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单元格元数据。作者手稿；PMC 2013年6月6日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格元数据。2012年6月6日；15(6): 827–837.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cmet.2012.05.001
PMCID公司：下午C3372870
NIHMSID公司：NIHMS376428
PMID：22682223

肿瘤代谢分析显示基因多样性的人脑胶质母细胞瘤中线粒体葡萄糖氧化体内

艾萨克·马林·瓦伦西亚,1,2 杨晨东,1,11 Tomoyuki Mashimo先生,三，8 曹业云,2,8 Hyeonman Baek公司,三，9 杨晓丽,三，8 Kartik N.Rajagopalan公司,1,11 梅丽莎·麦迪,三，8 Vamsidhara Vemiredid公司,三，8 赵振泽,三，8 凌才,4 李维斯-好,1,2 本杰明·P·图,4 金莫·哈坦帕,5,8 布鲁斯·米奇,6,8 何塞·马泰斯,13 胡安·帕斯夸尔,1,2,7 伊丽莎白·马赫,2,三，8 克雷格·R·马洛伊,9,12 拉尔夫·德贝拉迪尼斯,1,10,11和罗伯特·巴乔2,三，8
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

代谢失调是癌细胞系的一个特征，但对于葡萄糖和其他营养素在肿瘤生长的自然微环境中的命运知之甚少。研究肿瘤代谢体内，我们使用原发性人类胶质母细胞瘤（GBM）的原位小鼠模型。我们注入了13将C标记的营养素注入携带三个独立GBM系的小鼠，每个系都有一组不同的突变。所有三条线都显示出糖酵解，正如侵袭性肿瘤所预期的那样。他们还表现出出乎意料的代谢复杂性，通过丙酮酸脱氢酶和柠檬酸循环氧化葡萄糖，并利用葡萄糖提供补充和其他生物合成活动。将肿瘤与周围大脑进行比较，发现了明显的代谢差异，尤其是肿瘤内大量谷氨酰胺库的积累。许多相同的活性在培养的细胞中得以保存体外来自肿瘤。因此，GBM细胞在恶性肿瘤生长过程中利用线粒体葡萄糖氧化体内.

引言

恶性转化是由促进不受抑制的增殖、废除细胞死亡程序和重新编程代谢的基因突变驱动的(DeBerardinis等人，2008年a;Hanahan和Weinberg，2011年). 肿瘤代谢现在是一个密集研究的领域，以确定新的治疗靶点和下一代成像的生物标记物(Kurhanewicz等人，2011年;Tennant等人，2010年). 探索癌症代谢的临床应用需要准确了解人类肿瘤的代谢途径就地细胞培养研究揭示了致瘤突变如何刺激以糖酵解率高为特征的代谢表型（相对于氧化代谢而言）(Ramanathan等人，2005年)，并且使用同位素示踪方法进行的详细研究描述了在培养的癌细胞系中代谢通量的复杂性(福布斯等，2006年). 然而，在将这些发现扩展到体内背景，因为原代肿瘤细胞在适应培养生长时获得广泛的基因组和基因表达变化(Lee等人，2006年;Mehrian Shai等人，2005年)并且可能失去天然微环境对新陈代谢的影响。最近的工作强调了后一个问题的重要性，证明了相邻正常细胞在支持肿瘤细胞代谢中的作用(Nieman等人，2011年;Zhang等人，2012年).

胶质母细胞瘤（GBM）是人类最常见的原发性恶性脑肿瘤，具有高度的代谢活性，可避免多种形式的治疗，导致生存时间缩短。GBM代谢的主流观点是，这些肿瘤在线粒体柠檬酸循环（CAC）中有很高的糖酵解和谷氨酸分解率，葡萄糖氧化最小。这种认识主要基于对在最大增殖条件下生长的胶质瘤细胞系的研究(DeBerardinis等人，2007年;Portais等人，1996年). 基于葡萄糖氧化被抑制的假设，GBM代谢的临床靶向性正在研究中体内(Michelakis等人，2010年). 然而，最近对完整人脑肿瘤的研究表明，其代谢涉及广泛的葡萄糖氧化体内(Maher等人，2012年). 在那项研究中，患者被注入13通过以下方法分析孤立脑肿块切除过程中的C-葡萄糖和从肿瘤中提取的代谢物13C核磁共振波谱检测葡萄糖的代谢命运。所有分析的肿瘤，包括高级别胶质瘤和脑转移瘤，均显示丙酮酸脱氢酶（PDH）和CAC对葡萄糖的过度氧化。

在这里，我们通过输注研究了GBM代谢13将C-标记的营养素注入携带人GBM细胞的小鼠，这些细胞是从新鲜切除的肿瘤中分离出来的，并直接植入NOD-SCID小鼠大脑，而无需事先适应细胞培养（称为人GBM原位肿瘤，HOTs）。由于越来越多的证据表明GBM是由细胞层次结构组织的，其中只有一个细胞亚群驱动肿瘤生长，因此该模型特别有趣。胶质瘤干细胞或肿瘤起始细胞在移植到免疫功能受损小鼠的大脑中时，具有独特的形成肿瘤的能力(Singh等人，2004年). 因此，HOT模型系统为研究人类GBM中最相关细胞类型在类似于其在人脑中生长的条件下的代谢提供了一个独特的机会。我们的目标是双重的：首先，确定GBM细胞株消耗最快的两种营养素葡萄糖和谷氨酰胺的代谢命运；其次，为了确定肿瘤和周围大脑之间的明确代谢差异，推断区分这两个分区的代谢活动可以为癌症治疗和/或肿瘤特异性成像提供靶点。数据表明，来自多个独立的人类GBM的HOT通过PDH和CAC表现出葡萄糖氧化、回补、大量谷氨酰胺蓄积，其中包括部分合成的谷氨酰胺从头开始来自葡萄糖和最小的谷氨酰胺分解。

结果

基因多样、原位移植的人类GBM贪婪地消耗葡萄糖

在人类GBM的手术切除过程中分离肿瘤细胞，并将其植入NOD-SCID小鼠大脑的壳核尾状区。2-3个月后，由于颅内肿块扩大，小鼠出现症状。对病前小鼠的肿瘤细胞进行解剖和重新植入，在不适应培养的情况下，使肿瘤能够在小鼠大脑中无限期繁殖。将每个HOT的基因组图谱（数组CGH，Nimblegen）与衍生它们的患者肿瘤进行比较，结果表明它们无法区分（数据未显示）。此外，HOT保留了亲代肿瘤的表型特征，包括弥漫浸润、高有丝分裂指数（Ki67）(图1A)和18氟-2-脱氧葡萄糖(18FDG）摄取(图1B).

