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.2016年5月6日7:11483。
doi:10.1038/ncomms11483。

OSCP对阿尔茨海默病线粒体F1FO-ATP合成酶的调控

西蒙·J·贝克 1, 兰果 1, 阿伦·芬西 2, 景天 1, 卢旺（Lu Wang） 1 三, 尼哈·坦登 1, 埃沙·高巴 1, 林璐 1 三, 胡安·帕斯夸尔 4, 斯文·科伦尔 2, 恒都 1 三
附属公司

OSCP对阿尔茨海默病线粒体F1FO-ATP合成酶的调控

西蒙·J·贝克等。 国家公社. .

摘要

F1FO-ATP合成酶对线粒体功能至关重要。这种酶的放松调节导致线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）减弱和线粒体通透性转换（mPT）激活，这些缺陷伴随阿尔茨海默病（AD）。然而，连接F1FO-ATP合成酶功能障碍和AD的分子机制尚不清楚。在这里，我们观察到在AD个体和AD小鼠模型中，F1FO-ATP合成酶的寡霉素敏感性相关蛋白（OSCP）亚单位选择性丢失，以及OSCP与淀粉样β（Aβ）的物理相互作用。OSCP水平的变化在神经元线粒体中更为明显。OSCP的丢失及其与Aβ的相互作用破坏了F1FO-ATP合成酶，导致ATP生成减少、氧化应激升高和mPT激活。OSCP的恢复改善了Aβ介导的小鼠和人类神经元线粒体损伤以及由此产生的突触损伤。因此，与AD进展相关的线粒体F1FO-ATP合成酶功能障碍可以通过OSCP稳定来预防。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。AD受试者和5xFAD小鼠脑线粒体OSCP缺失。
(一)非AD、MCI和AD患者颞叶蛋白提取物中OSCP免疫反应带的密度定量。β-肌动蛋白用于指示蛋白质的负载量。下面板代表6名非AD患者、6名MCI患者和4名AD患者。(b条)在人颞叶脑切片上使用抗OSCP的免疫组织化学染色显示，神经元中的OSCP显著降低。右侧面板显示具有代表性的图像。比例尺，40μm。(c（c）,d日)OSCP免疫反应带的密度定量显示突触中OSCP的年龄依赖性降低(c（c）)和非突触(d日)5xFAD小鼠的线粒体。TOM40用于显示线粒体部分的富集。考马斯蓝染色显示线粒体蛋白的负载量。实验中使用了5只4个月龄的非Tg和5只5xFAD小鼠，以及5只9个月龄非Tg的和6只5xFAD小鼠。误差条代表标准误差。
图2
图2。OSCP缺乏影响神经元线粒体功能。
(一)用携带OSCP shRNA的慢病毒（OSCP KD，OSCP击倒神经元）下调原代培养小鼠神经元中OSCP的表达，并用携带非靶点shRNA的慢性病毒处理对照神经元。n个=6–9个样本。下面板显示OSCP免疫反应带的代表性图像。TOM40用作加载控制。(b条)OSCP下调导致线粒体膜电位降低。n个=来自至少三个独立实验的36–51个神经元。右侧面板显示TMRM染色和相位对比图像的代表。比例尺，20μm。(c（c）)OSCP缺乏也导致神经元ATP生成减少(n个=来自至少三个独立实验的13-22个样本）。(d日)OSCP缺乏导致线粒体超氧化物水平升高(n个=至少三个独立实验中的10-15个神经元）。右侧面板显示了线粒体红染色的代表性（红色）。NISSL（蓝色）用于识别神经元。比例尺，20μm。(e（电子）)OSCP缺失导致神经炎线粒体数量减少。右侧面板显示MAP2（绿色，树突）和Mito-Dsred（红色，线粒体）染色的代表性图像。n个=来自至少三个独立实验的27–43个神经元。比例尺，20μm。(（f）)mPTP的形成通过暴露于2μM离子载体中线粒体钙黄绿素强度的下降来证明。在1μM时使用CsA*P（P）与OSCP KD神经元相比，在有或无CsA的情况下<0.01。#P（P）与CsA治疗的对照神经元相比，<0.05。n个=5–10个独立实验。误差条代表标准误差。
图3
图3。OSCP缺乏影响突触功能。
