瑞士法郎8抑制组蛋白H3赖氨酸36三甲基化并改变RNA选择性剪接

染色质免疫沉淀和测序（ChIP-seq）

使用以下描述的协议执行ChIP(42)，稍作修改。简言之，～25×10⁶iPSC衍生NPC、控制和Shs-瑞士法郎8用1%甲醛固定，室温下旋转培养10min。通过加入1.1ml 2.5M甘氨酸并在室温下旋转孵育5分钟来终止交联。细胞以1000 rpm的速度造粒，再悬浮在冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）/蛋白酶抑制剂（PI）中，以1000 rpm旋转5 min，用冰镇PBS洗涤两次，收获、造粒并直接再悬浮在300μl裂解缓冲液/PI中[50 mM Tris–HCl（pH 8.1），1%十二烷基硫酸钠（SDS），10 mM EDTA]，在冰上保持10分钟，偶尔旋转，每3分钟剧烈旋转15秒。使用生物破坏者声波仪（Diagenode）对200–700 bp样本涂片进行声波处理，在满功率条件下进行总共45分钟的声波处理，声波处理周期为30 s开/30 s关。样品在4°C下以最大速度离心10分钟。然后，将剪切的染色质在补充有PI的ChIP稀释缓冲液【16.7 mM Tris–HCl（pH 8.1）、167 mM NaCl、0.01%SDS、1.1%Triton X-100、1.2 mM EDTA】中稀释10倍。取出50μl等分的剪切染色质，作为对照等分（INPUT）保存在4°C下。将每个样品与感兴趣的抗体（20μg/ChIP）在4°C下孵育过夜。使用了以下主要抗体：H3K27me3（07-449，Millipore）、H3K4me3（Ab8580，Abcam）、H3 K36me3（Ab9050，Abcam）、H4K4me2（Ab7766，Abcan）、H3+4me1（Ab8895，Abca姆）和H3K17ac（Ab4729，Abcam.）。用Dynabeads蛋白A珠（Invitrogen）沉淀染色质-抗体复合物，并依次用低盐[20 mM Tris–HCl（pH 8.1）、150 mM NaCl、0.1%SDS、1%Triton X-100、2 mM EDTA]、高盐[20 m M Tris-HCl（PH8.1）、500 mM NaC1、0.1%十二烷基硫酸钠、1%Trion X-100、2mM EDTA]、LiCl[10 mM Tris-HCl（pH 8.1）、0.25 M氯化锂、1%NP-40、1%去氧胆酸钠、1 mM EDTA]和TE洗涤缓冲液[10 mM Tris–HCl（pH 8.0）、1 mM-EDTA]。然后在洗脱缓冲液[TE加1%SDS、150 mM NaCl、5 mM二硫苏糖醇（DTT）]中洗脱免疫沉淀染色质和INPUT样品，在65°C下脱交联过夜，并用蛋白酶K处理。使用苯酚：氯仿：异戊醇进行DNA分离。用200 mM NaCl沉淀DNA，补充30μg糖原，用乙醇洗涤，然后用RNase I（Invitrogen）处理。最后，用MinElute试剂盒（Qiagen）纯化DNA。使用Qubit 2.0荧光计系统（Invitrogen）对ChIP和INPUT DNA进行定量。按照制造商的说明，使用NEBNext UltraII DNA文库制备试剂盒（Illumina）从5 ng片段DNA开始制备ChIP-seq文库，无需修改。为了获得足够的材料进行测序，对适配器样片段进行了八次聚合酶链反应（PCR）扩增。

