Na的贡献⁺/K（K）⁺-ATP酶、NKCC1和Kir4.1至海马K⁺间隙和体积响应

大鼠星形胶质细胞的原代培养

放射性示踪实验用星形胶质细胞：从P7-P8大鼠幼鼠（丹麦塔科尼州斯普拉格-道利）解剖的大脑皮层培养皮层大鼠星形胶质细胞。通过将组织通过80μm的尼龙筛进入Dulbecco改良的Eagle’s培养基（D-5030，Sigma-Aldrich），机械地分离分离的皮层，该培养基含有额外的6 mM D-葡萄糖、2.5 mM L-谷氨酰胺、26.2 mM NaHCO_三，100000 IU/L青霉素和20%胎牛血清（目录号04-007-1a，批号516714，以色列生物工业）。用配备钢套管的注射器研磨单个细胞，并将其置于24孔组织培养板中（734-2325，VWR，丹麦）。在培养的第二周和第三周，胎牛血清浓度依次降低至15%和10%。在培养的第三周，向培养基中添加0.25 mM dB-cAMP（D-0627，Sigma），以获得形态分化的星形胶质细胞(Su等人，2000年). 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞的标记蛋白，免疫细胞化学染色表明，培养物中95%以上的细胞为星形胶质细胞（数据未显示）。星形胶质细胞保持在37°C和5%CO的气氛中₂并在电镀后3-4周用于实验。

用于体积测量的星形胶质细胞：使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（250-300 g）进行星形胶质细胞制备，详见(Langan等人，1995年). 这些培养物以前曾用于测量(阿森托夫特等人2013;Ateya等人，2005年). 简而言之，从动物体内放置三天的明胶海绵植入物中分离出成年星形胶质细胞。随后将海绵取出，切碎并研磨，然后进行胰蛋白酶处理，并通过孔径为20μm的尼龙网。星形胶质细胞保存在补充有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中。使用第5代和第15代之间的细胞，并在传代后2-5天进行实验。

卵母细胞电生理学

传统的双电极电压钳研究是使用DAGAN CA-1B高性能卵母细胞钳（DAGAN，明尼阿波利斯，明尼苏达州）进行的，其Digidata 1322A接口由pCLAMP软件9.2版（加利福尼亚州伯灵盖姆的分子器件）控制。当填充1 M KCl时，电极从硼硅酸盐玻璃毛细管中拔出，电阻为1-5 MΩ。通过将箝位电位从−50 mV步进到测试电位范围从0 mV到−100 mV，以20 mV增量（200 ms脉冲）获得电流迹线。记录在500 Hz下进行低通滤波，并在2 kHz下进行采样。灌流液包括（单位：mM）：30氯化胆碱（ChCl）、70氯化钠、1氯化镁₂，1氯化钙₂，10 HEPES（pH 7.4），KCl代替ChCl改变K⁺浓度。每个卵母细胞的膜电流都是在一系列含有不断增加的K浓度的测试溶液中获得的⁺随后减去在0 mM KCl下获得的膜电流，以分离K⁺-敏感电流。获得Na⁺/K（K）⁺-ATP酶介导的电流，在1 mM哇巴因（O-3125，Sigma-Aldrich）存在下重复实验系列。

