投资眼科视觉科学。 2022年3月； 63(3): 3.
阻塞性睡眠呼吸暂停对泪腺功能的影响 , 1 , 2 , 8 , 1 , 2 , 三 , 4 , 1 , 2 , 1 , 2 , 5 , 6 , 1 , 2 , 三 , 7 , 4 , 1 , 2 , 5 , 6 , * 和 1 , 2 , 5 , 6 , 8 王少潘 1 厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
2 厦门大学眼科与视觉科学福建省重点实验室，福建厦门
8 厦门大学人工智能研究所，中国福建厦门
新和 1 厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
2 厦门大学福建省眼科与视觉科学重点实验室，中国福建厦门
三 厦门大学附属第一医院眼科，厦门大学，厦门，中国福建
生张玉涵 1 厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
2 厦门大学眼科与视觉科学福建省重点实验室，福建厦门
胡娇月 1 厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
2 厦门大学眼科与视觉科学福建省重点实验室，福建厦门
5 厦门大学翔安医院眼科，厦门大学，厦门，中国福建
6 厦门大学附属厦门眼科中心，厦门大学，中国福建厦门
宗荣荣 1 厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
2 厦门大学眼科与视觉科学福建省重点实验室，福建厦门
井仪庄 三 厦门大学附属第一医院眼科，厦门大学，厦门，中国福建
安德鲁·J·库托克 7 英国威尔士加的夫市加的夫大学视光与视觉科学学院
魏丽 1 厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
2 厦门大学眼科与视觉科学福建省重点实验室，福建厦门
5 厦门大学翔安医院眼科，厦门大学，厦门，中国福建
6 厦门大学附属厦门眼科中心，厦门大学，中国福建厦门
刘祖国 1 厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
2 厦门大学眼科与视觉科学福建省重点实验室，福建厦门
5 厦门大学翔安医院眼科，厦门大学，厦门，中国福建
6 厦门大学附属厦门眼科中心，厦门大学，中国福建厦门
8 厦门大学人工智能研究所，中国福建厦门
1 厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
2 厦门大学福建省眼科与视觉科学重点实验室，中国福建厦门
三 厦门大学附属第一医院眼科，厦门大学，厦门，中国福建
4 福建省泉州市福建医科大学附属第二医院眼科
5 厦门大学翔安医院眼科，厦门大学，厦门，中国福建
6 厦门大学附属厦门眼科中心，厦门大学，中国福建厦门
7 英国威尔士加的夫市加的夫大学视光与视觉科学学院
8 厦门大学人工智能研究所，中国福建厦门
通讯作者。 SW、XH和QL对这项工作的贡献相等，因此应被视为第一作者。
收到日期：2021年10月17日； 2022年2月12日验收。
本作品是根据Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0国际许可证授权的。
补充资料 补充1
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摘要 目的 目的探讨阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSA）对泪腺功能的影响及其机制。
方法 7至8周龄雄性小鼠被关在具有周期性间歇性低氧的笼子中，以模拟阻塞性睡眠呼吸暂停综合征，而对照组则保持在正常环境中。 裂隙灯观察、荧光素染色和角膜敏感性检测用于评估角膜变化。 用酚红棉线检测泪液分泌，苏木精伊红染色、油红O染色、胆固醇和甘油三酯试剂盒、免疫荧光染色、免疫组织化学染色、实时聚合酶链反应、透射电镜观察泪腺病理变化， 和Western blot。
结果 研究表明，泪液分泌减少，角膜上皮缺损和角膜过敏。 泪腺内也可见肌上皮细胞损伤、脂质异常堆积、细胞增殖减少、凋亡增加和炎性细胞浸润。 Hif公司 此外，α和NF-κB信号通路被激活，而 Pparα 在OSA小鼠的泪腺中被下调。 非诺贝特治疗显著减轻阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSA）引起的泪腺病变。
结论 OSA干扰 Hifα / Pparα /NF-κB信号轴，影响泪腺结构和功能，并导致干眼症。
关键词： 阻塞性睡眠呼吸暂停、泪腺、干眼症、眼表
睡眠呼吸暂停是一种以呼吸道阻塞或睡眠中由于中枢神经系统控制的呼吸变化而反复出现呼吸暂停为特征的疾病。 1 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征是公认的全球性公共卫生疾病。 大约10亿人患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合症， 2 65岁以上人群中轻度阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的患病率可达84%，其中男性占90%，女性占78%。 三 几项研究表明，诊断和治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合症的成本很高， 4 – 7 这种疾病给个人和社会带来了严重负担。 此外，据报道，阻塞性睡眠呼吸暂停综合症与许多疾病有关，如心血管疾病， 8 , 9 糖尿病， 10 抑郁， 11 男性不育， 12 中风，甚至死亡。 13 同时，OSA被发现与包括青光眼、， 14 , 15 眼睑松弛综合征， 16 视神经病变， 17 , 18 和圆锥角膜。 19 , 20