组蛋白标记的ChIP-seq分析

使用BWA（版本0.7.15）在人类基因组参考组件GRCh38上对齐ChIP-seq读数(43). 对对齐读取进行过滤，以丢弃未映射、多重映射、PCR重复读取（Picard tools MarkDuplicates版本：2.3.0，Picard Toolkit.2019）。GitHub知识库Broad Institutehttp://broadinstitute.github.io/picard网站/)以及低质量对齐（samtools视图-q 1，samtoolsversion 1.71.7）(44). MACS2（版本2.1.0）使用最小FDR（错误发现率；Benjamini–Hochberg调整P（P）-值）阈值为0.00001。H3K27me3和H3K36me3标记使用了相同的设置，并添加了-宽选项(45). 局限于黑名单地区的峰值(http://mitra.stanford.edu/kundaje/akundaje/release/blacklists/)或未定位的挫伤被过滤掉。小于350 bp的窄峰（对于H3K27ac、H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3组蛋白标记）合并为一个单一峰[BEDTools merge（版本2.25.0）]。如果峰重叠了最短峰长度的至少50%[BEDTools intersect（版本2.25.0）]，则认为重复之间的峰是常见的，然后保持扩展坐标并用于下游分析。CHD8 ChIP-seq读取自(11)将[BWA（版本0.7.15）]重新对准参考GRCh38，并使用与窄组蛋白标记相同的程序调用峰，默认的FDR阈值为0.05，因为只保留了所有三种抗体识别的峰。GENCODE v.26用于峰值注释(46). 丢失H3K4me1、H3K27ac和H3K36me3的基因在瑞士法郎8利用clusterProfiler[版本3.10.1(47)]Benjamini–Hochberg调整后P（P）-值截止值为0.05。2019年9月9日，从Ensemb BioMart下载了使用的slimGO术语的完整列表。使用单尾Fisher精确检验在自定义基因集上评估相同基因列表的富集度。自定义基因集来自公共数据库和感兴趣的出版物(补充表S1). 只有非冗余基因列表在P（P）-值<0.01如图所示​图1G；1G个; 完整的浓缩结果可在补充表S1结合基因组上的组蛋白标记富集模式，确定了10种染色质状态作为对照（Sh-GFP公司和Sh-GFP公司2） 使用ChromHMM（版本1.14）(48). 根据文献手动注释状态。使用BEDTools intersect（版本2.25.0）计算每个组蛋白标记在两个重复中这些区域中调用的峰数(49)，以及控制和瑞士法郎8计算击倒率。每个组蛋白标记的总峰数（以百分比表示）绘制为对照细胞中的热图（图​（图1B，1B年，左）；差异（图​（图1B，1B年，右）是指控制峰值的百分比-瑞士法郎8KD峰值。每个标记在每个染色质状态下的峰数用双面测试吨-测试（python 3.6 scipy.stats.ttest_ind），考虑控件和瑞士法郎8击倒。对三个样品进行了H3K36me3的差异富集分析瑞士法郎8击倒样品（Sh1-瑞士法郎8，第2页-瑞士法郎8和Sh4-瑞士法郎8)和两个控件（Sh-GFP公司和Sh-GFP2公司)带有DiffBind[版本2.14(50,51)]和DESeq2用于差分分析，使用MACS2之前称为的峰，存在于至少两个样品中。FDR<0.05的峰值被视为差异富集。图中的火山图​图11用ggplot2绘制[版本3.3.2(52)]. 要使用deepTools 3.2.1版生成元基因配置文件(53)，使用SES方法将ChIP-seq样本归一化为INPUT(54). 在基因体上方的10 bp箱子中计算富集度，缩放到基因上游和下游的5 kbp和2 kbp。为了最大限度地减少元基因图谱中的噪声，在绘制之前，对蛋白质编码基因应用了一组严格的过滤器：最小长度为2kbp，与其他基因的最小距离为4kbp，并且在相反链上没有其他特征，从而产生了一组9442个蛋白质编码基因。对于每个组蛋白标记，只绘制了富集的基因（至少一个非零bin）。基于CHD8结合富集模式，通过k-means和deepTools plotProfile命令将这些基因分为三组。为了补充统计假设检验，计算了整个区域各组之间的成对Cohen d效应大小统计(55). 99%的同时置信区间是在控制FWER（Bonferroni校正）的情况下构建的。使用deepTools computeMatrix参考点计算CHD8-结合位点剖面，并使用deep工具plotProfile绘制。染色质富集轨迹的可视化使用综合基因组查看器[IGV，2.4.9版(56)].

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图1。

瑞士法郎8抑制显著影响组蛋白H3K36me3在转录延伸位点的富集。(A类)本研究中使用的研究设计和整合方法的示意图瑞士法郎8（Sh1-、Sh2-和Sh4-瑞士法郎8)和控制hiNPC（Sh-GFP公司和Sh-GFP2公司) (11)，通过ChIP-seq分析了代表不同染色质区域的六个组蛋白标记：活性启动子（H3K4me2和H3K4me3）、非活性启动子（H3K27me3）、增强子（H3K4me1和H3K27ac）和活性转录区域（H3K36me3）。随后将ChIP-seq结果与CHD8-结合位点和从同一模型系统获得的可用转录组学（RNA-seq）数据集整合(11). (B类)热标记代表10种不同的染色质状态（1，转录起始；2，转录延伸；3，弱转录；4，强增强子；5，弱/平衡增强子a；6，弱/稳定增强子b；7，活性启动子；8，非活性/稳定启动子；9，多梳被抑制；10，异染色质/低信号），由ChromHMM定义的对照hiNPC中不同组蛋白标记的组合确定(48). 组蛋白标记峰在不同染色质状态中的分布（详见材料和方法）以占总数的百分比表示，并在热图中进行了彩色编码（左）。右侧的热图描述了两种实验条件（对照组与瑞士法郎8击倒）。对照组中富集的染色质状态用蓝色表示，染色质状态富集于瑞士法郎8橙色击倒。转录延伸中的H3K36me3被确定为受影响最大的染色质状态。(C类)条形图表示在转录起始（左）、延伸（中）和弱转录（右）基因组区域确定的每个组蛋白标记的峰值数量。灰色条表示控件(n个=2，Sh-GFP公司和Sh-GFP2公司)白色条表示瑞士法郎8击倒(n个=2，第2页-瑞士法郎8和Sh4-瑞士法郎8). H3K36me3峰值损耗瑞士法郎8在转录延伸状态（两个生物复制，吨-测试，P（P）<0.05). (D类)火山图报告了DiffBind检测到的H3K36me3的差异富集峰(50,51). 显著不同的峰值（FDR<0.05）以黑色显示。无显著差异的峰值（ns，FDR>0.05）显示为灰色。虚线水平线表示FDR=0.05。峰富集于瑞士法郎8图的右侧显示了与控件相比的击倒，log2为正（FC）。年耗竭的峰值瑞士法郎8击倒（在控件中丰富）显示在图的左侧，带有负数log2（FC）。(E类)图示组蛋白总水平（H3K36me3和H3总量）的代表性图像，对比对照组（Sh-GFP公司)和瑞士法郎8击倒克隆（Sh1-瑞士法郎8，第2页-瑞士法郎8和Sh4-瑞士法郎8)来自蛋白质印迹实验。与对照Sh相比，H3K36me3的还原水平以FC表示-GFP公司.装载了相当数量的总蛋白。总组蛋白H3用作负荷对照。H3K36me3暴露=20 s；H3总暴露时间=20秒(F类)图表中的条形图表示相对于Sh的标准化H3K36me3（相对于组蛋白H3总量）值-GFP公司控制。独立生物复制的平均值±SE(n个=4（对于Sh4）-瑞士法郎8和n个=6（对于其他样本）。A类吨-对两个平均群体进行了检验*P（P） ≤0.05. (G公司)热图代表基因集富集P（P）-以下缺失H3K36me3（如D）的所有基因的–log10标度值瑞士法郎8击倒。如材料和方法所述，对与自闭症、神经发育、脑内共表达模块和功能丧失耐受性相关的基因列表进行了富集测试。完整的基因列表描述和富集结果可在补充表S1.