(一)OSCP缺失导致突触密度下降。vGlut1（蓝色）和PSD95（红色）染色分别用于识别突触的突触前和突触后成分。通过MAP2（绿色）染色鉴定神经树突。比例尺，5μm。n个=27-43个来自至少三个独立实验的神经元。(b条–e（电子）)OSCP缺失影响mEPSCs。(b条)对照组（上面板）和OSCP KD神经元（下面板）中mEPSCs的代表性痕迹。比例尺代表200 ms和20 pA。数据采集自至少三种不同培养物中的10个控制神经元和7个OSCP敲除（OSCP KD）神经元。(c（c）)mEPSC频率的定量分析。(d日)mEPSC振幅的定量分析。(e（电子）)mEPSC振幅分布的累积分数分析。(（f）)OSCP的丢失降低了谷氨酸喷雾剂诱发的EPSCs的振幅。比例尺代表500 ms和100 pA。从7个控制神经元和8个OSCP KD神经元收集数据。右侧面板显示了EPSC振幅的定量分析。误差条代表标准误差。
图4
图4。OSCP/Aβ相互作用影响OSCP功能体内和在体外.
(一)AD患者颞叶OSCP和Aβ的联合免疫沉淀。结果显示了三名非AD患者和三名AD患者的代表性。Aβ1–42肽和AD脑提取物用作Aβ免疫反应带的阳性对照。(b条)5xFAD小鼠新皮层中OSCP和Aβ的共免疫沉淀。结果显示，每组有三只小鼠具有代表性。Aβ1-42肽被用作Aβ免疫反应带的阳性对照。(c（c）)5xFAD小鼠新皮层和海马中OSCP（绿色）和Aβ（红色）的染色。通过NISSL染色（蓝色）鉴定神经元。比例尺，10μm。(d日)OSCP和Aβ相互作用由在体外下拉测定。(e（电子）)给出了成熟OSCP蛋白的氨基酸残基数（去除了已知的线粒体信号肽）。SP是线粒体信号肽。野生型OSCP和OSCPΔ107–121用于下拉分析。与野生型OSCP相比，OSCPΔ107–121显示出与Aβ相互作用的能力降低。(（f）)体外下拉分析显示，Aβ1-42抑制OSCP，但不抑制OSCPΔ107-121结合α和β亚单位的能力，如α和β免疫反应带减少所示。n个=每组6–10个样本。误差条代表标准误差。
图5
图5。5xFAD小鼠突触线粒体中F1FO-ATP合成酶的失调。
(一)5xFAD小鼠突触线粒体的呼吸控制率（RCR）随年龄增长而降低。使用6只4个月龄的非Tg和5只5xFAD小鼠以及6只9个月龄非Tg或5只5x FAD小鼠。(b条)5xFAD小鼠的突触线粒体具有ATP合成的年龄依赖性降低。实验中使用了6只4个月龄的非Tg和6只5xFAD小鼠，以及6只9个月龄非Tg小鼠和7只5xFAD小鼠。(c（c）)来自5xFAD小鼠的突触线粒体在4个月大时表现出F1FO-ATP合成酶催化活性的早期下降，而在9个月大的时候则加剧了这种下降。实验中使用了每组5只4个月大的小鼠和7只9个月大非Tg和9只5xFAD小鼠。(d日)5xFAD小鼠突触线粒体低聚肌球蛋白敏感性呼吸的年龄依赖性增加。实验中使用了6只4个月龄的非Tg和5只5xFAD小鼠，以及6只9个月龄非Tg的和5只5 xFAD的小鼠。(e（电子）,（f）)4岁时5xFAD小鼠突触线粒体对寡霉素敏感性降低(e（电子）)和9个月大(（f）). 所有数据均以相应的经载体处理的线粒体组分的活性百分比表示。实验中使用了6只4月龄的非Tg和5只5xFAD小鼠，以及7只9月龄的nonTg和7只5xFAD小鼠。(克,小时)5xFAD小鼠突触线粒体中F1离解增加。(克)游离F1的分析。(小时)左面板是从7只4个月龄的非Tg和6只5xFAD小鼠以及6只9个月龄非Tg或6只5x FAD小鼠收集的图像的代表。用抗β亚单位抗体和条带分子量检测F1。相同数量的样品用于SDS-PAGE，检测Tom40和β亚基以显示线粒体蛋白质的装载量。右侧面板是免疫印迹前的考马斯蓝染色，以指示样品的装载量。误差条表示s.e.m。
图6
图6。OSCP过度表达可改善Aβ诱导的小鼠神经元线粒体功能障碍。
将小鼠皮层神经元暴露于500 nM低聚物Aβ1–42中24 h(一)通过OSCP过度表达减弱低聚物Aβ1-42诱导的OSCP降低。Western blot图像显示小鼠初级神经元中OSCP的表达水平，这代表了每组中的七个样本。(b条)显示原代培养神经元中OSCP（绿色）的免疫荧光染色。COXIV（红色）用于确定OSCP在线粒体中的定位*P（P）与其他组相比，<0.01。比例尺，20μm。(c（c）)OSCP过度表达保护线粒体膜电位免受低聚物Aβ1-42毒性的影响。代表性图像的上面板显示TMRM染色，下面板显示相位对比图像。比例尺，20μm*P（P）与其他组相比，<0.01。n个=来自至少三个独立实验的40–64个神经元。