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根据三种原发性人类GBM建立的人类原位肿瘤（HOT）

（A） 苏木精和伊红（H&E）染色，EGFR原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）以及亲代人GBM和代表性小鼠HOT的Ki67染色。

（B） MRI和18来自每个亲本系的代表性小鼠HOT（M-1、M-2、M-3）的FDG-PET。箭头表示右半球的GBM质量。

（C） HOT M-1、M-2和M-3的基因组和IHC数据摘要。

在代谢研究中，我们选择了三个株系（M-1、M-2和M-3），它们含有人类GBM中常见的突变(图1C). 这些包括表皮生长因子受体的基因组扩增(表皮生长因子受体)高水平EGFR蛋白基因（M-2和M-3，图1A); EGFR变体EGFRvIII（M-2，图S1A); 血小板衍生生长因子受体-α（M-1，图S1A). 纯合子缺失PTEN公司在M-1中观察到。所有3条线路都失去了INK4A/ARF公司基因座和完整的p53（数据未显示）。生长因子受体增强和/或丢失PTEN公司，所有三条线均显示Akt/mTOR信号的结构性激活，M-3也有ERK的激活(图S1A). 我们通过测定缺氧诱导因子-1和-2（HIF-1α和HIF-2α）α亚基的丰度来检查肿瘤是否缺氧。少数HOT细胞系含有可检测到的HIF-1α水平，但在M-1、M-2或M-3中这不是一个一致的特征，并且没有肿瘤显示出显著的HIF-2α水平(图S1B). 此外，组织病理学分析显示，GBM细胞浸润于宿主脑微血管附近，维持了紧密连接相关蛋白（ZO-1，Occludin-1）和相关周细胞的正常模式(图S1C). 这些观察结果表明，HOT可能与预先存在的宿主脑血管系统共同提供营养支持，或许可以避免明显的缺氧。

A类13C-葡萄糖灌注法建立原位GBM肿瘤内同位素稳态

输液13C-葡萄糖和其他同位素标记的营养素已用于分析新陈代谢体内包括人体肿瘤(Fan等人，2009年;Landau等人，1996年;Maher等人，2012年). 为了建立最大13在HOT中的C富集和同位素稳定状态，我们注入13将C-葡萄糖注入来自同一人类GBM的荷瘤小鼠体内。所有小鼠均接受[U-13C] 葡萄糖，然后持续输注300分钟。在每次输注结束时，13在血糖中测定了C的富集度，并迅速将肿瘤从周围的大脑中分离出来。通过核磁共振分析从肿瘤中提取的代谢物，以确定每个时间点的标记模式。超过50%的血糖是13C在60分钟内标记，并且在输液期间保持该水平(图2A). 在肿瘤中，13监测谷氨酸和谷氨酰胺碳2、3和4中的C标记，作为同位素稳定状态的标记(Malloy等人，1987年). 所有这些碳都在30分钟内被标记。尽管这些样品是从几只不同的小鼠身上获得的，但从这些样品中出现了标记的平稳演变(图2B). 这表明代谢活性在这些单个肿瘤中高度保守。150分钟后，标记模式没有明显变化，表明同位素已达到稳定状态(图2B). 随后的所有实验都使用了一个药丸，然后持续输液150分钟。

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时间进程13热负荷小鼠的C-葡萄糖输注

（A） 四只携带来自同一亲代肿瘤的HOT的小鼠被注入[U-13C] 葡萄糖达到指定时间。时间进程显示13本次时间进程实验中使用的单个小鼠的血糖C浓度（%）。假设时间0的富集度为0%。所有小鼠均接受[U-13C] 葡萄糖超过1分钟，然后连续[U-13C] 实验程序中描述的葡萄糖输注。

（B） 谷氨酸和谷氨酰胺的碳2、3和4的核磁共振同位素分析。这些碳在13150分钟[U后贴上C标签-13C] 葡萄糖输注。

原位GBM同时使用糖酵解和葡萄糖氧化

为了确定这些肿瘤中葡萄糖的代谢命运，并比较肿瘤与周围脑组织的代谢活性，从每个品系的小鼠体内注入[1,6-13C] 葡萄糖。这种示踪剂探测葡萄糖供应的许多途径，包括糖酵解、CAC和氨基酸生物合成(图3A; 看见补充方法用于解释13C核磁共振谱）。13脑和肿瘤组织提取物的C核磁共振波谱显示13许多代谢物中的C信号(图3,S2系列). 大脑光谱分辨率很高，包含预期的13与CAC交换的代谢产物的C-标记，包括谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）(图3B,S2A、C). 因为丙酮酸来源于[1,6-13C] 葡萄糖通过糖酵解在碳3（C3）处标记，13C类-13只有当草酰乙酸和乙酰辅酶A均为13富含C。当CAC在大脑中正常翻转（循环）时，就会发生这种情况。13由于糖酵解，所有脑样本中都有明显的C-乳酸(图3B,S2A、C).

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[1,6的代谢-13C] HOT和周围大脑中的葡萄糖

（A） [1,6的图解-13C] 葡萄糖代谢。填充符号为13C和开放符号是12C.该图显示了13C之后，葡萄糖通过糖酵解、甘氨酸合成和CAC的多次循环进行代谢。数字是指碳的位置。在底部，光谱显示了13单独标记在位置4（S，单线态）或标记在位置3和4（D34，3-4双态）的谷氨酸盐的C NMR光谱，详见补充实验程序缩写：Glc，葡萄糖；Glc-6-P，葡萄糖-6-磷酸；GLY，甘氨酸；PYR，丙酮酸；LAC，乳酸；Ac-CoA，乙酰-CoA；CIT，柠檬酸盐；α-KG，α-酮戊二酸；OAA，草酰乙酸；GLU，谷氨酸；GLN、谷氨酰胺；乳酸脱氢酶；PDH、丙酮酸脱氢酶；GS，谷氨酰胺合成酶。

（B） 注射[1,6的M-2 HOT小鼠的脑和（C）肿瘤光谱-13C] 葡萄糖。插图为GLU和GLN C2、C3和C4。本文中所有光谱的化学位移分配均相同：1,NAA C2；2,天冬氨酸C2；三，丙氨酸C2；4,牛磺酸C1；5,甘氨酸C2；6,NAA C3；7,GABA C4；8,肌酸C2；9,天冬氨酸C3；10,牛磺酸C2；11,GABA C2；12–13,未分配；14,γ-氨基丁酸C3；15,NAA C6；16,乳酸C3。缩写：S，singlet；D、 双股；T、 三胞胎；Q、 四重奏；ppm，百万分之一。

尽管肿瘤样品体积较小（平均230 mg），但肿瘤光谱分辨率良好，具有良好的信噪比和乳酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺的广泛标记(图3C,S2B、D). 这些光谱中包含少量GABA标记，GABA是在一个GABA能神经元亚群中合成的，表明肿瘤片段中富含GBM细胞。组织病理学和神经元特异性免疫组织化学（IHC）在每个HOT中都证实了这一点，显示肿瘤细胞数>90%，正常神经元丢失（数据未显示）。在所有三种光谱中观察到的谷氨酸和谷氨酰胺在C4中的标记是由肿瘤中丙酮酸脱氢酶（PDH）的活性引起的(图3A).13C类-13在所有三种光谱中，谷氨酸和谷氨酰胺中也存在C多重态(图3C,S2B、D)显示肿瘤中CAC的正常转换。此外，谷氨酰胺标记显示肿瘤合成了谷氨酰胺从头开始来自葡萄糖衍生的谷氨酸。与大脑相比，所有三个肿瘤的谷氨酰胺标记率都比谷氨酸高，肿瘤中C2、C3和C4的谷氨酰胺与谷氨酸面积之比分别为1.11±0.23、1.11±0.251和1.01±0.26，大脑中分别为0.43±0.02、0.49±0.04和0.42±0.02（平均值±S.E.M.）。因此，所有三种HOT都有完整的葡萄糖氧化途径，GABA、谷氨酰胺和谷氨酸标记的差异证明肿瘤在代谢上与大脑不同体内关于他们对葡萄糖衍生代谢物的处理。