RNA-seq和AS数据分析

从Sugathan获取的原始读取等。(11)对于相应的样本（Sh-GFP公司，Sh-GFP2公司，第1页-瑞士法郎8，第2页-瑞士法郎8和Sh4-瑞士法郎8)被kallisto用来计算转录物丰度（版本0.44.00）(57)GENCODE v.26抄本。来自sh的RNA-seq的超脚本RSEM标准化读取计数-hnRNPL公司HepG2和K562人类细胞系中的对照样品来自ENCODE（ID:ENCSR155BMF和ENCSR563YIS）。百万分转录本（TPM）用于绘制表达水平。RNA-seq库来自hnRNPL公司小干扰RNA（siRNA）处理样品（si-hnRNPL公司-C） 用TRIZOL（Invitrogen）分离的总RNA经DNase（AMBION）处理后，获得si-scrambled control（si-SCR）。用安捷伦生物分析仪评估RNA质量（RNA完整性数从7.8到9.2）。根据Illumina stranded mRNA Prep制造商的方案，从100ng纯化的总RNA开始制备Illumina文库。使用Illumina RNA UD Indexes的IDT，配体试剂盒（Illumina）对样品进行条形码。文库质量通过DNA 1000试剂盒和2100生物分析仪（安捷伦科技公司）进行检查。100 bp配对测序由Novaseq 6000系统（Illumina）在意大利理工学院（IIT，Genova，Italy）基因组学设施进行，每个样本获得约5000万到6000万个读数。SUPPA（2.3版）用于通过经验方法计算每个剪接事件的拼接百分比（PSI）值(58). 为P（P）-值<0.05且ΔPSI>0.2。Sugathan的原始读数相同等人。(11)与STAR（版本2.6）一致(59)使用GRCh38参考上的默认参数，使用rMATS[版本3.1.0]分析AS(60)]. 由于这两种As分析方法是互补的(https://github.com/comprna/SUPPA/issues/47)，这两项都包括在分析中。为了检查剪接事件与染色质标记的重叠，剪接的进出外显子坐标与组蛋白标记峰的坐标相交。AS事件通过ggsashimi（版本0.4.0）在生鱼片图中表示(61)使用GENCODE注释v.33作为参考(46).

苏特林原始读取等。(14)来源于P5小鼠皮层（GSE81103；样品P5HET 1、P5HET2、P5WT 1和P5WT2），以及Sood的读数等。(62)按照前面的描述处理分化的小鼠NPC（GSE155217；样品RNA_WT_NPC_rep1、RNA_VT_NPC_rep2、RNA_CHD8_Het_NPC_rep1和RNA_CHD8_Het-NPC_ref2），并用于验证分析(补充图S10). 通过使用从BioMart获得的转换表（包含两个物种的集合ID），将来自这两个数据集的小鼠基因转换为相应的人类同源基因(http://www.ensembl.org（英语）)：GRCh38.p13和GRCm39数据集（103版）用于转换(63).

RBP图案匹配

匹配来自CISBP-RNA数据库的人类RBP的已知图案(64)，通过Biopython软件包v1.78获得(65)以95%的相似度和0.001的假阳性率作为阈值。通过考虑剪接事件中涉及的外显子的100 nt上游和下游，通过BioMart biomRt R包提取，获得进行匹配的序列(66).