放射性吸收

NKCC1和Na的转运活性⁺/K（K）⁺-ATP酶被确定为布美他尼敏感型（NKCC1）或哇巴因敏感型（Na⁺/K（K）⁺-ATP酶）放射性钾流入⁺同类⁸⁶卢比⁺（NEZ072001MC，德国珀金埃尔默）。卵母细胞在室温下预先孵育（单位：mM）：30 ChCl，70 NaCl，1 MgCl₂，1氯化钙₂，10个HEPES（pH 7.4）持续30分钟，每个条件下10个卵母细胞。随后将卵母细胞转移到等渗溶液中，其中KCl取代ChCl以获得不同的[K⁺]_o个2μCi/ml⁸⁶卢比⁺补充。摄取溶液中含有10μM布美他尼（B3023，Sigma）或1μl/ml EtOH（载体对照）。在室温下进行了5分钟的摄取实验，我们之前证明，该实验是在保持时间线性的时间点进行的(Zeuthen和MacAulay 2012). 在用200μl 10%十二烷基硫酸钠（SDS）在闪烁小瓶中单独溶解之前，在含有30 mM KCl的冰镇介质中进行三次短暂清洗，终止分析。在Tri-Carb 2900TR液体闪烁分析仪（Packard）中，通过使用Opti-Fluor闪烁液（6013199，Perkin-Elmer）进行液体闪烁计数来确定存在的放射性。根据K的变化量校正获得的计数⁺存在于吸收溶液中。

将生长在24孔板中的大鼠星形胶质细胞原代培养物在37°C下在含有（mM）：30 ChCl，104 NaCl，1.2 CaCl的溶液中平衡5分钟₂，1氯化镁₂，5 D-葡萄糖，20 HEPES（pH 7.4）。⁸⁶卢比⁺示踪剂在37°C的等渗溶液中吸收20秒，其中KCl取代ChCl以获得所需的[K⁺]_o个，2μCi/ml⁸⁶卢比⁺存在于给定的解决方案中。对于每个K⁺浓度，对照摄取实验与布美他尼（10μM）或哇巴因（1 mM）的实验平行进行，所有溶液均含有1μL/mL EtOH作为布美他奈的载体对照。实验因吸入⁸⁶卢比⁺-含有培养基，然后使用含有30 mM KCl、10μM布美他尼、1 mM哇巴因和50μM BaCl的溶液进行三次快速冲洗₂将泄漏降至最低⁸⁶卢比⁺。细胞在250μl 1 M NaOH中溶解，100μl转移到闪烁管中，其余用于蛋白质含量测定（BioRad DC蛋白质测定目录编号500-0116，BioRad.）。在Tri-Carb 2900TR液体闪烁分析仪（Packard）中，使用UltimaGold™XR（6013119，Perkin Elmer）通过液体闪烁计数测定放射性含量。根据K的变化量校正获得的计数⁺存在于摄取溶液中。

微流控细胞容积传感器

如前所述，使用微流体细胞体积传感器研究星形胶质细胞的体积变化(Ateya等人，2005年). 星形胶质细胞生长在倒置在传感器芯片上的显微镜载玻片上，从而形成一个固定体积为60 nl的流动室。向室中的两个外电极提供50 Hz，1μa的正弦电流，并测量两个内电极之间的电压。电池体积的增加将增加电池室的电阻，因此电压的增加可作为电池膨胀的功能读数。含有不同K的溶液⁺浓度由两种等摩尔储备溶液产生：0 mM K⁺库存包括（mM）：129 NaCl，30 ChCl，1 MgCl₂，1.2氯化钙₂、5葡萄糖、20 HEPES、24.15甘露醇和30 mM K⁺库存包括（mM）：114 NaCl，30 KCl，1 MgCl₂，1.2氯化钙₂，5葡萄糖，20 HEPES，36.2甘露醇。调节两种溶液中NaCl和甘露醇的浓度以获得相同的电导率和渗透压（用低温渗透压计（Gonotec，Berlin，Germany）和电导率计（Thermo Scientific）验证）。通过调节入口的液压控制溶液流速（~30μl/min）。

