7细胞中表达，然后将其固定并制备免疫荧光（YFP-St x17，绿色；Hoescht，蓝色），或者在插入物的情况下，免疫EM M，线粒体；C、 胞质溶胶。棒材：（主要）20µm；（变焦）50 nm。（E） 表达空YFP载体WT或突变（Q196R）YFP-Stx17的COS7细胞内源性SNAP29和VAMP7的共免疫沉淀，使用抗GFP抗体免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及2.5%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（F和G）量化YFP-Stx17 WT与Q196R相比免疫沉淀的SNAP29（F）和VAMP7（G）的数量，并归一化为输入。条形代表平均值±SEM；n个=3个实验；**，P<0.01；不另作说明，不重要。
图7。
图7。
SNARE复合体形成和MDV周转需要适当的零层比率。（A） 基于Diao等人解决的结构，由Stx17（红色）、SNAP29（绿色）和VAMP7/8（蓝色）组成的三元复合物中零层残基的组织和突变（Diao等人，2015；PDB ID 4WY4）。（B） VAMP7和VAMP8的域结构。箭头表示SNARE域中的保守零层残留物。TM，跨膜结构域。（C） 标记的VAMP7和VAMP8构建物在COS7细胞中表达，然后固定并免疫Flag（绿色）和LAMP2（红色）。棒材：（主要）10µm；（插图）2µm。（D） 使用抗GFP抗体在COS7细胞中与YFP、YFP-Stx17 WT或Q196R共免疫沉淀内源性SNAP29和标记VAMP7或VAMP8零层突变体。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及8%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（E和F）量化YFP-Stx17 WT与Q196R相比免疫沉淀的SNAP29（E）和标记VAMP7和VAMP8（F）的数量，并归一化为输入。条形代表平均值±SEM；n个=3个实验；***，P＜0.001；不另作说明，不重要。（G） 在内源性Stx17和VAMP7沉默的COS7细胞中，Flag-Stx17（WT或Q196R）、Flag-VAMP7（WT或R150Q）和LAMP1-YFP以3:3:1的比例表达（pcDNA3用作Flag载体的对照）。对细胞进行裂解，用SDS-PAGE分离20µg细胞裂解液，并对所示蛋白进行免疫印迹。（H） PDH E2/E3bp的定量+/TOM20（TOM20）−在用来自G.的构建体转染的抗霉素A处理的COS7细胞中与LAMP1-YFP共定位的结构。Bars代表平均值；n个=每种情况下18–30个细胞；***，P＜0.001；不另作说明，不重要。
图8。
图8。
Stx17对于去极化诱导的有丝分裂是不必要的。（A） U2OS:GFP-parkin细胞（葡萄糖上生长）经20µM CCCP或DMSO处理24小时的典型共焦图像。通过DNA固定和免疫染色（红色）以及Hoescht 33342（蓝色）复染来监测噬菌体。保留线粒体的细胞用星号标记。为了让读者更清楚地看到线粒体DNA（mtDNA）的存在，对Hoescht图像（与核DNA[nDNA]相关）进行阈值化，并从总DNA染色中减去，以生成单独的mtDNA图像（底行）。棒材，20µm。（B） 定量A.Bars中细胞保留线粒体的百分比代表平均值±SEM；n个=每种条件下重复3个细胞，每种条件每次重复计数>100个细胞。***，P<0.001。（C） U2OS的典型共焦图像：GFP-parkin（在葡萄糖上生长的细胞，用20µM CCCP或DMSO处理1小时，以监测GFP-partin[绿色]向线粒体[TOM20，红色；Hoescht，蓝色]的招募[标有星号的细胞]）。棒材，20µm。（D） 细胞百分比的量化显示来自C.的细胞中的parkin向线粒体募集。条形表示平均值±SEM；n个=每种条件下重复3个细胞，每种条件每次重复计数>100个细胞；***，P＜0.001；不另作说明，不重要。
图9。
图9。
HOPS复合体在MDV周转期间充当系绳。（A） HOPS亚单位Vps41存在于体外生成的MDV上。通过SDS-PAGE分离在图1D所示的无细胞分析中产生的等量纯化MDV（相当于图1D中的分数16）（含胞浆和50µM抗霉素a），以及梯度底部存在的材料（相当于表1D中分数22），并对所示蛋白质进行免疫印迹。Eps15作为可溶性蛋白质的对照物。（B） 来自表达空YFP载体（YFP；注意，印迹裁剪在对应于YFP的约30kD带上方）、野生型（WT）或突变体（Q196R）YFP-Stx17的COS7细胞的内源性Vps41的共免疫沉淀，使用抗GFP抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及2.5%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（C） 使用抗GFP抗体免疫沉淀，从表达YFP或YFP-Stx17的对照、Vps39-或Vps41-缺失COS7细胞共免疫沉淀内源性SNAP29和VAMP7。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及2.5%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（D） 转染指示siRNA的COS7细胞的免疫印迹分析。（E）转染指示的siRNA和LAMP1-YFP（绿色）的COS8细胞的典型共焦图像，这些细胞用25µM抗霉素A处理45分钟，然后固定并免疫染色PDH E2/E3bp（红色）和TOM20（蓝色）。PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−指示LAMP1的正（红色箭头）或负（蓝色箭头）结构。棒材，2µm。（F） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−大肠杆菌细胞中与LAMP1-YFP共定位的结构代表平均值；n个=每种情况下30–35个细胞；***，P<0.001。（G） Stx17介导的MDV晚期内体融合模型。Stx17在萌芽期间被招募到MDV中，很可能是从OMM上的扩散池中动员出来的。Stx17以HOPS依赖的方式与SNAP29和VAMP7在晚期内体形成三元SNARE复合物，以介导融合。
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