ChIP qPCR

在显示H3K36me3富集显著缺失和至少一个显著差异剪接事件（SUPPA v2.3 RNA-seq分析结果，0.30ΔPSI阈值）的基因组区域上选择了用于ChIP定量PCR（qPCR）实验验证的候选基因。ChIP-seq和RNA-seq中信号变异最大的基因被优先排序。检索显示显著H3K36me3峰值丢失的基因组区域的FASTA序列，并将其作为模板，用于使用NCBI primer-BLAST工具设计ChIP qPCR引物(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast网站/)、和生物信息学用NCBI BLAST进行特异性筛选(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi网站)和UCSC In-Silico PCR工具(https://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr). 扩增子大小通过电泳凝胶运行测试，序列特异性通过Sanger测序（Eurofins）验证。使用200 pg ChIP DNA和等量未富集的INPUT DNA进行qPCR分析，反应体积为10μl，与iTaq™Universal SYBR®Green Supermix（Biorad）使用Thermal Cycler C1000 CFX384或CFX96（Biorad）上的推荐热循环参数。用CFX Manager v3.1软件进行qPCR分析。至少分析了两个qPCR技术复制品，其内变异<0.5 Cq。两个基因沙漠地区hGD12（chr12:61273372–61273435）和hGD4（chr4:187946873–187946954）被用作阴性对照。使用2计算INPUT上的折叠富集^–ΔΔCq方法。根据条件，分析每个细胞克隆的两个或三个生物复制品。图中的误差条表示平均值的标准误差（SEM）。

RNA提取、反转录和半定量PCR

如上所述，差异剪接实验验证的候选基因在ChIP qPCR目标中优先排序。对于外显子跳过事件（SE），利用IGV（2.4.9版）从GENCODE注释v.33中检索到不变上游和下游外显子的FASTA序列（相对于差异事件中涉及的外显子），并分别用作正向和反向引物设计的模板，为了扩增“剪接入”和“剪接出”转录亚型。按照制造商的指示，使用TRIZOL试剂（Invitrogen）从iPSC-derived NPC株系中提取总RNA。通过在37°C下用DNase I（Invitrogen）和RNase抑制剂SUPERase（Invit罗gen）处理样品30分钟，然后用RNase Mini Kit（Qiagen）纯化，去除DNA污染。通过琼脂糖凝胶电泳运行和安捷伦2100生物分析仪评估RNA质量。使用SensiFAST cDNA合成试剂盒（Bioline）逆转录1μg等分RNA。通过使用Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix（Thermo Scientific），使用得到的cDNA进行半定量PCR。TATA-结合蛋白（TBP）作为参考基因。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离。使用ImageJ软件（版本1.46r）通过密度分析评估靶转录物的ΔPSI，并与Sh相对-GFP公司行作为参考样本。数据表示为每个拼接事件计算PSI值的平均值±SEM。单侧吨-使用Excel进行测试；显著性水平报告为不显著（NS）P（P） >0.05, *P（P） ≤0.05, **P（P） ≤0.01, ***P（P） ≤0.001, ****P（P） ≤0.0001.

酸性萃取和western印迹分析

用PBS清洗hiNPC，并将其重新悬浮在100μl提取缓冲液中[10 mM HEPES pH 8，10 mM MgCl₂、0.1 mM EDTA pH值8、0.1 mM DTT和停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（生命科技）]。样品在4°C下以5000 rpm离心10分钟，以去除细胞溶质部分。将核芯块重新悬浮在0.2 N HCl中，并在4°C下旋转过夜。在4°C下以4000 rpm离心10分钟后，回收含有核蛋白的上清液。蛋白质通过Bradford蛋白质检测试剂盒（Sigma-Aldrich）定量。蛋白质样品由4–12%Bis–Tris蛋白凝胶（Thermo Fisher）分离，并转移到Amersham™Protran™0.45μm硝化纤维素（GE-Healthcare）膜上。用5%w/v无脂奶粉封闭膜，并用以下主要抗体培养：抗CHD8（NB100-60417，Novus Biologicals）（1:1000）、抗HSP90（4874S，细胞信号技术）（1:5000）、抗组蛋白H3（1:1.000）（4499，细胞信号技术）和抗组蛋白H3K36me3（1:1.00）（Ab9050，Abcam）。使用辣根过氧化物酶缀合的第二抗体抗兔IgG 1:7500（GTX213110-01，GeneTex）检测蛋白质，并按照制造商的说明通过ECL Select WB检测试剂（GE Healthcare）进行可视化。使用Imagelab软件（BIORAD，5.2.1版）进行信号量化。

统计分析

蛋白质印迹实验中的目标蛋白差异分析通过执行非配对、单尾吨-测试。总共吨-经检验，显著性水平设为0.05。数据以平均值±标准差（SD）表示。显著性水平报告为：NSP（P） >0.05, *P（P） ≤0.05, **P（P） ≤0.01, ***P（P） ≤0.001.