大脑切片和解决方案

在雄性Wistar大鼠上进行P21-P30的实验。使用气态2-溴-2-氯-1,1,1-三氟乙烷（B-4388，Sigma）对大鼠进行麻醉。斩首后，迅速取出大脑并放入冰镇切割液中，该切割液含有（单位：mM）：87 NaCl、70蔗糖、2.5 KCl、0.5 CaCl₂，25氯化钠_三，1.1 NaH₂人事军官₄，7 MgSO₄和25 D-葡萄糖，用95%的O平衡₂，5%一氧化碳₂用Campden Vibrating Microtome（7000SMZ，Campden Instruments，UK）切割斜矢状（横向）海马切片（400μm）。将切片转移到含有（mM）：124 NaCl，3 KCl，2 CaCl的标准溶液中₂，25氯化钠_三，1.1 NaH₂人事军官₄，2百万硫酸镁₄和10 D-葡萄糖，并与95%的O平衡_2,5%一氧化碳₂（实验温度33-34°C时pH值为7.4），并在34°C下恢复30分钟，然后在室温下保持。在涉及BaCl的实验中₂，NaH₂人事军官₄用NaCl和MgSO代替₄替换为MgCl₂为了防止降水。所有实验均获得赫尔辛基大学动物研究伦理委员会的批准，并符合美国神经科学学会的政策。

离子敏感微电极和切片电生理记录

电生理记录在定制的潜水式记录室中进行（容积800μl，33-34°C），以2 ml/min的流速连续灌注切片两侧。记录在CA1区放射层内进行。高频刺激（HFS）通过双极电极传输，双极电极插入记录位置附近（≤500μm）的放射状地层中。刺激序列（10-20 V，60-80μs脉冲，20 Hz，持续10秒）以5分钟的间隔发送。用玻璃毛细管微电极记录产生的细胞外场电位，当填充标准溶液时，微电极的电阻为1-10 MΩ（见上文）。该电极用作离子敏感微电极的参考信号。用薄壁非丝状玻璃毛细管（GC150T–7.5，哈佛仪器）制备离子敏感微电极，其尖端直径在1-2μm范围内(Voipio等人，1994年). 然后用气态N，N-二甲基三甲基硅胺（41716，Sigma-Aldrich）在200°C下对毛细管进行硅烷化20分钟，然后用选定的回填溶液和短柱液膜溶液填充。用缬氨霉素膜溶液（99373，钾离子载体I鸡尾酒B，Sigma）制作钾敏微电极，并用150 mM NaCl，3 mM KCl回填。四甲基铵（TMA⁺)-用含有50 mg/ml四（4-氯苯基）硼酸钾（60591，Sigma-Aldrich）和1,2-二甲基-3-硝基苯（40870，Sigma）的膜溶液生成灵敏微电极，并用150 mM TMA-Cl回填(尼科尔森和菲利普斯1981;Voipio等人，1994年). 通过这些TMA记录细胞外体积变化⁺-将1.5mM TMA Cl（储备溶液，5M，Sigma）添加到记录溶液中。用于同步录制[K⁺]_o个和细胞外体积变化，用缬氨酸霉素电极监测[K⁺]_o个而TMA⁺-敏感电极监测细胞外空间容积的变化。使用基于缬氨酸霉素的K进行同步录制⁺-灵敏微电极和TMA⁺-灵敏的微电极，它们的尖端相互之间的距离在50μm以内。在专为监测[K⁺]_o个、TMA⁺-使用了敏感电极。这些电极起K的作用⁺-没有TMA时的传感器⁺在记录溶液中(Voipio等人，1994年). 实验结束时，对离子敏感微电极进行校准，并离线转换记录的信号以获得K⁺细胞外间隙的浓度和百分比变化(Voipio等人，1994年). K的焦点应用⁺通过离子电渗（通过施加电流释放物质），用玻璃毛细管微电极进行，类似于记录细胞外场电位的微电极，充满1 M KCl。为了防止泄漏，施加了−1 nA的连续背电流。K（K）⁺每隔10分钟施加0-100 nA电流5秒，将其输送至切片。在离子导入实验中，记录溶液包含一种抑制剂混合物，以防止谷氨酸和GABA受体的尖峰和活化：DL-2-氨基-5-磷酸戊酸（AP-5，40μM）、2,3-二氧-6-硝基-1,2,3,4-四氢苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺二钠盐（NBQX，10μM），苦曲霉毒素（PiTX，100μM）和（2S）-3-[[（1S）-1-（3,4-二氯苯基）乙基]氨基-2-羟丙基]（苯甲基）膦酸（CGP-55845，1μM），河豚毒素（TTX，1μM），均来自托克里斯·库克森（英国布里斯托尔）。对于所有实验，在浴敷药物前每隔5分钟（离子导入；10分钟）记录三次连续的对照反应。TMA冲洗⁺估计在~6分钟后完成。所有用于说明和定量的药物痕迹均在沐浴后~7分钟记录，但1）将切片暴露于钡的离子导入实验除外²⁺在记录反应前约15分钟和2）50μM哇巴因，在约3分钟后用其记录痕迹，以限制在长期暴露期间观察到的薄片损伤（此时细胞外[K]⁺]_o个已稳定下来，表明哇巴因已达到其全部效果）。除50μM哇巴因外，5分钟后记录第二次对药物的反应（离子导入实验为10分钟），以确保药物达到其全部效果。所有记录的信号都经过抗混叠滤波，以1 kHz的频率采样，并存储起来，以便使用WinEDR（由英国格拉斯哥斯特拉斯克莱德大学John Dempster博士提供）和GraphPad Prism 5.0（GraphPad-Software）进行离线分析。

