2.1. SOCS3过度表达降低DCMEC细胞增殖和负调控JAK2/STAT5a信号通路及脂肪酸合成
SOCS3是公认的STAT负调控因子。为了测试SOCS3是否能够阻止DCMEC中STAT5a的激活,SOCS3过度表达,并在48小时分别用qRT-PCR和WB检测相关基因的表达。同时用CASY检测细胞增殖和活力。pGCMV-IRES-EGFP-SOCS3组SOCS3 mRNA表达显著增加(A) ●●●●。pGCMV-IRES-EGFP-SOCS3组SOCS3蛋白表达明显高于pGCMV-IRES-EGFP组(B、 C)。我们观察到DCMEC中SOCS3蛋白显著增加60%-65%。这表明SOCS3在感染pGCMV-IRES-EGFP-SOCS3的DCMEC中稳定且高表达。与空载体组相比,SOCS3转染细胞中STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR和β-酪蛋白的mRNA水平和蛋白表达明显降低(A–C)。在这里,我们证明了SOCS3在DCMEC中的过度表达显著抑制了细胞生长和活性(D、 E)。在本研究中,我们发现SOCS3蛋白分布在DCMEC的细胞质和细胞核中。细胞很少显示斑点状核SOCS3表达模式(F) ●●●●。在SOCS3蛋白过度表达的实验中,我们发现当SOCS3的水平升高时,其核定位水平较高(G、 I)。此外,在SOCS3过度表达后,通过免疫荧光评估p-STAT5a的定位。p-STAT5a蛋白分布于细胞质和细胞核。转染SOCS3基因后,细胞核中p-STAT5a表达水平下调(H、 J),与WB结果一致。
SOCS3过度表达对DCMEC泌乳和增殖的影响。DCMECs分为三组:转染SOCS3表达载体或空载体(对照组),未转染,生长48h(一)使用qRT-PCR检测生长48 h的DCMEC中的基因表达,并将其归一化为β-actin mRNA表达;(B类)SOCS3过表达后48小时生长的DCMECs中SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR、SREBP-1c、β-酪蛋白和β-肌动蛋白的蛋白质印迹结果;(C类)SOCS3过度表达后通过western blotting对SOCS3、STAT5a、p-STAT5a、mTOR、p-mTOR,SREBP-1c和β-酪蛋白/β-肌动蛋白相对折叠的灰度扫描结果;(D类,E类)用CASY测定生长24小时的DCMEC的增殖和存活率;(F类)SOCS3本地化。SOCS3(绿色)、细胞核(红色)。比例尺=75μm。(G公司)过度表达的SOCS3蛋白具有较高的DCMEC核定位水平。a: 细胞转染SOCS3表达结构并生长24小时;b: 用空载体转染细胞并生长24小时;c: 未转染细胞。SOCS3(绿色)、Giantin(红色)和DAPI(蓝色)。比例尺=20μm;(H(H))对DCMEC进行p-STAT5a免疫荧光染色。a: 细胞转染SOCS3表达结构并生长24小时;比例尺=75μm;b: 用空载体转染细胞并生长24小时;比例尺=20μm;c: 未转染细胞。p-STAT5(绿色)、Giantian(红色)和细胞核用DAPI(蓝色)复染。比例尺=20μm;(我,J型)SOCS3过度表达后的荧光染色分析。不同的上标表示与对照组相比存在显著差异。*或**表示与阴性对照组相比存在显著差异(对<0.05或对<0.01).
为了证明SOCS3对脂质合成的影响,我们检测了脂质代谢关键基因的表达,如SREBP-1c、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)mRNA水平。结果表明,SOCS3的过度表达下调了SREBP-1c、FAS、ACC和SCD mRNA水平(A) ●●●●。western blotting检测SREBP-1c蛋白的表达与mRNA水平的表达趋势一致。SOCS3明显抑制SREBP-1c蛋白的表达(B、 C)。这些结果表明,SOCS3的过度表达抑制了SREBP-1c的表达,并降低了脂肪酸的合成。
2.5. 讨论
通过SOCS3的过表达和抑制实验,我们证明SOCS3作为JAK2/STAT5a信号通路的抑制剂抑制了DCMEC中β-酪蛋白基因的表达和细胞增殖。转染细胞中STAT5a转录物的相对水平以及STAT5a和p-STAT5a-蛋白的表达与DCMEC中β-酪蛋白的表达相关。最近在小鼠和人身上的研究提供了SOCS3和STAT5之间的直接联系[26,27]. SOCS3通过几种不同的机制充当JAK-STAT信号传导的负调节器,但没有研究报告通过其与STAT5蛋白的直接相互作用实现负反馈机制,尽管其结果的总体趋势表明SOCS3在减弱STAT5表达中起作用[28,29]. 总之,这些数据表明,SOCS3可能是通过抑制STAT5a的活化而成为DCMEC中蛋白质合成的抑制剂。