然后向两只分别携带HOT M1-M3的小鼠注射[U-13C] 葡萄糖（在所有六个位置标记葡萄糖13C） ●●●●。在这个方案中(图4A)，葡萄糖衍生丙酮酸和乙酰辅酶A是均匀的13C标记，以便在第一次CAC转向期间发生多重波。在所有小鼠中，大脑和肿瘤的光谱都包含谷氨酸和谷氨酰胺的显著4-5倍，证实了PDH在两个区室中的活性(图4B、C,S3A–D系列). CAC完全周转的证据包括谷氨酸C4和谷氨酰胺C4的四分体（Q）。与[1,6中的数据一致-13C] 葡萄糖输注，产生谷氨酰胺从头开始来自两个隔室中葡萄糖衍生的谷氨酸。同样，肿瘤中谷氨酰胺相对于谷氨酸的整体信号高于大脑中的信号(图4D). 三种肿瘤均表达谷氨酰胺合成酶（GS），该酶将谷氨酸转化为谷氨酰胺，肿瘤组织提取物具有GS酶活性(图4E). 测量注射[1,6-13C] 葡萄糖或[U-13C] 葡萄糖（n=9）表明，与大脑相比，肿瘤每克组织中含有的谷氨酰胺显著增多，谷氨酸显著减少(图4F). 我们还评估了150例人脑胶质瘤组织微阵列中GS的表达。相对于低度恶性胶质瘤和少突胶质瘤，GS在GBM中高表达(图4G)表明该酶的表达和从葡萄糖衍生的谷氨酸合成谷氨酰胺的能力是GBM的显著代谢特征。

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[U的代谢-13C] HOT和周围大脑中的葡萄糖

（A） [U的图解-13C] 葡萄糖代谢。参见图例图3A和补充实验程序详细信息和缩写。

（B） 注射[U的M-2 HOT小鼠的脑和（C）肿瘤光谱-13C] 葡萄糖。插入物为谷氨酸（GLU）和谷氨酰胺（GLN）C2、C3和C4。

（D） 肿瘤和周围大脑中碳2、3和4的谷氨酰胺面积与谷氨酸面积的比值。数据是六只小鼠的平均值和S.E.M.，三个HOT品系各两只。统计分析：Wilcoxon符号秩检验*，第页<0.05.

（E）顶部，HOT系肿瘤（T）和周围脑（B）中的谷氨酰胺合成酶（GS）western blot。底部两个人脑样本（HuB1、HuB2）、三个小鼠脑样本（MoB1–MoB3）和三个HOT（M-1至M-3）中的GS酶活性。MoB3是肿瘤M-1周围的脑组织。数据是每个样本三个重复的平均值和S.D。

（F） 肿瘤和脑提取物中GLN和GLU的总丰度（n=9），通过高效液相色谱法测定。数据为平均值和S.D.*，p<0.05；**，p<0.005，学生t检验。

（G） 由GBM（n=81）、低度（II–III级）胶质瘤（LGG，n=37）和少突胶质瘤（Oligo，n=33）组成的组织芯片中GS表达的免疫组织化学（IHC）评分。数据为平均值和S.E.M.***，p<0.001，采用Dunnett事后检验的单因素方差分析。

由于光谱包括完全解析的多重态，我们使用谷氨酸等位体分析来估计与葡萄糖氧化相关的一些主要代谢活动。假设研究中的组织是代谢同质的，同位素分析从谷氨酸多峰的相对峰面积计算特定的代谢参数(Malloy等人，1987年;雪莉和马洛伊，2002年). 该分析表明，血糖是肿瘤中乙酰辅酶A的主要来源，与在该模型中观察到的强劲的葡萄糖氧化和PDH活性一致(图S3E). 肿瘤中葡萄糖对乙酰辅酶A的贡献与大脑相似(图S3E). 无补体，CAC在脑内生成神经递质合成和细胞生长过程中大分子合成的多余中间产物的过程(Owen等人，2002年)也对两个分区的总体肿瘤CAC活性有显著影响(图S3F).

原位GBM缺乏谷氨酰胺分解代谢

接下来我们研究了肿瘤中回补的潜在机制。谷氨酰胺是许多癌细胞的主要回补营养素(DeBerardinis等人，2007年;Portais等人，1996年)和c-Myc水平高的细胞具有较高的谷氨酰胺分解代谢率，并且需要谷氨酰胺才能在培养中存活和生长(怀斯等人，2008年;Yueva等人，2007年). c-Myc调节谷氨酰胺酶（GLS）的水平，GLS是一种在利用谷氨酰胺分解代谢进行再生的细胞中将谷氨酰胺转化为谷氨酸的酶(Gao等人，2009年). 然而，其他肿瘤细胞使用需要丙酮酸羧化酶（PC）的葡萄糖依赖性再生途径，这些细胞不需要表达GLS或分解谷氨酰胺(Cheng等人，2011年). 通过IHC和Western blot检测，相对于周围大脑，HOTs M-1和M-3具有丰富的c-Myc表达(图5A、B). 正如所料，M-1和M-3也表达GLS，而M-2不表达。然而，在所有病例中，GLS在周围大脑中的含量要比肿瘤中的含量丰富得多。相比之下，PC在所有肿瘤中的表达水平与周围大脑更相似(图5B). 检查13所有注入[U的肿瘤的C光谱-13C] 葡萄糖显示谷氨酸C2中存在2–3倍，这一特征与PC活性一致(Cheng等人，2011年). 然而，其他途径，包括CAC的多次转向，也可能产生这种双重效应。为了明确检测PC活性，对患有HOT M-1肿瘤的小鼠注射[3,4-13C] 葡萄糖。因为以这种方式标记的葡萄糖会产生[1-13C] 丙酮酸，13C仅在PC处于活动状态时才进入CAC(图5C). 由此产生的肿瘤13C光谱包含几个与PC活性一致的特征，包括天冬氨酸中碳1和碳4的标记，以及相对于谷氨酸和谷氨酰胺的碳5，碳1中标记过量(图5C). 总之，数据表明PC有助于这些肿瘤的修复。