干眼症是一种由泪膜内稳态失衡引起的多因素眼表疾病。 21 据估计，其流行率为5%至50%，具有明显的变异性，在一些人群中达到75%。 22 最近，卡拉卡和同事 23 据报道，阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者的泪液破裂时间更短，泪液分泌减少，而利姆及其同事 24 发现睡眠呼吸暂停的高风险与干眼症有关。 然而，阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与干眼症之间因果关系的可能性及其可能的机制尚未确定。
泪腺是眼表微环境的关键部分。 25 它分泌水泪以维持眼表的内环境稳定。 由于糖代谢异常，泪腺容易发生病理变化 26 或脂质代谢， 27 随着年龄的增长和睡眠不足，泪腺病变常伴有脂质异常沉积。 28 , 29 目前的研究表明，阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSA）是干眼病的一个诱因，并揭示了OSA可能通过泪腺脂肪代谢异常导致泪腺脂质代谢异常的机制 Hif公司 - Pparα 信号通路，最终触发干眼症的表现。 我们还报道了全身非诺贝特对OSA诱导的泪腺病变的治疗效果。
材料和方法 阻塞性睡眠呼吸暂停小鼠模型的建立 从上海SLAC中心（中国上海）购买7至8周龄雄性C57BL/6J小鼠。 动物被关在通风的笼子里，室温约为25°C，空气湿度约为60%。 室内光照时间为上午8:00至晚上8:00。“慢性间歇性缺氧”方法广泛用于模拟实验小鼠的阻塞性睡眠呼吸暂停 30 – 32 并在这里使用。 简单地说，在适应环境一周后，OSA组的小鼠被放置在定制的笼子中，每天上午9:00至下午5:00，持续四周。 通过使用受控的气体输送系统，使笼子中的氧气浓度周期性地上升和下降。 笼子内的气体保持稳定流动，并按照以下循环进行调节：氮气注入35秒，然后暂停10秒； 注入纯氧10秒； 给笼子充气35秒( A） ●●●●。 使用氧气浓度检测器（BH-90A；中国河南省博兴市）实时监测笼子内的氧气浓度。 在实验期结束时，OSA小鼠被恢复到正常的大气环境，而对照组小鼠则被安置在正常的大气条件下。 试验期间，治疗组喂以非诺贝特（中国江苏美迪生生物制药有限公司）100 mg/kg/d。 本研究共使用110只小鼠。 他们被随机分为五组，每组22只小鼠，具体实验中使用的动物数量在图例中描述。 所有实验程序均经厦门大学动物实验伦理委员会审查批准，均符合视觉与眼科研究协会的相关要求。
阻塞性睡眠呼吸暂停导致小鼠干眼改变。 （A） OSA诱导协议示意图。 （B） 氧气浓度在90秒周期内实时监测。 （C） OSA诱导不同持续时间后小鼠角膜的裂隙灯图像和荧光素染色。 （D） 荧光素染色分数表明OSA小鼠角膜上皮缺损。 （E） OSA小鼠角膜敏感性增加。 （F） 阻塞性睡眠呼吸暂停综合症小鼠的泪液分泌减少。 （G） OSA诱导小鼠一个月后泪腺重量增加。 n=6（C–G）； n=10（B）* P（P） < 0.05, **** P（P） < 0.0001. D、 天； M、 月份； NC，阴性对照； AHI，呼吸暂停-低通气指数。
小鼠泪液分泌和角膜敏感性的测定 每天下午6点测量小鼠的泪液分泌量。用无菌滤纸在不接触眼球的情况下吸干小鼠结膜囊内积聚的泪液。 然后放置一根酚醛红色棉线（日本Zone-Quick），距离小鼠下眼睑外侧眼角三分之一的距离，持续15秒。 然后取下螺纹，撕裂量以毫米为单位。 如前所述，使用Cochet-Bonnet振动计（Western Ophthalmics，Lynnwood，WA，USA）测量角膜敏感性。 28 简单地说，通过触觉尼龙丝与中央角膜进行了五次连续的垂直接触。 如果在五次接触中诱发三次眨眼行为，则结果为阳性。 仪器的灯丝每次从全长减少1厘米到6厘米，直到获得上述阳性结果。 然后将灯丝长度记录为角膜敏感度结果。
苏木精和伊红染色 小鼠经颈部脱位安乐死后，取下泪腺，用4%多聚甲醛固定24小时。 然后将其依次浸入70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇和100%乙醇中，嵌入石蜡中，并使用石蜡切片机在5µm处切片。 切片在载玻片上采集，用二甲苯脱蜡并用分级乙醇再水化后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗。 切片用苏木精染色5分钟，伊红溶液染色1分钟，然后用自来水冲洗5分钟，并放入分级乙醇中。 安装后，用光学显微镜（德国耶拿卡尔蔡司Axio实验室A1）拍摄照片。
油红O染色 用4%多聚甲醛固定泪腺冷冻切片5分钟，然后用PBS冲洗。然后用溶于异丙醇的0.5%油红O对切片染色15分钟，然后用PBS洗涤。 组织切片用苏木精进一步染色15秒，用自来水冲洗10分钟，然后干燥并用甘油固定。 在光学显微镜下观察脂质的分布（卡尔蔡司Axio实验室A1）。
免疫荧光染色 冷冻切片用4%多聚甲醛固定20分钟。 随后用PBS清洗，并用0.2%Triton®声波风廓线仪覆盖20分钟，然后用2%牛血清白蛋白封闭1小时。 CD45（1:200，sc-25590；Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA），F4/80 然后添加抗体，并在4°C下培养切片过夜。 用PBS洗涤后，在室温下将二级抗体（1:300，Alexa Fluor 594结合IgG，A21207或Alexa Fuor 488结合IgC，A21206；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）添加到切片中1小时。 在用PBS清洗后，用DAPI作为核染色剂安装载玻片。 使用蔡司LSM 880激光共焦显微镜对切片进行可视化和拍照（蔡司，Oberkochen，德国）。