细胞分馏

使用中描述的方案进行细胞分馏(67)稍作修改。简言之，50×10⁶将细胞重新悬浮在5 ml低渗裂解缓冲液中[HLB最终成分浓度：10 mM Tris（pH 7.5）、10 mM NaCl、3 mM MgCl₂，0.3%（v/v）NP-40和10%（v/v）甘油]补充PI和磷酸酶抑制剂（PhI）。悬浮液在冰上孵育8分钟，然后在4°C下在800℃下离心10分钟克.将含有细胞质部分的上清液与含有原始核部分（RNF）的颗粒分离。然后用HLB清洗RNF三次，并在800℃下离心2分钟克温度为4°C。将颗粒重新悬浮在2.5 ml核溶解缓冲液中[NLB，最终成分浓度：20 mM Tris（pH 7.5），150 mM KCl，3 mM MgCl₂0.3%（v/v）NP-40和10%（v/v）甘油]补充PI和PhI。在18000离心之前，使用Q700（Qsonica）对样品进行超声波处理克在4°C下保持30分钟。收集上清液作为核组分（NF）用于免疫沉淀和western blot分析。采用Pierce BCA蛋白检测试剂盒（生命技术），以牛血清白蛋白为标准曲线（Sigma），对NF蛋白浓度进行定量。对于western blot分析，使用含有5%Bolt样品还原剂（Life Technologies）的SDS-loading缓冲液LDS样品缓冲液（Invitrogen）在92°C下加热NF蛋白10分钟。将样品加载到带有蛋白质标记（Euroclone）的4–12%Bis–Tris蛋白凝胶（Thermo Fisher）上，并通过电泳分离样品。电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜（GE-Healthcare）。用一级抗体[CHD8 NB100-60417（Novus Biotechnology）、hnRNPL D-5（sc-48391，Santacruz）、SETD2（38633，SAB）、PARP1（9542，Cell Signaling Tech.）、Lamin A/C（sc-376248，Santarcuz），GAPDH（ABS16，Merck）、HSP90 3C9（BSM-51215M，Bioss）组蛋白H3（三甲基K36）（Ab9050，Abcam）隔夜孵育吸膜组蛋白H3（4499S，细胞信号技术）]，然后用含0.1%吐温的PBS洗涤三次，并用特异性二级抗体在4℃孵育1小时。

免疫沉淀和western印迹分析

对于每个免疫沉淀，将核部分中的1 mg总蛋白与1μg靶蛋白特异性一级抗体在4°C下旋转培养过夜。对于CHD8免疫沉淀，使用NB100-60417和NB100-604.18（Novus Biotechnology），对于hnRNPL D-5（sc-48391，Santacruz）和SETD2（38633，SAB），同时使用兔IgG同型对照（10500C，Life）或鼠IgG（10400C，Invitrogen）作为对照。蛋白A–Sepharose（CL-4B euroclone）或蛋白G-Sepharoze（GE-Healthcare）珠通过与NF在4°C下旋转培养45分钟来预先清除。然后取出珠子，并在37°C下用100μg/ml RNase A（Invitrogen）或2 U/ml DNase I（Invit罗gen）将清除的NF（CNF）处理15分钟，或直接用于与一级抗体（NF with antibody，NFA）的过夜培养。另一方面，在没有（未经处理的NT条件）或存在50μg/ml溴化乙锭（EtBr；Sigma-Aldrich）的情况下，将CNF与一级抗体孵育过夜。所有不同的NFA最终与珠子孵育45分钟，在4°C下旋转。然后用NLB缓冲液洗涤结合络合物三次。对于western blot分析，使用含有5%Bolt样品还原剂（Life Technologies）的SDS-加载缓冲液LDS样品缓冲液（Invitrogen）在92°C下洗脱干燥的Sepharose珠复合物10分钟。将样品加载在带有蛋白质标记（Euroclone）的3-8%三醋酸蛋白凝胶（Thermo Fisher）上，并通过电泳分离。电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜（GE-Healthcare）。用一级抗体[CHD8 NB100-60417（Novus Biotechnology）、hnRNPL D-5（sc-48391，Santacruz）和SETD2（38633，SAB）]培养滤膜过夜，然后用含有0.1%吐温的PBS洗涤三次，并用特异性二级抗体在4℃培养1小时。

样品制备和质谱

将共免疫沉淀的样品加载在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶上，运行约1cm。然后用考马斯对凝胶进行染色，并将整个染色区域作为一个样品切除。将切除的凝胶带切成小块（～1 mm^三)分别用10 mM DTT和55 mM碘乙酰胺进行还原和烷基化。然后在水中清洗凝胶片，用乙腈（ACN）脱水，并在快速真空中干燥。凝胶塞用50mM NH重新水合₄一氧化碳_三含有12.5 ng/ml胰蛋白酶（Promega）的冰溶液30分钟。在37°C下继续消化过夜。收集上清液，并用30%ACN、3%三氟乙酸（TFA）和100%ACN从凝胶中依次提取肽。所有上清液在SpeedVac中混合并干燥。然后用1%TFA将胰蛋白酶肽酸化至pH<2.5，在C18级尖端上脱盐，并在20μl 0.1%甲酸缓冲液中重新悬浮，用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS分析）。肽在Easy-nLC 1200高效液相色谱（HPLC；Thermo-Fisher）系统上通过85 min梯度和400 nl/min流速在25 cm柱上分离，柱内径75μm，内部填充ReproSil-Pur C18-AQ材料（3μm粒径，Dr Maisch，GmbH）。梯度设置如下：在流速为400 nl/min的情况下，在52 min内从5%到25%，在8 min内从25%到40%，在10 min内从40%到98%。缓冲液为水中0.1%的甲酸（a）和ACN（B）中0.1%的乙酸。在Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪（Thermo Fisher）中以数据依赖模式分析肽，在Orbistrap中以120 000 FWHM分辨率（200米/z)之后，在3 s的循环时间内进行一组（高能碰撞离解）MS/MS扫描。在350–1100的质量范围内进行全面扫描米/z，目标值为1×10⁶离子和最大注入时间为50 ms。在30%的碰撞能量、150 ms的最大注入时间（离子阱）和5×10的靶点下进行ms/ms扫描^三离子。