K的量化⁺清除率

K的最大速率⁺由实验诱发的瞬时上升[K激活的清除⁺]_o个与[K的下降率成正比⁺]_o个在刺激诱导或离子导入释放钾终止后立即可见⁺进入细胞外空间。在我们的实验中，[K的下降⁺]_o个在K的第一个（离子导入）或两个（刺激）秒期间⁺清除是线性的，它发生在[K重叠水平的单个实验中⁺]_o个在有或无抑制剂的情况下，除非使用哇巴因。因此，我们量化了初始刺激后下降率[K⁺]_o个（单位：mM/sec），并将其用作K的直接度量⁺刺激后初始阶段的清除。在此期间，细胞外空间体积变化很小，几乎不受应用抑制剂的影响，因此不影响定量。我们没有使用时间常数或半衰期[K⁺]_o个回收，因为添加了K抑制剂⁺移位机制可以通过例如增加峰值[K来改变回收阶段的动力学⁺]_o个和/或在[K中生成清除后未及点⁺]_o个如Kir4.1抑制剂Ba的报道²⁺(Bay and Butt 2012年;Jauch等人，2002年;Oakley II等人，1992年). 抑制剂的这些额外作用可能会间接影响时间常数在不影响K速率的情况下⁺间隙（单位：mM/sec）。

NKCC1介导的星形胶质细胞细胞肿胀

NKCC1对整体K的强劲贡献⁺培养星形胶质细胞的摄取及其相关钾⁺-激活曲线促进NKCC1作为刺激诱发K清除的可能贡献者⁺在中枢神经系统中。NKCC1可能有助于其与底物共同运输水的能力(Zeuthen和MacAulay 2012)因此，作为一种分子机制负责K的去除⁺同时诱导刺激诱发的星形细胞肿胀。确定NKCC1在细胞外钾增加时直接介导星形细胞肿胀的能力⁺，我们使用了微流控细胞体积传感器(图2C). 这个实验装置是基于放置在一个小而封闭的腔室中的细胞，通过腔室施加恒定电流。在细胞膨胀时，感测室的自由体积减小，因此电阻增加。因此，相关的电压变化是对细胞体积变化的敏感而稳健的读出，并且在整个实验期间是稳定的(Ateya等人，2005年). 从K开始转换⁺-游离溶液（用胆碱等摩尔置换）到含有15 mM K的等渗溶液⁺细胞体积迅速增加(图2A，左侧面板）。K系列⁺-恢复灌注钾15分钟后，可重复诱导的体积增加⁺-自由控制溶液(图2A，中间面板）。用布美他尼（10μM）抑制NKCC1可降低K⁺-介导的细胞体积增加(图2A，右侧面板）至控制的3±1%，n=9。从含有3 mM K的外部溶液过渡⁺至含有7 mM K的等摩尔溶液⁺，细胞体积仍呈现强劲增长(图2B). 布美他尼使星形细胞肿胀降低至对照组的1±1%，n=7。因此，当NKCC1位于大鼠星形胶质细胞的原代培养物中时，可以明显地清除细胞外K⁺并且在这个过程中也会导致水的快速吸收。