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HOT中的修复

（A） HOT肿瘤中的c-Myc IHC。

（B） HOT肿瘤（T）和周围脑（B）中c-Myc和两种补体酶谷氨酰胺酶（GLS）和丙酮酸羧化酶（PC）的蛋白质丰度。

（C）13注入[3,4的M-1肿瘤的C核磁共振谱-13C] 葡萄糖。该图表明，在这种输液中，如果谷氨酸和谷氨酰胺中C1信号超过C5信号，则PC激活。GLN5未明确分配；它要么是指示的峰值，要么与ASP4共振，两者都小于GLN1峰值。

三种HOT中葡萄糖衍生谷氨酰胺的积累，加上PC活性，提出了它们是否参与谷氨酰胺分解代谢的问题。为了解决这个问题，每行中的一只老鼠被注入[U-13C] 谷氨酰胺(图6,S4系列). 存在[U-13C] 肿瘤和大脑中的谷氨酰胺由谷氨酰胺C2和C4的四分位和C3的三分位表示(图6B、C和S4A–D系列). 在肿瘤中，谷氨酰胺多聚体远远超过谷氨酸标记，而在周围大脑中则相反。总体模式显示，血液传播的谷氨酰胺被肿瘤吸收，但没有显著代谢。有趣的是，所有三个肿瘤都注入了[U-13C] 谷氨酰胺在谷氨酸C4也含有显著的4-5倍(图6D,S4B、D). 当标记C4和C5而非C3时，会出现这些情况，因此不能通过[U的直接转换生成图案-13C] 谷氨酰胺到[U-13C] 谷氨酸。数据表明13C标记的葡萄糖或乳酸盐进入肿瘤并被氧化。因为谷氨酰胺是一种极好的糖异生前体(Nurjhan等人，1995年)，我们使用质谱法测量13[U期间血糖中的C富集-13C] 谷氨酰胺输注(图6E). 每只小鼠都有显著比例的葡萄糖m+3，如果丙酮酸来自[U-13C] 谷氨酰胺在肝脏或其他地方转化为葡萄糖(图6F). 根据葡萄糖m+3/谷氨酰胺m+5的比值计算，标准化后的葡萄糖富集度为23±6%(图6E). 其中两个血浆样本也含有乳酸盐m+3，它可能是通过谷氨酰胺衍生葡萄糖的谷氨酰胺水解或糖酵解产生的。在所有三种肿瘤中观察到乳酸C3的2-3倍(图6D)，也反映了[U-13C] 谷氨酰胺在其他组织中的释放13C-葡萄糖和/或13C-乳酸对肿瘤的作用。这些观察结果强化了这样一个观点，即在这些肿瘤中，葡萄糖比谷氨酰胺更适合于氧化代谢。

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HOT使用葡萄糖而不是谷氨酰胺来供应柠檬酸循环

（A） [U的图解-13C] 谷氨酰胺代谢。参见图例图3A和补充实验程序详细信息和缩写。

（B） 注射[U的M-2 HOT小鼠的脑和（C）肿瘤光谱-13C] 谷氨酰胺。插入物为谷氨酸（GLU）和谷氨酰胺（GLN）C3和C4。

（D） 注入[U的三种肿瘤中GLU4和LAC3多重波的扩张-13C] -谷氨酰胺。箭头突出显示乳酸的2-3倍和谷氨酸的4-5倍。

（E）13注射[U的小鼠血浆谷氨酰胺、葡萄糖和乳酸中C的富集-13C] 谷氨酰胺。数据为三只携带HOT的小鼠的平均±S.D。

（F） 肿瘤外发生的代谢活动示意图，[U-13C] -谷氨酰胺转化为葡萄糖和乳酸（绿色虚线箭头），在血浆中检测到。肿瘤的后续代谢（黑色箭头）使用13C葡萄糖和/或乳酸供应CAC。

原位GBM来源细胞的谷氨酰胺非依赖性

最后，为了确定这些活动是否是细胞自主的，我们从HOT M-3中分离出GBM细胞，并将其作为神经球进行短暂培养。成功的神经圈分离支持了这样的观点，即HOT含有癌症干细胞，代表真正的恶性GBM细胞类型。这些原代GBM细胞高度依赖葡萄糖，但与谷氨酰胺分解代谢的缺乏一致体内，它们的生存不需要谷氨酰胺，并且在培养一周的时间内，在没有任何谷氨酰胺的情况下能够保持至少较低的生长速度(图7A、B). 来自其他HOT的另外两个神经球细胞系显示出类似的特性(图7A、B). 所有三个神经球细胞株表达类似水平的c-Myc、PC和GS，但没有一个表达高水平的GLS(图S5A). 然后用[U-13C] 通过质谱分析葡萄糖和代谢物，确定同位素富集。在所有三种细胞系中，CAC都被葡萄糖高度富集，这些细胞中超过一半的柠檬酸分子含有13六个碳中至少有四个碳(图7C). 谷氨酸、苹果酸和天冬氨酸也高度富集(图S5B). 谷氨酰胺是由葡萄糖大量产生的(图7D)，因为它是体内因此，这些神经球通过代谢程序从葡萄糖中产生谷氨酰胺，并在不需要细胞外谷氨酰胺的情况下生存和生长。

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HOT细胞在没有外源性谷氨酰胺的情况下存活和生长

（A） 在含有葡萄糖和谷氨酰胺、谷氨酰胺单独或葡萄糖单独的培养基中，由三种HOT（M-3、C419和133P）衍生的神经球培养物中的存活率和（B）活细胞数。虚线表示实验开始时电镀的电池数量。数据是三种独立文化的平均±S.D.（**，第页<0.005，学生t检验）。

（C） 柠檬酸盐在[U培养基中培养的神经球中的质量同位素分布-13C] 葡萄糖。数据是三种独立文化的平均±S.D。

（D） 谷氨酰胺在同一细胞中的质量同位素分布。数据是三种独立文化的平均±S.D。

讨论

我们在一个生物学精确的GBM小鼠模型中分析了营养代谢。与普遍认为肿瘤细胞线粒体功能减弱的观点相反，数据表明CAC中的氧化是这些细胞中葡萄糖碳的重要命运18FDG-PET阳性肿瘤。GBM的整体代谢表型涉及将葡萄糖碳分配到氧化和非氧化途径中，以产生能量和大分子前体。因此，我们的发现排除了肿瘤代谢受限于侵袭性生长期间有氧糖酵解的可能性体内，特别是在弥漫性浸润的GBM中，这确保了进入大脑富含营养和氧气的环境。通过PDH的流量在所分析的每个肿瘤中都是完整的，并且是进入CAC的主要碳源，就像它在周围的大脑中一样。这一观察结果与普遍认为PDH在高级别肿瘤中受到抑制的假设相矛盾(Michelakis等人，2010年). HOT代谢的差异体内在癌细胞系中在体外可能反映了对长期培养的适应，影响代谢的微环境因素的丧失，或者癌症细胞系的某些代谢特征，特别是Warburg效应，反映了培养中细胞增殖的最大速率，而不是恶性肿瘤本身(Debrardinis等人，2008b). 重要的是，这里研究的HOT显示出与原发性人类GBM的许多代谢相似性，原发性人类GBM也使用PDH、CAC和GS体内(Maher等人，2012年).