质谱数据分析和处理

使用Proteome Discoverer软件v.2.2.0（Thermo Fisher Scientific）搜索原始文件。针对生物信息学消化UniProt人类数据库（2019年7月下载）和包含常见污染物的数据库。选择胰蛋白酶/P作为五个缺失裂解的酶。研究中纳入了对氨基甲酰（C）进行静态修饰，并对氧化（M）和乙酰化（蛋白质N项）进行可变修饰。MASCOT搜索引擎[v.2.6.2（MatrixScience）]用于识别蛋白质，使用前体质量耐受性10 ppm和产品质量耐受性0.6 Da。在肽和蛋白质水平上将FDR设置为1%。过滤结果以排除潜在污染物。根据每个样品中特定蛋白质丰度的平均值对肽的峰值强度进行标准化(68). 通过复制并减去IP样品的IgG平均值，对单个肽的对数归一化强度进行平均；计算每个肽的折叠变化（FC）。然后，通过平均分配给每个蛋白质的所有肽的FC来计算每个蛋白质的FC。通过比较IP样品和IgG对照（IP/IgG）的倍增浓度来检测CHD8-结合伙伴。使用Student’s吨-检验（双尾，双样本不等距方差，Excel）。在单个重复的情况下，通过减去IP样品中IgG的对数2归一化强度来计算每个肽的富集度。如前所述计算统计显著性（学生吨-测试）。

瑞士法郎8组蛋白H3 Lys36三甲基化的抑制依赖性减少对CHD8-结合基因的影响

通过将人类CHD8结合位点叠加在先前建立的染色质状态上（图​（图1B），1B年)，我们确认CHD8仅限于活性启动子（90.11%）和较不显著的增强子[强、弱/稳定的a和b（3.18、3.00和1.34%）](补充图S5A) (11). 如前所述(74)，CHD8结合与高组蛋白H3K36me3相关(补充图S5B、E)和H3K4me3(补充图S5C，F)与CHD8-未结合基因相比，后基因图谱丰富，RNA表达水平升高(补充图S5D).

于瑞士法郎8严格定义的抑制（参见材料和方法）CHD8结合基因似乎比CHD8未结合基因更敏感（分别为988和4205），表现出显著降低的H3K36me3富集特征，如效应大小分析所证实的（图​（图2A，2安培,​，B；B类;补充图S6A). 值得注意的是，组蛋白H3K36me3的减少由瑞士法郎8抑制是特异性的，因为组蛋白H3K4me3是另一种富含高表达基因TSS的组蛋白修饰(补充图S7A、B)，保持不变(补充图S7C–E).

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图2。

瑞士法郎8抑制与H3K36me3富集减少相关，H3K36me3富集优先在CHD8结合的基因处。(A类,B类)后基因图谱显示了TSS上游和TES下游±2 kbp区域组蛋白H3K36me3富集的平均值（标准化ChIP值与INPUT控制的比例log2比值；另见材料和方法），用于控制（黑线）和瑞士法郎8敲除（灰线）hiNPC和CHD8-结合（#988）（A）和CHD8未结合基因（#4205）（B）。对照组H3K36me3富集与CHD8敲除之间的差异对于CHD8-结合基因而言是显著的，但对于CHD8未结合基因而言则不显著（成对Cohen d效应大小统计）。(C类)小提琴图表示通过k均值聚类的三组基因的CHD8结合富集水平[log2（ChIP/INPUT）]。由1239个基因组成的簇#1显示CHD8高度富集[平均值log2（ChIP/INPUT）=0.27]，由2429个基因构成的簇#2显示中到低CHD8富集[平均数log2（ChIP/INPUT）=–0.04]，由1380个基因组成，簇#3显示可忽略CHD8浓缩[平均值log2（ChI/INPUT）=–0.31]。(D类)Metagene图谱显示了TSS周围±2kbp区域内CHD8结合富集的平均值，如（C）所述，为#1、#2和#3三个簇计算。(E–G公司)后基因图谱显示了TSS上游和TES下游±2 kbp区域组蛋白H3K36me3富集[log2（ChIP/INPUT）]的平均值，为（C）中确定的三个簇中的每个簇的对照（黑线）和CHD8敲除（灰线）hiNPC计算。对照组H3K36me3富集与瑞士法郎8击倒对集群#1来说意义重大，但对集群#2或#3来说意义不大（成对的Cohen d效应大小统计，请参阅补充图S6B–D). (H（H）)柱状图显示了前20个生物过程GO术语在属于簇#1和簇#2的基因中显著富集，对照hiNPC中CHD8结合富集程度高/中等，H3K36me3富集程度低瑞士法郎8击倒（E和F）。根据–log10（已调整P（P）-值）和x个-轴表示每个术语的基因数。