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图2

K（K）⁺-诱导NKCC1介导的星形细胞肿胀.在微流体细胞体积传感器中用含有0mM K的对照溶液获得培养的星形胶质细胞的细胞体积的稳定基线记录⁺. (一)将细胞突然暴露于含有15 mM K的等渗试液中⁺如左面板中的黑色条所示。返回0 mM K后⁺暴露在15 mM K下15分钟⁺诱导的星形细胞肿胀率（中间面板）与最初追踪中获得的速率相似。K系列⁺-右图中加入布美他尼（10μM）可消除诱导的星形细胞肿胀。(B类)如（A）所示，但有3 mM K⁺在对照溶液中，然后用含有7 mM K的试验溶液进行等渗激发⁺（左侧面板）。K系列⁺-右图中加入布美他尼（10μM）可消除诱导的星形细胞肿胀。(C类)微流控池体积传感器的示意图，该传感器具有两个外部电极（电流在其之间传递）和两个内部电极（电压在其之间测量）。

抑制NKCC1并不影响K的比率⁺海马脑片细胞外间隙的清除与收缩

NKCC1对刺激诱发K的清除作用⁺在大鼠海马脑片中测定细胞外间隙的相关收缩。我们使用离子敏感微电极同时记录细胞外钾的浓度⁺（使用基于缬氨酸霉素的液膜溶液）和细胞外空间的相对大小（使用对探针阳离子TMA敏感的液膜溶液⁺)在同一个地方。将两个离子敏感电极和一个场电位电极的尖端放置在切片核心的CA1放射层中（参见图3A插入实验设计示意图）。1.5百万TMA⁺在记录反应之前，将其添加到过量溶液中，并使其在切片中平衡。TMA公司⁺实际上是膜不透水的，细胞外空间收缩时会增加其浓度，因此可以作为细胞外空间体积变化的读数(尼科尔森和菲利普斯1981;Voipio等人，1994年). 海马CA1区的局部电刺激（20 Hz，10秒）导致[K⁺]_o个瞬态至5-10mM（n=4，代表性迹线如图3A)与之平行的是细胞外场电位信号的负移（未图示）和细胞外间隙收缩至对照组的91.6–97.8%，n=4（图示为典型迹线图3B). 两个[K⁺]_o个而容积反应持续上升，直到刺激序列结束，电刺激停止后立即开始恢复。布美他奈（10μM）对NKCC1的抑制作用对K的速率没有影响⁺间隙（参见图3A). 用于量化刺激后K⁺我们使用了其初始速率（有关详细信息，请参见材料和方法）。在2秒量化间隔期间，用虚线标记图3A，[K⁺]_o个是时间的线性函数，清除率为0.67±0.16 mM/sec，n=4。K的比率⁺布美他尼存在时的清除率归一化为对照迹线的清除率，数据总结如下图3C，左侧面板，n=4。抑制NKCC1对细胞外间隙的收缩也没有影响（图3B，数据规范化并汇总于图3C，右侧面板，n=4）。综上所述，NKCC1不参与刺激后K⁺-海马细胞外间隙的恢复或相关收缩，尽管其在分子机制中具有明显的内在能力(图1和​和22).