免疫染色 将石蜡切片脱蜡，再水化，并置于由10 mmol/L柠檬酸钠和0.05%吐温20组成的抗原回收溶液中。 在微波炉中加热至沸点20分钟后，将载玻片在自来水中漂洗15分钟。 然后在室温下用0.06%过氧化氢处理样品半小时，然后用0.2%Triton孵育20分钟，用PBS洗涤，并在室温下使用2%牛血清白蛋白封闭一小时。 然后添加CD4（1:1000，ab183685；Abcam）、HIF1α（1:1000；ab2185；Abcam）和HIF2α（1:200，49814；美国马里兰州格林贝尔特的信号通路抗体）抗体，然后在4°C下孵育过夜。 用PBS三次洗涤15分钟后，添加二级抗体（PV6001；ZSGB-BIO，中国北京），并培养切片1小时。 用PBS洗涤后，用二氨基联苯胺显色溶液（ZLI9019；ZSGB-BIO）显色1分钟，用固定介质固定，并在光学显微镜下进行检查（Eclipse 50i；日本东京尼康）。
TUNEL分析 TUNEL法检测泪腺细胞凋亡。 冷冻切片固定后，用蛋白酶K处理10分钟。 随后，阴性对照组和阳性对照组分别用DNAase处理10分钟，然后用PBS洗涤。然后在室温下用平衡缓冲液培养切片10分钟，随后在37°C下混合试剂（末端荧光TUNEL系统G3250；美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司）培养一小时。 然后将组织标本浸泡在生理盐水柠檬酸钠（死端荧光TUNEL系统，G329A；Promega）中15分钟。 用PBS冲洗三次后，用DAPI安装载玻片，并用LSM 880共焦显微镜（蔡司）成像。
胆固醇和甘油三酯检测分析 胆固醇和甘油三酯试剂盒（A111-1-1和A110-1-1；南京建成生物工程，中国南京）用于量化泪腺和血清中的胆固醇和甘脂含量。 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液将小鼠麻醉后，从后器官静脉丛采集血液，在37°C下静置1小时，并在离心机中以5000 rpm旋转10分钟。 然后将上清液转移到新试管中。 泪腺组织在切除后立即在生理盐水中均质。 简言之，我们按照试剂盒制造商的方法，按照泪腺重量（g）与体积（mL）的比例=1:9，加入9体积的均质介质（0.86%生理盐水溶液）制备匀浆。 将制备好的10%匀浆以2500 rpm离心10分钟，取上清液用于测定脂质含量。 胆固醇和甘油三酯含量根据510 nm波长下测得的吸光度值计算。
透射电子显微镜 用PBS清洗切除的泪腺，切成小块，在4°C的磷酸盐缓冲液中浸泡2.5%戊二醛过夜。 然后分别用PBS和碳酸钠清洗样品，并浸入1%OsO中 4 解决两个小时。 随后将每个样品在室温下部分脱水，方法是将其添加到30%和50%乙醇的溶液中，然后在4°C下用70%醋酸铀酰染色4小时。 在室温下以70%、90%、100%乙醇的浓度梯度继续脱水，每次浸泡15分钟。 接下来，将样品包埋在Spurr树脂中，然后用超微切片机在75nm处切割超薄切片，并在铜格栅上拾取，并用10%柠檬酸铅溶液染色10分钟。 使用日立HT-7800透射电子显微镜（日本东京日立）观察并拍摄组织切片。
定量实时PCR 使用冷却的TRIzol试剂（10606ES60；YEASEN，中国上海）提取泪腺组织的RNA，并使用ExScript RT试剂盒（日本京都Takara Bio）将其反转录成cDNA。 定量实时PCR（qRT-PCR）采用Step One系统（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行。 放大程序遵循其他地方报告的既定程序。 27 补充表S1 列出了使用的引物序列。 基因表达由2^ -ΔΔCt 方法。 33
Western Blot分析 为了测定泪腺组织中的相关蛋白表达水平，处死小鼠，用RIPA缓冲液（R0278；Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1861281；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA。 随后，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。 电泳结束后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，并在5%牛血清白蛋白中封闭2小时。 将细胞膜与PPARα（1:1000，ab8934；Abcam）、CPT1A（1:1000；ab220789；Abcam）、NRF2（1:1000、16396-1-AP；Proteintech）、SOD2（1:100024127-1-AP；Protentech），总NF-κB P65（1:10008242s；Cell Signaling Technology。 在用含有0.05%吐温-20（TBST）溶液的Tris缓冲盐水洗涤三次10分钟后，用辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:10000，山羊抗狂犬病IgG H&L；Abcam）培养膜1小时。 用TBST溶液洗涤三次后，用增强化学发光试剂（Advansta，San Jose，CA，USA）对结果进行可视化，并获得相应的蛋白质带。