一个有趣的发现是，在这项研究中密切研究的三种HOT具有相似的代谢特征，尽管它们来自具有不同驱动基因突变的独立人类肿瘤。虽然两者都有表皮生长因子受体和PTEN公司调节PI3K信号转导，进而控制肿瘤细胞的葡萄糖代谢(Elstrom等人，2004年;刘等人，1998年;Myers等人，1998年)，这三种HOT融合到一个相似的代谢表型上表明两者都不是表皮生长因子受体函数增益norPTEN公司功能丧失是葡萄糖摄取和氧化的必要条件。相反，基因组信息和肿瘤代谢之间的关系可能反映了肿瘤等级，或者可能取决于在局部微环境的影响下以细胞-文本特定方式运行的生长调节通路之间的复杂串扰。检测具有不同特征性GBM突变模式的额外HOT，应用其他方法研究更广泛的代谢组，以及研究特定信号通路的特定作用的功能丧失研究，对于确定GBM代谢的全谱是必要的体内以及癌基因在这些肿瘤中协调代谢的确切作用。

比较13肿瘤和周围大脑中的C代谢表现出不同的代谢特征，其中最引人注目的是肿瘤中有大量的谷氨酰胺库。肿瘤和肿瘤衍生的神经球模拟了癌症细胞系的一个子集的代谢，这些细胞系依赖葡萄糖向CAC提供碳和补体流量，并且生长不需要外源性谷氨酰胺(Cheng等人，2011年). 在正常大脑中，谷氨酰胺与神经元和星形胶质细胞之间的谷氨酸迅速交换，但在HOT中，这一循环明显受到干扰。根据标记数据，很明显这三种HOT都合成谷氨酰胺样的正常星形胶质细胞，这可能反映了它们的细胞起源。然而，从头开始谷氨酰胺合成似乎不足以解释庞大的谷氨酰胺库，因为HOT并不比周围大脑具有更多的GS酶活性。谷氨酰胺积累可能是由以下活动的组合引起的从头开始与正常星形胶质细胞相比，谷氨酰胺的合成、从血液供应中摄取，可能会降低谷氨酰胺的输出速率。肿瘤细胞密度高和肿瘤中相应的神经元缺乏也可能导致谷氨酰胺积聚。我们推测GBM中的高谷氨酰胺含量可以作为使用18用于PET的F-标记谷氨酰胺类似物，或具有高场磁共振波谱，如甘氨酸和2-羟基戊二酸的证明(Choi等人，2011年;Choi等人，2012年;Qu等人，2011年).

发展新陈代谢导向的癌症治疗的潜力在于肿瘤具有区别于正常组织的新陈代谢偏好和脆弱性体内然而，这一假设的直接证据不足。进行了Warburg的经典实验体外在肿瘤切片上(Koppenol等人，2011年)随后的绝大多数数据都来自癌细胞系。这些都是信息丰富的方法，但在将活肿瘤与自然微环境和营养及氧气供应分离之前，它们缺乏观察活肿瘤代谢的关键组成部分。13碳同位素研究很简单，我们的数据表明，可以从小组织样本中产生重要且潜在的可翻译信息。此外，将这种方法推广到其他类型的肿瘤没有任何障碍，因为使用了类似的策略来定性描述肺部肿瘤的代谢(Fan等人，2009年;Fan等人，2011年). 因此，我们预计使用稳定同位素进行代谢通量研究体内将极大地促进对真诚地肿瘤在肿瘤小鼠模型和人类患者中的代谢，可能能够识别治疗或诊断成像的靶点。

实验程序

人类原位肿瘤（HOT）模型

根据机构审查委员会批准的方案，在德克萨斯大学西南医学中心获得书面知情同意后，从患者身上获取肿瘤样本。本研究的动物部分是根据机构动物护理和使用委员会批准的方案进行的。用木瓜蛋白酶和5×10的悬浮液分离肿瘤组织4如前所述，将细胞立体定向注射到6周龄NOD/SCID小鼠的右尾状核(Marian等人，2010年). 通过MRI（见下文）和动物的神经状态监测肿瘤生长。

小鼠脑MRI与肿瘤

使用7-T小型动物MR系统（瓦里安公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托）进行MR成像，该系统具有40 mm（内径）的水平Millipede™如上所述的线圈(Marin-Valencia等人，2012年).

18FDG-PET成像

18FDG-PET成像是在一个小型动物PET扫描仪中进行的，如前所述，全宽，半高分辨率为2 mm(Marin-Valencia等人，2012年)

输液13C-标记营养素与脑和肿瘤的解剖

根据先前公布的方法，当小鼠开始出现神经症状（缺乏梳理、恶病质、癫痫发作、局部缺陷）时，在注射肿瘤细胞后8-10周开始进行示踪研究(Marin-Valencia等人，2012年). 将[1,6-13C] 葡萄糖（99%浓缩；马萨诸塞州安多佛市剑桥同位素实验室）和六个（每个肿瘤细胞系两个）注入[U-13C] 葡萄糖（99%富集；马萨诸塞州安多弗市剑桥同位素实验室）如下：在约1分钟内注入0.4mg/g体重（0.3 mL）的一团，然后以150μL/hr的速度持续注入0.012 mg/g/min，持续150分钟。该方案产生了65±15%（平均值±S.D.）的最终血糖富集。三只小鼠（每个肿瘤细胞系一只）注射[U-13C] 谷氨酰胺（97–99%富集度；马萨诸塞州安多弗市剑桥同位素实验室），以0.28毫克/克体重（0.3毫升）的剂量在约1分钟内给药，然后连续输注0.005毫克/克180分钟。该方案产生的最终血浆谷氨酰胺富集度为51±13%（平均值±标准偏差）。输液结束时，在断头前从眼眶中采集100–150μL血液，并使用该血浆确定相关营养池的富集情况。斩首后，迅速解剖肿瘤和周围脑组织，称重，冷冻在液氮中，并储存在−85°C。肿瘤重235±130 mg，周围脑组织重406±103 mg（平均值±SE）。

代谢物提取

如前所述，将肿瘤及其周围的大脑在液氮下的研钵中精细研磨，并准备进行核磁共振分析(Marin-Valencia等人，2012年;Maher等人，2012年).