(d日)OSCP过表达保护神经元ATP减少免受低聚物Aβ1-42毒性的影响*P（P）与其他组相比，<0.01。n个=来自至少三个独立实验的每组12个样本。(e（电子）)OSCP过度表达减弱Aβ诱导的神经炎线粒体数量减少*P（P）与其他组相比，<0.01。n个=至少三个独立实验中的22–27个神经元。上部代表性图像显示了MAP2（绿色，树突）和Mito-Dsred（红色，线粒体）的合并染色。比例尺，20μm。中间的面板显示Mito-Dsred染色，最下面的面板显示指示区域的放大图像。(（f）)OSCP过度表达改善了Aβ致敏mPTP的形成。使用离子载体（2μM）触发mPTP形成*P（P）与车用治疗对照组和OSCP OE神经元相比，<0.05。#P（P）与Aβ处理的OSCP OE神经元相比，<0.05。n个=4-6个独立实验。控制是指携带主干载体的控制慢病毒感染的神经元。OSCP OE是指携带OSCP cDNA的慢病毒感染的神经元。误差条代表标准误差。
图7
图7。OSCP过度表达可保护小鼠神经元免受Aβ诱导的突触功能障碍。
(一)减弱Aβ诱导的OSCP OE神经元突触密度降低*P（P）与其他组相比，<0.01。n个=从至少三个独立实验中收集的26–43个神经元。通过vGlut1（蓝色）和PSD95（红色）染色对突触进行可视化，以分别识别突触的突触前和突触后成分。神经树突由MAP2（绿色）测定。比例尺，5μm。(b条–e（电子）)OSCP过表达保护mEPSCs免受Aβ毒性的影响。(b条)Aβ存在或不存在时，对照和OSCP OE神经元mEPSC记录的代表性痕迹。比例尺代表200 ms和20 pA。数据收集自10个经车辆处理的控制神经元、8个经Aβ处理的控制神经细胞、7个经车辆治疗的OSCP OE神经元和8个经Bβ处理的OSCP EO神经元。(c（c）)mEPSC频率的定量分析。(d日)mEPSC振幅的定量分析*P（P）与其他组相比<0.05。(e（电子）)mEPSC振幅分布的累积分数。(（f）)OSCP的过度表达阻止了由Aβ毒性引起的谷氨酸诱发的EPSCs振幅的降低。比例尺代表500 ms和100 pA。数据收集自7个经载药处理的控制神经元、9个经Aβ处理的控制神经细胞、5个经载药量处理的OSCP OE神经元和7个经Aα处理的OSCC OE神经元。误差条代表标准误差。
图8
图8。OSCP过度表达可改善Aβ诱导的人类神经元线粒体功能障碍。
(一)将人类神经元暴露于500 nM低聚物Aβ1-42中4天，然后进行OSCP水平的免疫印迹检测。Aβ诱导OSCP表达水平显著降低。下面板显示典型的免疫印迹图像。Tom40被用作加载控件。n个=每组4-5个样本。(b条)Aβ处理的人类神经元中OSCP和Aβ的共免疫沉淀。(c（c）)在OSCP过表达的神经元中显著增加了OSCP的表达。下面板显示典型的免疫印迹图像。Tom40被用作加载控件。n个=每组4个样本。(d日)OSCP过表达保护了ATP的生成*P（P）与其他组相比，<0.01。n个=每组6–10个样本。(e（电子）)OSCP过度表达保护线粒体膜电位*P（P）与其他组相比，<0.01。n个=17–23个神经元，来自至少3个时间无关的实验。右侧面板是TMRM染色（上排）和相位对比（下排）的代表性图像。比例尺，20μm。(（f）)OSCP OE保存了神经炎线粒体种群*P（P）与其他组相比，<0.05。右侧面板是具有代表性的图像。用MAP2（绿色）染色法检测树突状结构；线粒体经线粒体DNA（红色）鉴定。比例尺，20μm。(克)OSCP过表达减弱了Aβ致敏mPTP的形成。使用离子载体（2μM）触发mPTP形成*P（P）与车用治疗对照组和OSCP OE神经元相比，<0.05。#P（P）与Aβ处理的OSCP OE神经元相比，<0.05。n个=4–7个独立实验。误差条代表标准误差。
图9
图9。示意图概要。
随着AD的进展，在与AD相关的条件下，脑线粒体逐渐经历OSCP丢失和Aβ积累。OSCP丢失和OSCP/Aβ相互作用损害OSCP功能以保持F1FO复合物的完整性。这导致严重的线粒体功能障碍，包括ATP生成减少、线粒体膜电位降低、ROS生成和释放增加，以及线粒体通透性转换孔形成激活。这种线粒体放松调节会导致神经元功能减弱，最终导致神经元死亡。
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