统计分析 使用Image J软件（版本1.52；美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）获得来自图像的定量数据。 总之，将免疫荧光图像转换为灰度，并用Image J软件对随机选择的至少三个或更多区域的阳性染色进行分析。 使用Image J软件的免疫组织化学Profile模块对CD4免疫组织化学染色进行定量分析。 我们将该软件自动获得的所有阳性百分比之和作为最终阳性百分比，即最终阳性百分比（%）=高阳性（%）+阳性（%。 所有样品均在共焦激光扫描显微镜（蔡司LSM 880，Zeiss）中以相同的曝光时间拍摄。 每个样品都经过至少三个不同领域的研究。 使用GraphPad Prism软件（8.0.1版；美国加利福尼亚州圣地亚哥）对结果进行分析。 我们使用Shapiro-Wilk正态性检验来分析数据是否符合正态分布。 使用 t吨 -方差的测试或分析。 采用Wilcoxon秩和检验分析不符合正态分布的数据。 误差线表示正态分布结果中的平均值和标准偏差，或非正态分布组中的中位数和四分位范围。 P（P） <0.05被认为具有统计学意义。
结果 阻塞性睡眠呼吸暂停小鼠模型的干眼症状 建立OSA小鼠模型，模拟每小时40次呼吸暂停( A） ，表示呼吸暂停指数为40。 获得的最大氧气浓度约为21%，最小氧气浓度约7.2%( B） ●●●●。 OSA一个月后，与14天相比，OSA组的体重没有增加。 正常对照组的体重高于OSA组( 补充图S1 ). 阻塞性睡眠呼吸暂停综合症七天后，根据荧光素染色，阻塞性睡眠睡眠呼吸暂停症小鼠的角膜上皮缺损明显，一个月后更为明显( C、 D） ●●●●。 角膜敏感度在一周后开始增加，并在整个阻塞性睡眠呼吸暂停期间保持在相对较高的水平( E） ●●●●。 7天后，阻塞性睡眠呼吸暂停综合征小鼠的泪液分泌量下降至正常对照水平的一半左右，并持续到一个月( F） ●●●●。 OSA小鼠泪腺重量在第7天和第14天基本不变，但在一个月的时间点显著增加( G） ●●●●。 眼表表现证实，模拟OSA诱导7天后，OSA小鼠出现干眼变化。
OSA小鼠泪腺脂质代谢异常和线粒体完整性改变 我们实验室先前的研究发现，在各种干眼症动物模型的泪腺中存在脂质积聚。 27 , 28 在这里，油红O染色显示七天OSA小鼠泪腺细胞中脂质沉积增加，持续一个月后变得更加突出。 相反，在正常泪腺细胞中只观察到少量脂质( A） ●●●●。 透射电镜显示，OSA小鼠泪腺腺泡细胞内积聚了大量脂滴( C） ●●●●。 油红O染色显示OSA组或对照组肝细胞无脂质沉积( D） 表明阻塞性睡眠呼吸暂停综合征导致泪腺比肝脏更容易发生异常脂质沉积。 胆固醇( E） 和甘油三酯( F） 在OSA小鼠的泪腺中也检测到，并且发现早在OSA诱导的第7天就显著增加。 在一个月的关键时刻之前，一直保持着较高的水位。 另一方面，胆固醇( G） 和甘油三酯( H） 与对照组相比，OSA组从第七天到一个月测量的血清水平没有变化。
OSA导致泪腺脂质代谢异常。 （A） 油红O染色显示阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺脂质沉积。 （B） 相对油红O染色强度显示阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺脂质积聚。 （C） 透射电子显微镜检查OSA泪腺腺泡细胞中的脂滴。 （D） 油红O染色显示，在OSA不同持续时间后，小鼠肝脏中没有脂质积聚。 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺中胆固醇和甘油三酯水平。 血清中的（G，H）胆固醇和甘油三酯水平。 （一） 基因表达 Pparα、Cpt11a、Fas、， 和 抄送36 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺。 （J） Western blot结果显示PPARα和CPT1A的蛋白表达。 PPARα（K）和CPT1A（L）的Western blot定量分析。 n=6（A–D，I–L）； n=7（E和F）； n=8（G和H）* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001, **** P（P） < 0.0001. 比例尺 ：100µm（A和D）； 5µm（C）。 D、 天； M、 月份； NC，阴性对照。
过氧化物酶体增殖物激活受体α( Pparα )在控制参与脂质代谢途径的多个基因的表达方面发挥着重要作用，如参与脂肪酸氧化、甘油三酯和脂滴的合成和分解以及脂蛋白代谢的基因。 34 为了研究脂滴沉积是否伴随着脂代谢相关基因的变化， Pparα -肉碱棕榈酰转移酶1a( Cpt1a公司 )，脂肪酸合成酶( Fas公司 )和 抄送36 -用qRT-PCR检测。 Cpt1a公司 催化长链脂肪酰基从辅酶a转移到肉碱，并参与脂肪酸的运输和氧化。 Fas公司 对脂肪生成是不可或缺的，而 抄送36 对长链脂肪酸代谢和低密度脂质氧化的影响。 35 结果表明 Pparα 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征第七天显著降低，直到一个月后仍保持较低水平。 Cpt1a公司 基因表达在一个月时下降，而 Fas公司 和 抄送36 从第七天到一个月，表达逐渐增加( 一） ●●●●。 Western blot分析证实OSA小鼠一个月时泪腺PPARα和CPT1A表达降低( J–L）。
基于泪腺腺泡细胞中脂质积聚会导致线粒体脂质氧化的观点， 27 我们进行TIM23和TOM20免疫荧光染色以评估线粒体完整性。 在7天的OSA小鼠中，线粒体内膜TIM23转定位酶的表达( A、 B） 线粒体外膜TOM20的转锁酶( C、 D） 两者都有所减少，直到一个月后仍保持低水平。 透射电子显微镜记录到阻塞性睡眠呼吸暂停七天后线粒体肿胀，这种肿胀持续存在并随时间增加( E） ●●●●。