13核磁共振波谱

质子解耦13C光谱是在400 MHz（瓦里安）或600 MHz（牛津）系统上获得的。对于400 MHz系统，使用了带有5 mm自动切换宽带探头的VNMRS直接驱动控制台（加州帕洛阿尔托瓦里安仪器公司）。使用Waltz-16序列在2.3 kHz下进行质子去耦。13C NMR参数包括每次瞬态45度翻转角、1.5秒的弛豫延迟、1.5秒采集时间和24.5 kHz的谱宽。样品以20 Hz的频率旋转，温度调节为25°C。A2采用H型场频锁。对于600 MHz系统，使用了Varian VNMRS直接驱动控制台，该控制台使用3 mm宽带探头（加利福尼亚州帕洛阿尔托的Varian Instruments）。使用Waltz-16序列在2.3 kHz下进行质子去耦。13C NMR光谱参数包括每次瞬态45°翻转角、1.5 s的弛豫延迟、1.5 s的采集时间和36.7 kHz的光谱宽度。样品在20 Hz和25°C下旋转。异核细胞2H锁用于补偿数据采集过程中的磁体漂移。为了在13C核磁共振谱图显示，获得的扫描次数通常为15000次。使用ACD/Spec Manager 11.0软件（Advanced Chemistry Development，Inc.，Toronto ON，Canada）进行核磁共振波谱分析。在傅里叶变换之前，用指数加权函数对自由感应衰减进行零填充和加窗。根据34.2 ppm时谷氨酸C4单线态的化学位移位置分配共振。每个信号都用高斯-洛伦兹函数拟合，每个拟合共振峰的面积测量值和多峰面积的估计值如前所述(Malloy等人，1987年;Malloy等人，1990年).

测量13血液中的C部分富集

血液样本经过处理后进行测量13如前所述，通过气相色谱-质谱法（GC-MS）在葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸中富集C(Marin-Valencia等人，2012年). 通过将未富集葡萄糖与[1,6混合，为每种代谢物制备三点标准曲线-13C类2]葡萄糖或[U-13C类6]葡萄糖；含[U的未富集谷氨酰胺-13C类5]谷氨酰胺；和未富集的乳酸[13C类三]乳酸，使每种代谢物的0、50或100%13标有C。使用安捷伦6890N气相色谱仪和安捷伦5973质量选择性检测器（安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）进行GC-MS。每种标准品或样品注入一微升，并在扫描模式下进行分析。的碎片离子米/z[1,6的204（未富集）和205（富集）-13C类2]-葡萄糖；[U为435（未富集）和441（富集）-13C类6]-葡萄糖；[U为258（未富集）和263（富集）-13C类5]对每个标准样品和实验样品进行谷氨酰胺定量。使用线性回归计算每个血浆样品的富集度。

蛋白质印迹

50μg全肿瘤组织提取物用于Western blot分析。根据制造商的方案使用初级抗体。分别以1:2000和1:5000的稀释度使用辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠和驴抗兔或抗涂层二级抗体（Cell Signaling，Danvers，MA）。该信号是用超级信号West Pico化学发光基板（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）开发的。

免疫组织化学

石蜡包埋的GBM标本来自UT西南医学中心的神经病理科。GBM组织和含HOT的小鼠大脑用10%福尔马林固定，石蜡包埋。切片的厚度为4μm，并脱蜡。切片在3%H中培养2O（运行）2阻断内源性过氧化物酶10分钟。主要抗体及其稀释液如下：神经丝（1:2000；2F11；M0762；Dako，Carpindia，CA），GAD67（Millipore，Billerica，MA），pAKT，pERK，EGFR，（Cell Signaling，Danvers，MA）。所有免疫染色均在Benchmark XT染色器中进行，使用CC1预处理溶液（95°C，32分钟）和XT-UltraView Universal DAB检测系统（Ventana Medical Systems，Tucson，AZ）。切片用苏木精复染。

GS酶测定

50 mg组织（肿瘤或脑）在0.5 mL均质溶液（0.25 M蔗糖、0.2 mM EDTA、2 mM 2-巯基乙醇）中用电子聚四氟乙烯均质。所得匀浆在20000g，4°C下离心15分钟。上清液的蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定法（伊利诺伊州罗克福德热电科学公司）测定。GS活性通过修改已发布的方法进行测量(麦克德莫特和巴特勒，1993年). 简单地说，含有25–100μg蛋白质的提取物与2.5 mM L-[U孵育-14C] 谷氨酸（0.68 Ci/mol）、7.5 mM ATP、30 mM MgCl2，25 mM NH4Cl和50 mM咪唑/HCl缓冲液（pH 7.5），体积为250μl。通过在与每种提取物的反应中加入GS抑制剂（蛋氨酸硫肟）来确定背景。在37°C下1小时后，通过添加1 mL冰镇20 mM咪唑/HCl缓冲液（pH 7.5）终止反应。将一mL该样品施加于1 mL床体积的AG 1-X8阴离子交换树脂柱（200–400目，8%交联，氯化物形式；Bio-Rad，Hercules，CA），该柱之前已与4 mL 20 mM咪唑/HCl（pH 7.5）平衡。14用3mL相同的缓冲液洗脱C-谷氨酰胺，并通过闪烁计数进行定量。

细胞培养代谢和质量同位素分析

将来自M-3肿瘤的细胞进行酶解分离，并在补充有2%（v/v）B27无血清补充剂、1%（v/v）胰岛素-转铁蛋白补充剂，20ng/mL表皮生长因子，10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，20ng/mL孕酮，4ug/mL强力霉素hyclate的DMEM/F12培养基中培养，0.1%真菌酮和1%青霉素-链霉素。细胞最初在~1×10时被电镀6细胞/皿置于10mL培养基中，并作为神经球生长。当培养达到~5×10时6细胞/培养皿，在1000℃离心收集球体克在4°C下保持5分钟。通过将颗粒在0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA和0.5 mL 0.2%（w/v）胶原酶中培养10分钟，生成单细胞悬浮液。通过添加0.5 mL胰蛋白酶抑制剂（4mg/mL）终止该反应。然后用10 mL PBS清洗细胞一次并重新镀膜。对于13C代谢实验，1×106细胞接种在带有4mL生长培养基的6cm培养皿中。2天后，通过离心法收集球体，在PBS中冲洗一次，然后重新悬浮在2mL含有10mM[U的培养基中-13C] 葡萄糖24小时。通过在0.5 mL冷（−20°C）50%甲醇中裂解细胞，并进行三次或三次以上的冻融循环，然后离心以去除碎片来提取代谢物。使用GC/MS分析柠檬酸、天冬氨酸、苹果酸和谷氨酸的富集情况。样品在100μL三甲硅基供体（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）中蒸发并衍生，然后将3μL注入安捷伦6890N GC，并与安捷伦5973质量选择性检测器耦合。使用纯标准品验证每种代谢物的保留率。对感兴趣的碎片离子进行监测和量化，并按照前面所述进行质量同位素分布分析(Cheng等人，2011年;Fernandez等人，1996年). 为了分析细胞内谷氨酰胺，我们使用了不同的方法，因为GC/MS方法将谷氨酰胺和其他细胞内代谢物转化为L-吡咯烷酮-5-羧酸盐，因此很难测定13结论是谷氨酰胺中的C富集。将提取物蒸发并重新悬浮在pH值为5.0的10 mM三丁胺/15 mM乙酸中，然后通过0.2μ自旋柱过滤，并注入岛津Prominence LC20/SIL-20AC高效液相色谱仪，该高效液相色谱仪与AB SCIEX 3200 QTRAP三重四极质谱仪耦合。使用乙酸三丁酯铵/甲醇梯度在C18基柱上用色谱法分离代谢物，柱上带有极性嵌入基团（Synergi Fusion，150 x 2.0 mm 4μ，Phenomenex，Torrance，CA），并根据已发表的方法进行MS/MS分析(Luo等人，2007年;Tu等人，2007年). 使用以下方法，流速为0.5 mL/min：缓冲液A：10 mM三丁胺，用15 mM乙酸调节至pH 5.0，缓冲液B：100%甲醇。T=0分钟，0%B；T=2分钟，0%B；T=13分钟，100%B；T=15分钟，100%B；T=16分钟，0%乙，T=20分钟，0%丙；T=20.1分钟，停止。通过定量优化确定谷氨酰胺在负模式下的两个最佳MRM转变分别为145/127和145/109。注射谷氨酰胺标准品以确认MRM转换和洗脱时间。来自生长在13谷氨酰胺的127和109MS/MS子片段各自含有全部5个碳。因此，用于量化的MRM转换13谷氨酰胺的C标记形式为（M+1）：146/128，146/110；（M+2）:147/129，147/111；（M+3）:148/130、148/112；（M+4）:149/131、149/113；（M+5）:150/132、150/114。使用Analyst 1.4软件根据总离子计数对峰值进行量化和标准化。