STAT5a/b在乳腺中的作用一直存在争议,根据所研究的模型,有矛盾的证据。然而,在小鼠和牛乳腺中,越来越多的证据表明STAT5a对乳腺发育和乳蛋白表达至关重要[30,31]. 因此,我们研究了STAT5a在DCMEC中是否发挥同样的作用。STAT5a的抑制导致β-酪蛋白的mRNA水平和蛋白表达降低。这一结果与之前的研究一致,即小鼠乳腺中STAT5缺乏会导致小叶肺泡发育几乎完全丧失,导致妊娠和哺乳失败期间乳蛋白基因表达减少[32,33]. 基于这些发现,可以得出结论,SOCS3参与JAK2-STAT5a通路,以调节DCMEC中的乳蛋白合成。
为了探讨STAT5a和SOCS3之间的相互作用机制,我们试图确定过表达和抑制SOCS3蛋白是否会以依赖于SOCS3定位的方式改变激活的STAT5a蛋白水平,我们使用免疫荧光观察SOCS3的定位,我们发现SOCS3蛋白分布在细胞质和细胞核中,过表达的SOCS3蛋白质主要定位在细胞核中,可能会降低DCMEC中STAT5a蛋白的活性。抑制SOCS3后,细胞核内p-STAT5a水平升高。我们的结果表明,p-STAT5a的表达和亚细胞定位受SOCS3的调控,这将在细胞水平上提供SOCS3抑制STAT5a活性的评估。因此,这些结果与Kyeong-Hee Lee发现SOCS3在某些生物条件下从细胞质转移到细胞核的结果一致[34]因此,我们预测可能存在一种机制,即STAT5a等蛋白质与SOCS3相互作用,可能将其带入细胞核。
在这里,SOCS3在DCMEC中的表达依赖于STAT5a,这可以通过siRNA靶向STAT5a的DCMEC缺乏SOCS3表达来证明。结合其他报道,我们推断SOCS3基因可能是STAT5a激活靶点之一。该结果与Ehrentraut S的报告一致等在所有三种PCM1-JAK2细胞系(人类白血病/淋巴瘤细胞系)、MAC-1/2A/2B中,通过STAT5抑制剂匹莫齐德治疗对STAT5激活的抑制伴随着SOCS2/3表达的剂量依赖性损失[35]. 这一结果与Le Provost的结果不同等. [36]他发现STAT5a不参与刺激处女小鼠乳腺组织中SOCS3的表达。为了确定SOCS3是否通过STAT5a表达,必须识别SOCS3基因启动子中的STAT5结合位点。STAT5可以被募集到SOCS3启动子的STAT反应元件(pSRE)中,以启动其在人类中的转录,并且对小鼠SOCS3启动子区域的序列分析揭示了STAT5结合位点[9,37]. 根据这些,我们推断活化的STAT5a可能与DCMEC中SOCS3的启动子结合。总之,SOCS3是DCMEC中JAK2/STAT5a信号通路的负反馈调节器。简言之,STAT5a增加SOCS3的表达,然后SOCS3反过来限制进一步的STAT5a信号传导,从而实现细胞内负反馈回路。这是首次报道SOCS3抑制DCMEC中的乳蛋白合成。到目前为止,SOCS3在乳蛋白合成中的作用和机制已被证实。
最近对啮齿动物和反刍动物的研究强调了mTOR在调节乳蛋白合成中的作用[38,39]. 在本研究中,我们还发现SOCS3抑制mTOR的表达和磷酸化。SOCS3的这种负作用似乎不是DCMEC特有的,因为最近在氧诱导视网膜病变和癌症的小鼠模型中也有描述[40]. 这一结果进一步揭示了SOCS3参与调控DCMEC的牛奶合成。SOCS3调节mTOR的确切机制仍有待阐明。
DCEMC的数量和活性是牛奶生产的决定因素[41]. 因此,我们接下来阐明了SOCS3对细胞增殖的影响。通过CASY实验,我们发现SOCS3过度表达抑制细胞生长,而SOCS3抑制则诱导细胞生长。我们的数据表明,SOCS3本身是细胞增殖的抑制剂。此外,SOCS3作为STAT5a或mTOR磷酸化的负调控因子发挥作用。这些结果表明,SOCS3可能通过STAT5a或mTOR非依赖性机制抑制细胞增殖。这一发现与在人类肺癌中进行的研究相似,其中SOCS3也导致细胞生长减少[42].
在这里,我们的结果证实SOCS3影响DCMEC中SREBP-1c的表达及其下游调控靶点FAS、SCD和ACC。这一结果与早期的研究形成了鲜明对比,在胰岛素信号SOCS3过度表达增加了病态肥胖女性和肥胖糖尿病小鼠肝脏中SREBP-1c及其下游调节靶点[43,44]. 目前尚不清楚SREBP-1c和SOCS3之间的结合是直接的还是通过mTOR或STAT5a等乳合成关键基因的表达实现的。SREBP-1在牛脂质合成的综合调控中起着重要作用[45]. SOCS3和SREBP-1c之间的联系的发现为我们理解调节脂质合成的分子机制打开了新的篇章。
蛋氨酸是一种必需氨基酸,是蛋白质合成的底物。在这里,Met治疗导致更多细胞增殖,mTOR、STAT5a和β-酪蛋白的表达显著增加。令人惊讶的是,SOCS3的丰度并没有增加,反而减少了。必需氨基酸的存在导致直接诱导mTOR激活,例如直接与Rag GTPase结合的亮氨酸-tRNA合成酶(LRS)激活mTORC1[46]有助于提高乳蛋白基因表达[47]. 我们推断Met对mTOR激活的积极作用可能是降低SOCS3表达的主要原因。但机制尚不清楚。结合我们的报告,我们预测保持SOCS3处于低水平状态对于确保泌乳和乳腺上皮增殖而不是启动细胞凋亡非常重要。Met可以通过抑制SOCS3表达部分上调牛奶蛋白合成。