OSA影响泪腺线粒体的形态和转定位酶的表达。 （A） TIM23的免疫荧光染色( 红色 )和DAPI( 蓝色 )在泪腺中。 （B） TIM23的平均荧光强度表明阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺线粒体内膜蛋白的表达降低。 （C） TOM20的免疫荧光染色( 红色 )和DAPI( 蓝色 ). （D） TOM20的平均荧光强度显示OSA泪腺中线粒体外膜蛋白的表达降低。 （E） 透射电镜显示阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺线粒体微结构改变。 n=6（A–E）* P（P） < 0.05. 比例尺 ：20µm（A和C）； 1µm（E）。 D、 天； M、 月份； NC，阴性对照。
阻塞性睡眠呼吸暂停综合征小鼠泪腺炎症和活性氧的变化 在人类中，阻塞性睡眠呼吸暂停综合症可诱发持续的低水平炎症， 36 因此，我们研究了OSA小鼠泪腺的炎症状态。 苏木精和伊红染色显示，细胞浸润在第7天开始，在第14天变得更加明显，浸润的细胞主要位于血管周围。 阻塞性睡眠呼吸暂停1个月后，单个组织切片出现多个浸润病灶( A） ●●●●。 小鼠OSA泪腺CD4免疫组织化学染色显示，在第7天和第14天，分散淋巴细胞浸润水平较低，但逐渐增加，在1个月后形成簇状细胞( B和E）。 CD45染色显示从第7天起白细胞显著浸润( C、 F） ，从第7天到1个月，F4/80阳性巨噬细胞数量逐渐增加( D、 G） ●●●●。 从第7天到第14天，炎症细胞因子IL6、IL10、IL1β和肿瘤坏死因子-α在小鼠OSA泪腺组织中显著上调，随后减少到一个月的接合点( H） ●●●●。 同样，磷酸化p65的蛋白表达在第7天到第14天上调，此后略有下降( 我 J） ●●●●。 总的来说，这些发现代表了阻塞性睡眠呼吸暂停综合征小鼠泪腺炎症的明确证据。 OSA在多个组织中产生活性氧（ROS）已得到证实。 37 在这里，我们观察到阻塞性睡眠呼吸暂停综合征模型中泪腺氧化应激的改变。 氧化应激标记物NRF2和SOD2的表达在建模7天后增加，从14天到1个月逐渐减少( 我 J） ●●●●。
阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSA）会导致阻塞性睡眠暂停综合征泪腺发炎。 （A） 苏木精和伊红染色显示OSA泪腺细胞浸润。 黑色箭头 代表细胞浸润。 （B） 免疫组织化学染色显示CD4 T淋巴细胞。 黑色箭头 代表阳性染色区域。 （C） CD45免疫荧光染色( 绿色 )显示了白细胞的分布( 蓝色 ，DAPI）。 （D） F4/80的免疫荧光染色( 绿色 )显示阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺中的巨噬细胞( 蓝色 ，DAPI）。 （E） 免疫组织化学评分显示CD4阳性细胞增加。 图表显示了CD45（F）和F4/80（G）染色阳性细胞的特定计数。 （H） qRT-PCR确定 伊尔6 , Il10号机组 , Il1β 、和 Tnfα。 （一） Western blot显示OSA小鼠泪腺中磷酸化P65、总P65、NRF2和SOD2的蛋白表达。 （J） p-P65/P65、NRF2和SOD2的Western blot定量分析。 n=5（H–J）； n=6（A–G）。 比例尺 ：100µm（A和B）； 40µm（C和D）* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） <0 .001, **** P（P） < 0.0001. D、 天； M、 月份； NC，阴性对照。
OSA小鼠泪腺细胞变化及缺氧诱导因子表达的改变 泪腺中的肌上皮细胞具有收缩性，在泪液分泌中起着重要作用。 38 它们也被认为是腺泡细胞的祖细胞。 39 αSMA是肌上皮细胞的标记物， 40 小鼠OSA泪腺的免疫染色显示，从第7天到1个月，αSMA表达逐渐减少( A、 D） ●●●●。 泪腺中Ki67阳性细胞在第七天很少，并且在一个月前数量一直很低( B） ●●●●。 Ki67的qRT-PCR分析证实了这一结果( E） TUNEL分析显示凋亡细胞在整个OSA期间逐渐增多( C、 F） ●●●●。
OSA影响OSA泪腺的增殖、凋亡和肌上皮细胞结构。 （A） αSMA免疫荧光染色显示肌上皮细胞的分布。 （B） Ki67的免疫荧光染色( 红色 )表明OSA泪腺细胞增殖( 蓝色 ，DAPI）。 （C） TUNEL染色（绿色）识别OSA泪腺中的凋亡细胞（蓝色，DAPI）。 （D） αSMA免疫荧光染色定量显示肌上皮细胞表达降低。 （E） qRT-PCR显示Ki67的表达减少。 （F） 图中显示了TUNEL染色阳性细胞的特定计数。 n=6（A-F）。 比例尺 ：40µm（A–C）* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001. D、 天； M、 月份； NC，阴性对照。
因为间歇性缺氧是阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的特征， 37 我们调查了典型的低氧诱导因素( Hifs公司 )在小鼠OSA泪腺中。 免疫染色和qRT-PCR显示 Hif1α OSA第七天。 这种变化是暂时的，到第14天时下降，一个月后恢复到正常水平( A、 B） ●●●●。 的表达式 Hif2α 遵循了类似的趋势( C、 D） Western blot分析证实 Hif1α 和 Hif2α OSA小鼠泪腺( E–G）。