统计分析

用于NMR和IHC实验(图4D、4G,S3E和S3F)，误差条对应于S.E.M.。在所有其他实验中，误差条相当于S.D.。对于涉及S.D.的数据集，使用Student的t检验（双尾，等方差）确定统计显著性。其他数据集使用了Wilcoxon符号秩检验(图4D)或使用Dunnett的事后检验进行单向方差分析(图4G).

​

研究亮点

  • 向患有胶质瘤的小鼠注射13研究肿瘤代谢体内.
  • 肿瘤代谢复杂，与周围的大脑不同。
  • 肿瘤代谢与已建立的胶质瘤细胞系有很大不同。
  • 这种通用的方法将简单地应用于许多癌症小鼠模型。

补充材料

01

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致谢

Changho Choi、Mark Jeffrey以及DeBerardinis和Bachoo实验室的成员对数据进行了批判性评估。Carolina Cardona纯化了谷氨酰胺酶抗体。Osamu Togao、Koji Sagiyama和Masaya Takahashi进行了MRI扫描，Xiankai Sun进行了PET扫描。作者得到了NIH拨款RR02584和RC1NS0760675的支持。此外，IMV还得到了马德里卡亚基金会和比林斯利基金会的支持。RJD得到了NIH（DK072565，CA157996）、CPRIT（HIRP100437和RP101243）、Robert A.Welch基金会（I-1733）和Damon Runyon癌症研究基金会的资助。JMM得到了西班牙国家科技部（SAF2010-17573）和安达卢西亚军政府（CVI-6656）的资助。