基于对照hiNPC中CHD8-结合位点富集的聚类分析确定了三个不同的簇：簇#1由1239个CHD8高富集基因组成[mean log2（ChIP/INPUT）=0.27]，簇#2由2429个CHD8中富集到低富集基因组成[mean log 2（ChIP/INPUT）=–0.04]簇#3由1380个基因组成，CHD8富集可忽略不计[平均值log2（ChIP/INPUT）=–0.31]（图​（图2C2摄氏度D） ●●●●。引人注目的是，集群#1受到CHD8下降的强烈影响，整个基因体中H3K36me3水平显著降低（图​（图2E；第二版;补充图S6B). 相反，集群#2和#3在对照hiNPC中CHD8富集较差，显示出相应的H3K36me3富集较低，在以下情况下没有显著差异瑞士法郎8抑制（图​（图2F，2楼,​，G；G公司;补充图S6C、D). 总之，该分析证实CHD8-结合基因对CHD8减少非常敏感，H3K36me3组蛋白修饰显著而特异性下降（图​（图2C2摄氏度–D类;补充图S6B). 来自簇#1和簇#2的基因功能富集，即CHD8结合和CHD8抑制后H3K36me3缺失富集，突出显示了与“mRNA处理”和“RNA剪接”相关的GO生物过程术语（图​（图2H；2小时;补充表S1). 还介绍了来自簇#3的基因的功能富集(补充图S8).

诱导组蛋白H3 Lys36三甲基化减少瑞士法郎8抑制改变RNA AS

为了评估以下观察到的H3K36me3减少的功能重要性瑞士法郎8抑制，然后我们利用来自控制和瑞士法郎8-击倒克隆。组蛋白H3K36me3似乎与高水平RNA表达相关(补充图S7A) (75)，我们推断H3K36me3水平的下降与RNA表达水平的降低有关。CHD8水平意外降低，H3K36me3富集受损，这与CHD8-结合基因或CHD8--未结合基因转录的全球差异并不一致(补充图S9A–C).

重要的是，在瑞士法郎8抑制【462个基因，其中176个（38.1%）在启动子或增强子区域具有CHD8-结合位点】呈现出改变的AS图谱，这由两种分析方法证明（图​（图3A，3A级,​，B；B类;补充图S9D–F) (74,76). 我们注意到H3K36me3峰值的分布几乎相等瑞士法郎8外显子和内含子区域之间的抑制（数据未显示）。

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图3。

瑞士法郎8抑制引起的H3K36me3的减少与RNA AS的显著改变相关(A类,B类)维恩图表示以下失去H3K36me3峰值的基因之间的重叠瑞士法郎8敲除（丢失H3K36me3）和SUPA（AS SUPA）（A）检测到的表现AS事件改变的基因，以及CHD8结合基因（CHD8-bound）和SUPP（AS SUPP）检测到表现AS事件变化的基因之间的重叠（B）。每个条件下的基因数量都会显示出来。每个交叉点的富集显著性通过Fisher精确检验计算，并用颜色表示。彩色编码键：–log10(P（P）-值）。这个P（P）-报告价值和比值比。(C类)堆叠条形图表示SUPA检测到的1862个差异AS事件，按事件类型分布。SE，跳过事件；RI，保留内含子；MX，混合事件；A3，备选方案3′；A5，备选方案5′；AF，选择性第一外显子；AL，选择性最后外显子。(D类)条形图报告了位于所有差异剪接外显子±100 bp处的序列之间的重叠（all，浅灰色），CHD8差异剪接和结合的序列（AS结合，灰色）或H3K36me3差异剪接并丢失的序列（AS-K36，深灰色）和已知的RBP家族基序匹配。报告了六个最具代表性的RBP家族。每个条形图中显示了匹配序列的准确百分比。(E类)条形图表示GO生物过程和KEGG通路术语在SUPA检测到的AS事件发生改变的基因中显著丰富，并在以下情况下失去H3K36me3峰值瑞士法郎8击倒（H3K36me3丢失，顶部面板）或被CHD8束缚（CHD8绑定，底部面板）。钢筋根据调整后的尺寸进行订购P（P）-值（单位：log10）；这个x个-轴表示每个术语的丰富基因数。(F类)图像显示生鱼片图（顶部）、H3K36me3富集的染色质轨迹（中部）和ENSEMBL转录ID（底部）ITSN1号机组轨迹。Sh公司-瑞士法郎8样品与Sh-GFP公司控件是彩色编码的（分别为橙色和蓝色）。接头读数的数量显示在顶部面板上。绿色框和绿色箭头突出显示跳过的外显子事件。底部面板上的绿色箭头显示用于分析跳过外显子事件的引物的位置。(G公司)凝胶图像表示使用ITSN1号机组（顶部）和待定参考引物（底部）。使用ITSN1号机组引物集，获得与靶外显子内含子（351bp）和外显子跳过（138bp）相对应的两个扩增子。(H（H）)条形图报告Image-J PCR带定量ITSN1号机组使用标准化的成绩单待定作为参考基因。PSI（拼接百分比）是通过计算ITSN1号机组剪接入转录物和剪接入加剪接出事件的总和：PSI[in/（in+out）]。显示平均值±SE。单轨吨-使用NS进行测试P（P） >0.05, *P（P） ≤0.05, **P（P） ≤0.01. (我)条形图显示CHD8-ChIP qPCR量化后，CHD8在INPUT上的富集。ITSN1号机组基因组引物（F中的绿色箭头）和基因沙漠控制区(HGD4型和HGD12型)扩增Sh-瑞士法郎8和Sh-GFP公司条件。