OSA诱导OSA泪腺缺氧诱导因子的变化。 （A，C）不同时间点HIF1α和HIF2α活化的免疫组织化学染色。 （B，D）qRT-PCR显示 Hif1α 和 Hif2α 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺。 （E） Western blot分析表明HIF1α和HIF2α的蛋白表达水平发生变化。 HIF1α和HIF2α的（F，G）Western blot定量分析。 n=5（A–G）。 比例尺 ：100µm* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001, **** P（P） < 0.0001. D、 天； M、 月份； NC，阴性对照。
非诺贝特减轻阻塞性睡眠呼吸暂停综合征所致泪腺病理改变 在OSA小鼠模型中，PPARα的表达在第7天开始下降，此后保持较低水平( J） ●●●●。 在此基础上，我们假设PPARα信号通路的激活能够预防OSA引起的泪腺损伤。 为了验证这个想法，我们给OSA小鼠喂食非诺贝特 Pparα 激动剂，从OSA诱导开始。 这改善了角膜上皮的状况( A） 荧光素染色评分进一步表明，非诺贝特治疗从第7天到一个月可以缓解角膜上皮缺损( B） ●●●●。 此外，用非诺贝特喂养OSA小鼠一个月后，角膜敏感性恢复( C） ●●●●。 与OSA组相比，喂食非诺贝特后体重无明显变化( 补充图S1 ). 油红O染色显示，非诺贝特治疗一个月后，OSA小鼠泪腺中的脂质积聚显著减少( D、 G） 透射电镜显示泪腺腺泡细胞中脂滴的发生率降低( E） ●●●●。 喂食非诺贝特的OSA小鼠的泪液分泌在两周后上调，一个月后恢复到接近正常水平( F） ●●●●。 非诺贝特还能有效降低胆固醇含量( H） 和甘油三酯( 一） 在治疗过的阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺中。 TOM20的免疫荧光染色( J、 K） 和TIM23( L、 M） 研究表明，非诺贝特治疗维持了阻塞性睡眠呼吸暂停综合征小鼠泪腺线粒体功能蛋白的表达，透射电镜显示非诺贝塔治疗后线粒体肿胀减轻( N） ●●●●。
非诺贝特逆转阻塞性睡眠呼吸暂停综合征引起的泪腺病理变化。 （A） 裂隙灯图像显示非诺贝特治疗后OSA诱导的角膜上皮缺损得到改善。 （B） 通过荧光素染色评分确定角膜上皮缺损的减少。 （C） 非诺贝特治疗一个月后，角膜敏感度恢复到正常水平。 （D） 油红O染色显示非诺贝特治疗后OSA泪腺脂质分布减少。 （E） 透射电子显微镜检查OSA泪腺腺泡细胞中的脂质沉积。 （F） 非诺贝特治疗后泪液分泌值增加。 （G） 油红O染色定量显示非诺贝特治疗后泪腺脂质减少。 （H） 非诺贝特可以改善泪腺中的胆固醇和（I）甘油三酯水平。 （J） 基因表达水平 Pparα、Cpt1α、Fas 和 镉36 非诺贝特治疗后症状有所改善。 （K） TOM20的免疫荧光染色( 红色 )在一个月的阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺中减少，但用非诺贝特治疗后仍保持不变。 （五十） TOM20的荧光定量证实了这一变化。 （M） TIM23公司( 红色 )一个月阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者泪腺的免疫染色减少，而非诺贝特治疗后免疫染色基本保持不变。 （N） 荧光定量显示TIM23的回收率。 （O） 透射电子显微镜显示喂食非诺贝特的小鼠线粒体的形态更加完整。 n=6（A–J）； n=8（K–n）。 比例尺 ：100µm（D）； 20微米（J）； 5µm（E）； 1µm（牛顿）* P（P） < 0.05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001, **** P（P） < 0.0001. D、 天； M、 月份； NC，阴性对照。
还发现非诺贝特可以减轻OSA诱导的炎症和细胞凋亡。 这可以通过非诺贝特治疗OSA组较低水平的细胞浸润来证明( A、 B） ，带有CD4阳性淋巴细胞( C、 D） ，CD45阳性白细胞( E、 F） 和F4/80阳性巨噬细胞( G、 H） 分布较少。 另一方面，非诺贝特治疗OSA小鼠一个月后Ki67表达增加( 我 J） 而TUNEL阳性细胞的数量较少( K、 五十） ●●●●。 非诺贝特治疗1个月后，OSA小鼠泪腺中磷酸化p65的表达显著下调( M、 N） ●●●●。 此外，NRF2和SOD2的表达在治疗后降低( M、 N） 改善了肌上皮细胞的结构完整性( A、 B） ●●●●。 HIF1α的表达( C中 D） 和HIF2α( E中 F） 在非诺贝特治疗一个月后，也发现阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺上调。 总之，我们的结果表明非诺贝特治疗可以减轻阻塞性睡眠呼吸暂停综合征引起的泪腺病理变化。