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图3

NKCC1对K无贡献⁺-海马脑片的清除和细胞外空间收缩。采用离子敏感微电极同时测量细胞外[K⁺]_o个和细胞外间隙的相对大小（添加1.5 mM TMA后⁺至试验溶液）。(一)对CA1（插入）中放射状地层的电刺激（20 Hz时10秒）产生场电位。[K中刺激诱发变化的代表性痕迹⁺]_o个之前（黑色痕迹）和之后（灰色痕迹）暴露于布美他尼（10μM）。虚线表示直线段（r²在所有实验中≥0.99），用于量化K⁺衰减率。(B类)在与（A）相同的局部区域同时获得的相对细胞外空间的代表性记录；黑色痕迹表示对照痕迹，灰色痕迹表示在布美他尼存在下获得的痕迹。(C类)刺激后数据的归一化和汇总[K⁺]_o个衰变率（左侧面板）和细胞外空间收缩率（右侧面板）：布美奈德对[K⁺]_o个衰变率（对照组96.7±8.8%，n=4）或相对细胞外间隙（对照组94.3±4.8%，n=4）。数据以平均值±SEM表示，并通过Student配对t检验确定统计显著性。

Kir4.1-依赖空间缓冲对K的贡献⁺间隙

上述实验设计用于解决Kir4.1在刺激诱导K⁺海马脑片细胞外间隙的清除和相关收缩。在这组实验中，刺激参数（20赫兹，10秒）使细胞外钾增加⁺浓度为4–10 mM，n=5。刺激后K无统计学显著降低⁺在Kir4.1块上观察到100μM BaCl的衰减率₂(勒索和索尼默1995)（参见中的代表性痕迹图4A，左侧面板）。衰减率（0.61±0.15 mM/sec，n=5）是从K的初始2 sec获得的⁺间隙，其中K⁺去除是时间的线性函数。存在BaCl时获得的清除率₂归一化为控制轨迹的数据，数据汇总如下图4A，右侧面板，n=5。抑制Kir4.1不会影响高频刺激期间细胞外空间容积的变化（参见图4B，左面板，右面板中的汇总数据，n=3）。

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图4

Kir4.1对刺激后K没有贡献⁺-海马脑片的清除和细胞外间隙收缩.用离子敏感微电极测定钡的作用²⁺-Kir4.1对K的介导抑制⁺清除和细胞外间隙缩小，基本上与图3. (一)[K中刺激诱发变化的代表性痕迹⁺]_o个BaCl暴露前（黑色痕迹）和暴露后（灰色痕迹）₂（100μM），左侧面板。虚线标记线性段（带有r²在所有实验中≥0.99），用于量化K⁺衰减率。在BaCl存在下获得的数据₂对[K的衰减率进行了归一化控制和总结⁺]_o个刺激后（对照组的88.7±10.6%，n=5）和钾离子导入⁺（111.0±7.4%的控制，n=4），右侧面板。(B类)在与（A）相同的局部区域同时获得的相对细胞外空间的代表性记录；黑色痕迹表示控制痕迹，灰色痕迹表示在BaCl存在下获得的痕迹₂，左侧面板。BaCl存在下刺激引起的细胞外间隙收缩率₂将其归一化为对照组，并在右侧面板中总结（98.0±9.0%的对照组，n=3）（其中两项与K同时进行⁺测量，其中一项是单独监测细胞外间隙）。(C类)K的焦点应用⁺在含有抑制剂混合物（AP-5 40μM，NBQX 10μM，PiTX 100μM，CGP-55845 1μM，TTX 1μM）的情况下，通过5秒电流脉冲（由黑条指示）的离子导入获得。连续的离子导入脉冲导致[K的相同增加⁺]_o个（插入）。[K变化的代表性痕迹⁺]_o个BaCl暴露前（黑色痕迹）和暴露后（灰色痕迹）₂（100μM），左侧面板。虚线标记线性段（带有r²在所有实验中≥0.99），用于量化K⁺衰变率，在这组实验中，由于快速衰变，从而失去线性，涵盖1秒的范围，见（a），右侧面板中的汇总数据。峰值[K⁺]_o个在BaCl存在下获得的值₂将其归一化为对照组，并在右侧面板中进行总结（122.1±5.1%，n=4）。数据表示为平均值±SEM，统计显著性由单因素方差分析和Dunnett的多重比较确定事后（post-hoc）test和Student的配对t检验（**；第页< 0.01).