绝大多数AS改变事件被归类为“替代第一外显子”[994（51.19%）]或“外显子跳跃”[283（15.71%）]（图​（图3C；3厘米;补充图S9F). 对于SUPA检测到差异剪接事件的～1000个基因（图​（图3A，3A级,​，B），B类)ΔPSI（ΔPSI=PSI_ctrl–PSI_KD）为正或负的事件比例[937个事件（52.03%）具有正值；864个事件（47.97%）具有负值]保持相当相似。有趣的是，与所有差异剪接外显子（all）相邻的±100 bp序列、CHD8差异剪接和结合（AS-binded）或H3K36me3差异剪接并丢失（AS-K36）的RBP基序匹配显示SRSFs、hnRNPs和ELAVs RNA结合蛋白富集，表明这些因子在观察到的表型中可能起调节作用（图​（图3D）。三维). 在以H3K36me3减少并伴随剪接改变为特征的基因中，GO术语和与“蛋白脱乙酰化”、“组蛋白脱乙酰基”和“蛋白脱酰基”相关的通路的过度表达（图​（图3E，第三方，顶部；补充表S1)被观察到，而那些被CHD8结合并呈现改变的剪接模式瑞士法郎8抑制因“mRNA分解代谢”、“翻译起始”和“RNA剪接调控”而增强（图​（图3E，第三方，底部；补充表S1). 直接比较特异性H3K36me3缺失峰和外显子呈现差异剪接事件，发现适度交叉(补充图S9G). 然而，在八个基因组坐标下，可以观察到H3K36me3和AS的同时减少，ΔPSI>0.30。具体来说，在ITSN1号机组位点，Intersectin 1基因参与内吞膜交通和突触传递(77,78)复杂的学习和记忆形成(79)也曾与精神分裂症有关(80)，证实了H3K36me3富集的明显减少，以及呈现敲低水平的hNPC中剪接变异体的PSI比率（剪接入/剪接入+剪接出）的相应增加瑞士法郎8（图​（图3F第三层–我).

异常的AS表型也反映在先前公布的小鼠数据集中(14,62). 明确地，第8章P5皮质区的基因消融(补充图S10A、C、D、F)和小鼠NPC（mNPC；补充图10B、C、E、F)引发AS模式改变，这种改变在数量上和AS亚型分布上与iPS-衍生NPC中描述的变化非常相似。对于P5皮质样本，检测到950（59.90%）个“替代第一外显子”和191（12.04%）个“外显子跳跃”事件。类似的值。即，在mNPC中观察到840（52.01%）个“替代第一外显子”和240（14.86%）个（外显子跳跃）。ΔPSI阳性或阴性的事件分布也保持相似（P5皮质标本中ΔPSI51.01%为阳性，48.99%为阴性，mNPC标本中△PSI阳性49.10%为阴性，50.90%为阴性）(补充图S10A、B)从而支持了以下假设瑞士法郎8/第8章抑制通常与AS缺陷相关，而与所考虑的物种无关。有趣的是，尽管在每个神经元模型系统中呈现剪接改变的基因通常不同（GO术语/通路在补充图S10G–I)尽管如此，一些测试的十字路口仍存在明显重叠（费希尔测试，补充图S10C–F)，暗示了一组核心基因，其中一半与CHD8结合（即。ITSN1号机组,CNOT2公司和MDM2型)参与“神经元分化”、“细胞周期”和“DNA修复”，对剪接改变非常敏感。

我们感谢Biagioli、Ferrari和Talkowski实验室成员的有益讨论，感谢Chiacchiera博士（特伦托大学CIBIO系）对手稿的批判性阅读。我们感谢CIBIO NGS设施的De Sanctis博士和Bertorelli博士对ChIP-seq文库的制备和测序提供的支持，感谢CIBIO-MS和蛋白质组学设施的Belli博士和Peroni博士对MS实验的帮助，以及CIBIO Cell Technology设施的Cardano和Cutarelli博士，帮助hiNPC培养和电穿孔。我们感谢意大利理工学院（意大利热那瓦IIT）基因组学设施的Vozzi博士为RNA-seq的制备和测序提供的帮助。我们感谢Stephen Haggarty博士（马萨诸塞州总医院和哈佛医学院，美国马萨诸塞州立大学波士顿分校）分享人类神经祖细胞系。M.A.B.感谢Danny Reinberg主持他休假，期间在mESCs上进行了CHD8 MS。