非诺贝特改善OSA诱导的炎症和细胞凋亡。 （A） 泪腺苏木精和伊红染色显示细胞浸润( 黑色箭头 ). （B） 浸润细胞计数显示，非诺贝特治疗后细胞浸润减少。 （C） CD4免疫染色显示泪腺组织中T淋巴细胞呈阳性。 （D） CD4免疫组化评分显示非诺贝特治疗后CD4阳性染色减少。 （E） 非诺贝特治疗后，阻塞性睡眠呼吸暂停综合征泪腺中CD45阳性白细胞显著减少。 （F） CD45的免疫荧光强度证实了这一变化。 （G） F4/80阳性巨噬细胞表现出与CD45相似的模式。 （H） F4/80染色的定量分析也证实了非诺贝特治疗后巨噬细胞浸润的减少。 （I，J）免疫荧光染色和Ki67的RT-qCR显示泪腺细胞增殖。 （K） TUNEL染色显示，治疗后泪腺凋亡细胞减少。 （五十） TUNEL染色定量显示凋亡细胞的强度，治疗后细胞凋亡强度降低。 （M） Western blot分析显示治疗后OSA小鼠泪腺中总P65、磷酸化P65、NRF2和SOD2的变化。 （N） p-P65/P65、NRF2和SOD2的Western blot定量分析。 n=5（I，J，M，n）； n=6（A–H，K–L）。 比例尺 ：100µm（A和C）； 40µm（E、G、I和K）* P（P） <0 .05, ** P（P） < 0.01, *** P（P） < 0.001, **** P（P） < 0.0001. D、 天； M、 月份； NC，阴性对照。
非诺贝特可恢复肌上皮细胞结构并增强低氧诱导因子的表达。 （A） αSMA免疫荧光染色显示肌上皮细胞的表达。 （B） α-SMA染色定量显示，OSA诱导一个月后荧光强度降低，非诺贝特治疗后未见这种变化。 HIF1α和HIF2α的（C，E）免疫组织化学染色显示非诺贝特治疗后HIF2β的表达增加。 （D，F）qRT-PCR显示 Hif1α 和 Hif2α 非诺贝特治疗后增加。 n=6（A–F）。 比例尺 ：40µm（A）； 100µm（C和E）* P（P） < 0 .05, **** P（P） < 0.0001. D、 天； M、 月份； NC，阴性对照。
讨论 OSA可导致多系统异常，如非酒精性脂肪肝， 41 痴呆 42 和心血管疾病。 43 目前的研究表明，小鼠实验性OSA可激活 Hif-Pparα 信号转轴通过诱导间歇性缺氧，进一步触发包括泪腺脂质代谢异常和炎性细胞浸润在内的一系列病理变化，最终导致泪液分泌减少和眼表干样改变。
先前的研究报告称，缺氧会导致肝脏中的脂质沉积，这与 Hifα 在间歇性低氧条件下。 44 缺氧也会触发 Pparα 通过激活 Hif2α 脂肪变性人肝细胞系和非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的通路通过高脂饮食喂养，最终导致肝脏脂质代谢异常。 45 数据显示阻塞性睡眠呼吸暂停综合征也会导致泪腺脂质沉积。 将小鼠置于OSA诱导条件下7至14天后，HIF1α和HIF2α明显激活。 此外 Hifα 与脂质代谢密切相关的下游基因，如 Pparα , Cpt1a公司 , Fas公司 改变了 抄送36 也发生了变化。 在这里，我们展示了这一点 抄送36 有上调的趋势，可能会促进泪腺细胞对脂类的摄取。 高架 Fas公司 表达导致泪腺细胞内内源性脂质增加，而降低 Cpt1a公司 表达导致细胞内脂肪酸氧化受限。 此外，线粒体内外膜破裂导致线粒体功能受损，可进一步加剧细胞内脂质沉积。 46 上述因素共同作用可引发泪腺细胞中的脂质沉积。 先前的研究表明，在饮食诱导的肝脂肪变性小鼠模型中，6个月的慢性间歇性缺氧可导致肝脏脂质积聚。 47 有趣的是，在OSA条件下一个月，我们既没有发现肝脏中的脂质沉积，也没有发现血清中的脂质变化。 这些结果支持了这样的观点，即泪腺可能是一个比肝脏更敏感的器官，对缺氧和脂质代谢的影响。
OSA小鼠的另一个显著变化是泪腺局部微环境的炎症。 在缺氧条件下，机体通过HIF和NF-κB信号通路启动复杂且相互关联的炎症级联反应。 48 以前的报道表明，OSA可以激活NF-κB信号通路，进而导致注射SARS冠状病毒或髓系限制性IkappaB激酶（IKK）-β-缺失和 Hif1α 击倒HK2细胞。 49 – 51 我们还发现OSA小鼠泪腺中NF-κB信号通路激活。 此外，腺泡细胞内的脂质沉积会导致脂质过氧化，从而导致泪腺的炎症反应。 我们之前的研究表明，脂肪沉积导致喂食高脂肪食物的小鼠泪腺发炎。 27 细胞周围浸润的炎性细胞也可以分泌炎性因子，影响泪腺细胞的微环境，形成炎症级联反应，从而改变泪腺功能。 因此，OSA诱导的泪腺炎症可能由一系列不同的机制引起。
作为OSA的临床症状，实验小鼠的眼泪分泌在第七天显著减少，这种情况持续到一个月。 我们之前的研究报告称睡眠剥夺 28 和高脂肪饮食 27 也导致泪腺细胞的泪液分泌和脂质积累减少。 由此得出结论，泪腺中的脂质沉积会破坏其分泌功能。 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征条件下泪腺的炎症也可能干扰泪腺腺泡细胞的分泌。 52 这一特征与泪腺受累和泪液分泌减少的几种疾病相同，如Sjögren综合征 53 和移植物抗宿主病。 54 OSA小鼠泪腺肌上皮细胞受损。 这些细胞在神经调节下对腺泡细胞施加压力以分泌眼泪，其损伤可导致挤压功能丧失。 38 , 55 我们还发现OSA小鼠泪腺中的凋亡细胞增多，这可能导致器官功能丧失。 56 嗨， 此外，导致线粒体内外膜蛋白结构的破坏，提示细胞内缺氧和线粒体功能受损。 57 , 58 众所周知，泪腺的分泌功能取决于线粒体结构和功能的完整性。 59 , 60 我们认为，上述因素的结合导致阻塞性睡眠呼吸暂停综合征小鼠泪腺的泪液分泌减少。