脚注

补充信息

补充信息包含对13C NMR方法和五幅图。

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

工具书类

  • Cheng T，Sudderth J，Yang C，Mullen AR，Jin ES，Mates JM，DeBerardinis RJ。丙酮酸羧化酶是谷氨酰胺诱导肿瘤细胞依赖性生长所必需的。美国国家科学院院刊。2011;108:8674–8679. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Choi C、Ganji SK、DeBerardinis RJ、Dimitrov IE、Pascual JM、Bachoo R、Mickey BE、Malloy CR、Maher EA。3T下1H-MRS在活体人脑中测量甘氨酸：在脑肿瘤中的应用。Magn Reson Med.公司。2011;66:609–618. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Choi C、Ganji SK、Deberardinis RJ、Hatanpaa KJ、Rakheja D、Kovacs Z、Yang XL、Mashimo T、Raisanen JM、Marin Valencia I等。通过磁共振波谱检测脑胶质瘤IDH突变患者的2-羟基戊二酸。自然医学。2012;18:624–629. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • DeBerardinis RJ、Lum JJ、Hatzivassiliou G、Thompson CB。癌症生物学：代谢重组刺激细胞生长和增殖。单元格元数据。2008年a；7:11–20.[公共医学][谷歌学者]
  • DeBerardinis RJ、Mancuso A、Daikhin E、Nissim I、Yudkoff M、Wehrli S、Thompson CB。除了有氧糖酵解：转化细胞可以参与谷氨酰胺代谢，超过蛋白质和核苷酸合成的需要。美国国家科学院院刊。2007;104:19345–19350. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Debrardinis RJ、Sayed N、Ditsworth D、Thompson CB。一砖一瓦：新陈代谢和肿瘤细胞生长。当前操作基因开发。2008年b；18:54–61. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Elstrom RL、Bauer DE、Buzzai M、Karnauskas R、Harris MH、Plas DR、Zhuang H、Cinalli RM、Alavi A、Rudin CM等。Akt刺激癌细胞中的有氧糖酵解。癌症研究。2004;64:3892–3899.[公共医学][谷歌学者]
  • Fan TW，Lane AN，Higashi RM，Farag MA，Gao H，Bousamra M，Miller DM。通过（13）C稳定同位素再溶代谢组学（SIRM）识别人类肺癌代谢途径的调节改变摩尔癌症。2009;8:41. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fan TW，Lane AN，Higashi RM，Yan J.SCID小鼠模型中肺癌的稳定同位素分解代谢组学。代谢组学。2011;7:257–269. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fernandez CA、Des Rosiers C、Previs SF、David F、Brunengraber H。天然稳定同位素丰度的13C质量同位素分布校正。质谱学杂志。1996;31:255–262.[公共医学][谷歌学者]
  • 福布斯NS、梅多斯AL、克拉克DS、布兰奇HW。雌二醇刺激乳腺癌细胞的生物合成途径：通过代谢通量分析检测。代谢工程。2006;8:639–652.[公共医学][谷歌学者]
  • Gao P、Tchernyshyov I、Chang TC、Lee YS、Kita K、Ochi T、Zeller KI、De Marzo AM、Van Eyk JE、Mendell JT等。miR-23a/b的c-Myc抑制增强线粒体谷氨酰胺酶表达和谷氨酰胺代谢。自然。2009;458:762–765. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hanahan D，Weinberg RA。癌症的标志：下一代。单元格。2011;144:646–674.[公共医学][谷歌学者]
  • Koppenol WH，Bounds PL，Dang CV。Otto Warburg对当前癌症代谢概念的贡献。Nat Rev癌症。2011;11:325–337.[公共医学][谷歌学者]
  • Kurhanewicz J、Vigneron DB、Brindle K、Chekmenev EY、Comment A、Cunningham CH、Debrardinis RJ、Green GG、Leach MO、Rajan SS等。通过成像超极化细胞核分析癌症代谢：转化为临床研究的前景。肿瘤。2011;13:81–97. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Landau BR、Wahren J、Chandramouli V、Schumann WC、Ekberg K、Kalhan SC。糖异生对禁食状态下葡萄糖生成的贡献。临床投资杂志。1996;98:378–385. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee J、Kotliarova S、Kotlianov Y、Li A、Su Q、Donin NM、Pastorino S、Purow BW、Christopher N、Zhang W等。与血清培养细胞系相比，在bFGF和EGF中培养的胶质母细胞瘤衍生的肿瘤干细胞更能反映原发性肿瘤的表型和基因型。癌细胞。2006;9:391–403.[公共医学][谷歌学者]
  • Liu AX、Testa JR、Hamilton TC、Jove R、Nicosia SV、Cheng JQ。AKT2是蛋白激酶B家族的成员，在人类卵巢上皮癌细胞中被生长因子v-Ha-ras和v-src通过磷脂酰肌醇3-激酶激活。癌症研究。1998;58:2973–2977.[公共医学][谷歌学者]
  • Luo B，Groenke K，Takors R，Wandrey C，Oldiges M。液相色谱-质谱法同时测定糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环中的多种细胞内代谢物。J色谱仪A。2007;1147:153–164.[公共医学][谷歌学者]
  • Maher EA、Marin-Valencia I、Bachoo RM、Mashimo T、Raisanen J、Hatanpaa K、Jindal A、Jeffrey FM、Choi C、Madden C等。[U-13C]葡萄糖在活体人脑肿瘤中的代谢。核磁共振生物识别。2012年doi:10.1002/nbm.2794。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Malloy CR，Sherry AD，Jeffrey FM。通过13C NMR光谱法测定灌注心脏中通过柠檬酸循环途径的碳通量。FEBS信函。1987;212:58–62.[公共医学][谷歌学者]
  • Malloy CR，Thompson JR，Jeffrey FM，Sherry AD。外源底物对乙酰辅酶A的贡献：在非稳态条件下通过13C NMR进行测量。生物化学。1990;29:6756–6761.[公共医学][谷歌学者]
  • Marian CO、Cho SK、McEllin BM、Maher EA、Hatanpaa KJ、Madden CJ、Mickey BE、Wright WE、Shay JW、Bachoo RM。端粒酶拮抗剂imetelstat有效靶向胶质母细胞瘤肿瘤起始细胞，导致增殖和肿瘤生长下降。临床癌症研究。2010;16:154–163. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Marin-Valencia I、Cho SK、Rakheja D、Hatanpaa KJ、Kapur P、Mashimo T、Jindal A、Vemiredid V、Good LB、Raisanen J等。人类脑肿瘤原位小鼠模型中通过戊糖磷酸途径、糖酵解和Krebs循环的葡萄糖代谢。核磁共振生物识别。2012年doi:10.1002/nbm.2787。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • McDermott RH，Butler M.摄取谷氨酸，而非谷氨酰胺合成酶，调节哺乳动物细胞对无谷氨酰胺培养基的适应。细胞科学杂志。1993;104（第1部分）：51–58。[公共医学][谷歌学者]
  • Mehrian Shai R、Reichardt JK、Ya-Hsuan H、Kremen TJ、Liau LM、Cloughesy TF、Mischel PS、Nelson SF。胶质瘤样本和衍生细胞系中基因表达谱的稳健性。大脑研究摩尔大脑研究。2005;136:99–103.[公共医学][谷歌学者]
  • Michelakis ED、Sutendra G、Dromparis P、Webster L、Haromy A、Niven E、Maguire C、Gammer TL、Mackey JR、Fulton D等。二氯乙酸对胶质母细胞瘤的代谢调节。科学与运输医学。2010;2：31ra34。[公共医学][谷歌学者]
  • 迈尔斯议员、帕斯I、巴蒂IH、范德凯J、斯托拉罗夫JP、海明斯BA、威格勒MH、唐斯CP、唐克斯NK。PTEN的脂质磷酸酶活性对其抑瘤功能至关重要。美国国家科学院院刊。1998;95:13513–13518. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nieman KM、Kenny HA、Penicka CV、Ladanii A、Buell-Gutbrod R、Zillhardt MR、Romero IL、Carey MS、Mills GB、Hotamisligil GS等。脂肪细胞促进卵巢癌转移，为肿瘤快速生长提供能量。自然医学。2011;17:1498–1503. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nurjhan N、Bucci A、Perriello G、Stumvoll M、Dailey G、Bier DM、Toft I、Jenssen TG、Gerich JE。谷氨酰胺：一种主要的糖异生前体和人体有机碳转运载体。临床投资杂志。1995;95:272–277. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Owen OE、Kalhan SC、Hanson RW。补充和缓解对柠檬酸循环功能的关键作用。生物化学杂志。2002;277:30409–30412.[公共医学][谷歌学者]
  • Portais JC、Voisin P、Merle M、Canioni P.通过碳13核磁共振研究C6胶质瘤细胞中的葡萄糖和谷氨酰胺代谢。生物化学。1996;78:155–164.[公共医学][谷歌学者]
  • Qu W，Zha Z，Ploessl K，Lieberman BP，Zhu L，Wise DR，Thompson CB，Kung HF.光学纯4-氟谷氨酰胺作为潜在肿瘤代谢显像剂的合成。美国化学学会杂志。2011;133:1122–1133.[公共医学][谷歌学者]
  • Ramanathan A，Wang C，Schreiber SL.利用代谢测量对肿瘤发生的细胞系模型进行扰动分析。美国国家科学院院刊。2005;102:5992–5997. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sherry AD、Malloy CR。13谷氨酸的C同位素分析：一种探测TCA循环中交叉代谢途径的核磁共振方法。收件人：Berliner LJ，Robitaille P-ML，编辑。体内碳-13核磁共振。美国纽约：Kluwer Academic/Plenum Publishers；2002年，第59-97页。[谷歌学者]
  • Singh SK、Hawkins C、Clarke ID、Squire JA、Bayani J、Hide T、Henkelman RM、Cusimano MD、Dirks PB。人脑肿瘤起始细胞的鉴定。自然。2004;432:396–401.[公共医学][谷歌学者]
  • Tennant DA、Duran RV、Gottlieb E.针对癌症治疗的代谢转化。Nat Rev癌症。2010;10:267–277.[公共医学][谷歌学者]
  • Tu BP、Mohler RE、Liu JC、Dombek KM、Young ET、Synovec RE、McKnight SL。酵母细胞生命周期中代谢状态的周期性变化。美国国家科学院院刊。2007;104:16886–16891. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wise DR、DeBerardinis RJ、Mancuso A、Sayed N、Zhang XY、Pfeiffer HK、Nissim I、Daikhin E、Yudkoff M、McMahon SB等。Myc调节刺激线粒体谷氨酰胺分解并导致谷氨酰胺成瘾的转录程序。美国国家科学院院刊。2008;105:18782–18787. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yueva M、Zamboni N、Oefner P、Sachidanandam R、Lazebnik Y。谷氨酰胺而非葡萄糖缺乏会诱导人类细胞中MYC依赖性凋亡。细胞生物学杂志。2007;178:93–105. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhang W，Trachootham D，Liu J，Chen G，Pelicano H，Garcia-Prieto C，Lu W，Burger JA，Croce CM，Plunkett W等。胱氨酸代谢的基质控制促进慢性淋巴细胞白血病中癌细胞的存活。自然细胞生物学。2012;14:276–286. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]