空间缓冲的范式依赖于K⁺从高K的不同区域移动⁺荷载传递至更远的隔间，其中[K⁺]_o个保持不变。可以说，高频刺激，如本实验设计中使用的高频刺激，会导致[K⁺]_o个它太大了，无法在记录现场观察到空间缓冲。本质上，在海马体的受刺激部分，[K⁺]_o个保持在基本水平可能不会发生，因此空间缓冲的前提条件将无法实现。因此，在随后的一组实验中，我们依赖于K的焦点应用⁺通过玻璃毛细管微吸管通过离子导入进入大脑切片。通过这种方式，我们生成了K的恒定点源⁺在切片中。为了防止自发的神经元活动，在人工脑脊液中添加了一系列抑制剂，以阻止电压门控钠的作用⁺通道（TTX）、GABA-（PiTX，CGP-55845）和谷氨酸受体（NBQX，AP-5）。产生5秒脉冲K⁺细胞外间隙在6-15 mM范围内升高，n=4。离子电导脉冲产生的[K的可比上升⁺]_o个在三个连续的控制脉冲期间(图4C，插入）。BaCl浴后施加的离子电泳脉冲₂峰值[K持续增加⁺]_o个，如中的代表轨迹所示图4C，左面板，右面板中总结。添加BaCl₂增加峰值[K⁺]_o个至对照组的122.1±5.1%，n=4，第页< 0.01. 刺激后K的随后比率⁺在不存在和存在100μM BaCl的情况下，清除率相似₂（参见图4C). 在脉冲后的最初1秒内，用虚线标记清除率（3.81±1.24 mM/sec，n=4），其中[K下降⁺]_o个是时间的线性函数（归一化数据汇总于图4A，右侧面板，n=4）。排除回收率受较高峰值K的影响⁺，在可比[K⁺]_o个浓度（从控制迹线的峰值开始，持续0.5秒，在此期间两条迹线均处于线性相位）。没有Ba²⁺-[K回收率的介导变化⁺]_o个用这种定量模式检测到（数据未显示）。因此，Kir4.1依赖的空间缓冲对刺激后[K的恢复⁺]_o个或与细胞外空间的相关收缩有关。然而，Kir4.1参与了K⁺进行清理在期间离子电泳应用[K⁺]_o个增加。