研究表明，肥胖者更有可能患上阻塞性睡眠呼吸暂停综合症，阻塞性睡眠暂停综合症患者有肥胖和代谢综合征的风险。 43 非诺贝特是应用最广泛的降脂药物之一， 61 , 62 可以激活 Pparα . 63 , 64 我们的研究发现，实验小鼠的阻塞性睡眠呼吸暂停综合征导致泪腺脂质沉积，并伴有 Pparα 下调监管。 当非诺贝特用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征引起的泪腺病变时，我们发现 Cpt1a公司 和下调 Fas基因 这与之前关于非诺贝特影响的报告一致。 有趣的是，我们发现 抄送36 非诺贝特治疗后泪腺中的表达。 先前的研究表明 Pparα 激动剂对 抄送36 动脉粥样硬化模型中的表达， 65 而其他研究发现非诺贝特可以增加 抄送36 巨噬细胞中的基因表达 . 66 我们与先前研究结果的不一致可能部分是由于非诺贝特治疗一个月后泪腺中浸润的炎性细胞显著减少，这可能是 镉36 在我们之前的研究中，我们发现非诺贝特可以恢复高脂肪饮食诱导的小鼠泪腺功能障碍 27 并且可以恢复睡眠不足引发的角膜病变。 67 激活 Pparα 此外，还减轻了睡眠不足引起的小鼠泪腺损伤的严重程度。 68 临床研究也表明，非诺贝特可以通过降低血脂来改善OSA的临床症状。 69 非诺贝特还能减少视网膜和血管内皮的炎症， 70 , 71 而激活 Ppar公司 α 减轻NF-κB磷酸化。 72 由于非诺贝特对脂类代谢机制的复杂性，我们认为其对泪腺的作用机制值得进一步研究。
Hifs公司 是氧稳态的关键调节器。 它们在缺血性心血管疾病、伤口愈合和器官移植的慢性排斥反应中起到保护作用。 73 Hif1α 可促进缺氧相关病理条件下肠上皮的存活。 74 激活 Hif1α 可以防止干眼症引起的泪腺腺泡细胞死亡， 75 Hif1α 还可以减少炎症细胞向泪腺的募集。 76 然而， Hifs公司 也不利于视网膜新生血管、遗传性红细胞增多症和癌症。 73 以前的研究已经揭示了在 Hif公司 表达式。 Sacramento等人。 77 发现在慢性间歇性缺氧模型中， Hif1α 和 Hif2α 随着时间的推移，骨骼肌、肝脏和脂肪细胞的表达并没有显示出一致的趋势。 在缺氧培养的人L02肝细胞模型中， HIF2α 12小时后增加，18小时表达最高，24小时后逐渐减少，但 HIF1α 没有显示任何更改。 78 在我们的研究中，我们还发现HIF1α和HIF2α的表达在阻塞性睡眠呼吸暂停综合征第7天和第14天上调，1个月后恢复到正常对照水平。 我们推测 Hifα 该水平可能是长期缺氧后泪腺细胞功能失代偿的结果。 另一种解释是泪腺细胞适应了慢性缺氧环境，因此 Hifα 表达水平降至正常水平。 必须进一步研究以揭示其内在机制。 应用非诺贝特后 Hif1α 和 Hif2α 显著上调，提示非诺贝特可能有助于恢复长期间歇性缺氧条件下泪腺的代偿状态。 此外，泪腺中脂质的异常积聚减少，泪腺功能得以维持，表明非诺贝特可能是治疗阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSA）所致干眼症的有效疗法。 据报道 Hif公司 和NF-κB信号通路。 48 在我们当前的研究中，我们观察到 Hif公司 而在阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSA）条件下，这两条信号通路在泪腺中是如何相互作用的，尚需进一步探讨。 此外， Hif公司 炎症细胞中可能由间歇性缺氧或炎症等多种因素触发。 79 的变化 Hif公司 OSA炎症细胞中的NF-κB也需要进一步研究。
氧化应激在泪腺的病理变化中起着重要作用。 80 – 82 在这里，我们发现在阻塞性睡眠呼吸暂停综合征模型中，泪腺也发生了氧化应激。 OSA在多种组织中都能产生ROS。 37 我们最近的研究发现，泪腺的脂质沉积会导致氧化应激。 83 先前的研究也发现，缺氧本身和继发性炎症会导致氧化应激。 84 , 85 另一方面，氧化应激会激活炎症， 86 这最终引发了一个恶性循环，导致泪腺微环境失衡并减少了眼泪的产生。
总之，我们认为OSA诱导的泪腺缺氧可以刺激 Hif1α 和 Hif2α， 进一步激活NF-κB信号通路，诱导炎症，下调 Pparα 信号通路。 这会导致泪腺脂质代谢异常和线粒体功能障碍，导致泪腺内平衡失调和活性氧生成，最终导致泪液分泌减少，并出现伴随的干眼症病变( ). 非诺贝特治疗可抑制NF-κB相关炎症，减少泪腺脂质积聚，从而改善OSA相关的干眼症。 我们的研究首次证实了阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与泪腺功能障碍之间的因果关系，并指出了OSA相关性干眼症的潜在临床治疗方法。
建议的模型 Hifα/Pparα OSA诱导的信号轴（A）和泪腺功能变化的流程（B）。 慢性间歇性缺氧导致 Hifα 泪腺细胞表达。 Hifα 然后转移到细胞核中，与 Hifβ ，并激活下游基因。 Hif公司 可以抑制 Pparα ，通过调节 Fas公司 通过调节 Cpt1a公司 .上调 抄送36 促进泪腺对脂类的吸收。 此外， Hifα 可以通过以下途径直接或间接激活NF-κB信号通路 Pparα NF-κB信号通路的激活、细胞内脂质沉积和炎症细胞浸润有助于泪腺微环境中的炎症反应。 脂质积聚和炎症可诱导ROS生成。 炎症、脂质沉积、活性氧、泪腺凋亡增加、线粒体功能障碍和肌上皮结构受损最终导致泪液分泌减少。
致谢 部分得到国家重点研发计划（编号：2018YFA0107301【转WL】、编号：2018YFA0107304【转ZL】）、国家自然科学基金（编号：81970773、编号：81770894、编号：81330022【转WL】、编号：81870627【转ZL】、编号：81870625【转RZ】）、泉州市高层次人才创新项目（编号：2019C079R【转YG】）的资助。 资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决策或手稿准备中没有角色。
披露： S.Wang， 无； 十、他：， 无； Q.李， 无； 张勇， 无； 胡锦涛， 无； R.Zong， 无； 庄杰， 无； A.J.Quantock， 无； Y.Gao、， 无； 李伟， 无； Z.Liu先生， 无
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