Na区块⁺/K（K）⁺-ATP酶降低细胞外K⁺以与亚单位亚型相关的剂量依赖性方式去除

刺激后NKCC1和Kir4.1均无明显参与[K⁺]_o个恢复后，我们试图确定钠的各种亚型的贡献⁺/K（K）⁺-ATP酶。在这组实验中，海马脑片的高频刺激（20赫兹，10秒）在对照溶液中产生的细胞外钾增加⁺浓度范围为4-13 mM，衰减率为0.73±0.18 mM/sec，n=7。在啮齿动物中，Na的α1亚型⁺/K（K）⁺-ATP酶α亚基对钠的敏感性低⁺/K（K）⁺-ATP酶抑制剂哇巴因（约1 mM哇巴因需要获得α1活性的完全阻断，而α2和α3亚型在5μM时被完全抑制(Blanco等人，1993年)). 这种差异使我们能够分别测试α2/α3和α1的贡献。然而，应该注意的是，Na的完整区块⁺/K（K）⁺-ATP酶活性降低了切片的活力，因此我们选择用50μM的哇巴因浓度部分抑制α1，这大致构成IC₅₀对于大鼠α1(珠宝和玲珑1991). K的基础水平⁺在细胞外间隙中，哇巴因的应用增加了，如图5A：5μM哇巴因导致基础[K⁺]_o个3.9±0.4 mM，n=7，50μM的哇巴因对a[K⁺]_o个4.8±0.8 mM，n=5。刺激后[K⁺]_o个钠的α2/α3亚基被阻断后，衰变率显著降低⁺/K（K）⁺-ATP酶（见代表性痕迹，深灰色，in图5A). 额外应用哇巴因（至50μM）导致钾严重受损⁺间隙（浅灰色痕迹图5A). 刺激后哇巴因依赖性降低率[K⁺]_o个回收率归一化为控制迹线，并总结为图5C，左侧面板。在5μM时，衰减率显著降低（69.3±9.3%，n=7，第页＜0.05）和50μ，第页<0.001）。钠的抑制⁺/K（K）⁺-含5μM哇巴因的ATP酶（阻断α2/α3）在高频刺激期间不影响细胞外空间容积的变化（见图5B，和中的汇总数据图5C，右侧面板，n=3）。钠的额外抑制⁺/K（K）⁺-50μM哇巴因的ATP酶活性导致增加刺激导致细胞外空间收缩，即当Na⁺/K（K）⁺-ATP酶的操作性较差。这些数据表明Na⁺/K（K）⁺-ATP酶介导的K⁺去除本身并不产生刺激诱导的星形细胞肿胀 的（参见中的代表性迹线图5B在中插入和汇总数据图5C，右侧面板）。因此，似乎不同Na的联合作用⁺/K（K）⁺-ATP酶亚型是神经释放钾摄取的关键机制⁺尽管在这个过程中没有引起星形细胞肿胀。

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图5

Na的抑制作用⁺/K（K）⁺-ATP酶延迟K⁺-海马脑片清除率。用离子敏感微电极测定哇巴因对钾的影响⁺电刺激后的间隙，基本上如图3. (一)[K中刺激诱发变化的代表性痕迹⁺]_o个在对照溶液（黑色痕迹）中，暴露于5μM哇巴因（深灰色痕迹），然后暴露于50μM哇巴因（浅灰色痕迹）。虚线表示线性2秒段（带有r²在所有实验中≥0.99），用于量化K⁺衰减率。(B）独立实验中相对细胞外空间的代表性记录；黑色痕迹表示控制痕迹，灰色痕迹表示使用5μM哇巴因后的记录。插页描述了使用50μM哇巴因（浅灰色痕迹）进行的类似实验。(C类)[K⁺]_o个将在哇巴因存在下获得的衰变率归一化为对照组，并对其进行总结（5μM哇巴因为对照组的69.3±9.3%，n=7，50μM哇巴因为对照的31.5±7.8%，n=5），左侧面板。将哇巴因存在时刺激引起的细胞外间隙收缩率归一化为对照组，并在右侧面板进行总结（对照组的99.3±4.4%，5μM哇巴因的n=3，对照组的131±15%，50μM哇巴因的n=4）。数据表示为平均值±SEM，统计显著性由单因素方差分析和Dunnett的多重比较确定事后（post-hoc）测试（*；第页< 0.05, ***,第页< 0.001).

作者非常重视夏洛特·古斯·艾弗森和卡蒂亚·科雷亚·冈卡夫斯·安德森提供的技术援助。我们感谢H.Waagepetersen教授和H.M.Nielsen教授在星形胶质细胞原代培养方面提供的技术援助，T.H.Braunstein博士对星形胶质细胞GFAP染色的帮助，堪萨斯大学医学中心的G.Blanco博士提供了编码Na的各种α和β亚型的cDNA⁺/K（K）⁺-ATP酶和微流体体积传感器的发明者；布法罗大学的S.Z.Hua博士、F.Sachs博士和S.Besch博士。感谢Sabina Hrabetova教授对手稿的批判性阅读。该项目由Lundbeck基金会（向NM和BRL）、芬兰科学院（KK）和Sigrid Jusélius基金会（KK，JV）资助。