PI（3,5）P₂通过直接激活粘蛋白Ca控制膜交通²⁺内溶酶体中的释放通道

PI（3,5）P₂-TRPML1的介导激活门控

探讨PI（3,5）P的潜在机制₂-依赖性激活TRPML，我们测试了PI（3,5）P的作用₂关于TRPML1通道的几种增益功能突变²⁰最近，我们和其他人发现了一种自发的突变(Varitint Waddler公司;弗吉尼亚州)在5中^第个TRPML3跨膜结构域显著增加了TRPML2通道活性（参考文献。^5–6). 进一步的分析表明弗吉尼亚州是一个选通突变，将TRPML1-3通道锁定在开放非选通状态^5–6。与我_TRPML1公司，全基因组我_TRPML1-Va型表现出较大的基础电流（1190±254 pA/pF，−140 mV，N=5），但没有随着PI（3,5）P的增加而增加₂应用（基础的0.99±0.01，N=3；图1i、1k、1l). TRPML1-R427P是一种部分获得功能突变²⁰.全内溶酶体我_{TRPML1-R427P型}在−140 mV，N=3时，显示出大量的基础电流（349±80 pA/pF），但仅被PI（3,5）P轻度激活₂，基础活性为3.7±1.3倍（N=7）(图1j–l). 总之，这些结果表明PI（3,5）P₂通过增加打开概率激活TRPML1。

PI（3,5）P激活内源性TRPML样电流₂

接下来，我们研究了PI（3,5）P₂激活内源性TRPML。使用从非转染Cos-1细胞中分离的放大LEL，我们能够记录PI（3,5）P₂–激活的内部整流类TRPML电流(我_{TRPML-L公司})20个液泡中的4个(图2a).我_{TRPML-L公司}在−140 mV时为68±4 pA/pF（N=4）。在从野生型（TRPML1）分离的放大LEL中^+/+)然而，PI（3,5）P₂–已激活我_{TRPML-L公司}在5个测试液泡中的5个中检测到(图2b)平均电流振幅大于Cos-1电池（在−140 mV时为239±37 pA/pF，N=5；图2d). 相反，人类ML4（TRPML1）的LEL增大^−/−或缩写为ML1^−/−)成纤维细胞未显示显著的PI（3,5）P₂–已激活我_{TRPML-L公司}（−140 mV时为15.7±5.2 pA/pF，N=6；图2c、2d). 这些结果表明PI（3,5）P₂激活内源性TRPML，并且TRPML1是人类成纤维细胞内溶酶体中的主要或唯一功能性TRPML通道，尽管先前的研究报道了人类成纤维组织中TRPML2和TRPML3的表达²⁵.

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图2

PI（3,5）P₂激活内溶酶体膜中内源性TRPML样电流

一)内源性内向整流类TRPML电流(我_TRPML1-L型)由PI（3,5）P激活₂（10µM）在从未转染的Cos-1细胞分离的液泡中。b条)大PI（3,5）P₂-激活我_TRPML1-L型在从野生型（WT）人皮肤成纤维细胞分离的液泡中。c（c）)缺乏显著的PI（3,5）P₂-激活我_TRPML1-L型在从人类ML4（TRPML1）分离的液泡中^−/−)皮肤成纤维细胞。d日)内源性PI（3,5）P₂-激活我_{TRPML-L公司}WT和TRPML1中^−/−人成纤维细胞。统计分析：***，P（P）< 0.001; NS（无显著性），P（P）> 0.05).

抑制我_TRPML1公司PI（3,5）P下降₂

全内溶酶体我_TRPML1公司diC8 PI（3,5）P被冲刷后，表现出衰减或缓慢恢复到稳态水平₂(图3a). 如果PI（3,5）P₂基础前PI（3,5）P水平的基础₂或PI（3,5）P后₂TRPML1活性，降低PI（3,5）P₂预计水平会降低我_TRPML1型一种“螯合”PIP的方法是向膜的细胞质侧添加聚阳离子，如聚赖氨酸，在那里它们以静电方式结合PIP的带负电荷的磷酸头部基团^26–27500µg/ml的聚赖氨酸快速抑制PI（3,5）后P₂ 我_TRPML1公司，但不是我_TRPML1-Va型(图3a-c)表明聚赖氨酸主要影响TRPML1（激活）门控。作为支持，一个中和反PI（3,5）P₂5µg/ml抗体显著抑制PI（3,5）后P₂ 我_TRPML1型，但不是我_TRPML1-Va型(图3d–f). 相反，抗PI（4,5）P未发现明显抑制作用₂抗体(图3d，3e). 为了进一步研究基底我_TRPML1公司PI（3,5）P之前₂治疗是由PI（3,5）P的基础水平引起的₂在溶酶体膜中，我们研究了在−140 mV时基础电流大于100 pA的一组液泡。聚赖氨酸（92±1%，N=7）或抗磷脂酰肌醇（3,5）P均表现出强烈的抑制作用₂抗体（94±1%，N=10），但不含抗PI（4,5）P₂抗体（3±1%，N=4；图3g–i).

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图3

PI（3,5）P下降₂通过螯合剂抑制内溶酶体膜中TRPML1通道的活性

a）后PI（3,5）P₂准静态我_TRPML1公司通过向表达TRPML1-EGFP的Cos-1细胞中放大的内溶小体（内/细胞质）涂敷聚赖氨酸（500µg/ml）抑制。我_TRPML1公司增加100 nM PI（3,5）P₂，但在冲刷后逐渐降低到准静态水平。b）代表性痕迹我_TRPML1公司在三个时间点，如所示一：根据PI（3,5）P₂施用（红色）、冲洗（黑色）和聚赖氨酸施用（品红色）。c（c）)对整个溶酶体缺乏聚赖氨酸（500µg/ml）影响我_TRPML1-Va型.d）后PI（3,5）P₂准稳态我_TRPML1公司被镀液中和抗PI（3,5）P抑制₂（5µg/ml），但不含抗PI（4,5）P₂（5微克/毫升）。e）代表性痕迹我_TRPML1公司在三个时间点，如所示d。 f）缺乏抗PI（3,5）P₂（5µg/ml）对全基因组的影响我_TRPML1-Va型.g、 h）大基底前-PI（3,5）P₂ 我_TRPML1公司被镀液中和抗PI（3,5）P抑制₂（5µg/ml），但不含抗PI（4,5）P₂.i） 我_TRPML1公司通过浴（内质/细胞质）应用聚赖氨酸（500µg/ml）或PI（3,5）P抑制90%以上₂抗体。

进一步确认PI（3,5）P₂是TRPML1的内源性激活物，我们还记录到我_TRPML1公司消耗PI（3,5）P后₂MTM1是一种PI-3磷酸酶，可以转化PI（3,5）P₂和PI（3）P分别转换为PI（5）P和PI^11,15使用雷帕霉素依赖性异二聚体系统招募其他细胞溶质MTM1²⁸（参见图4a、4b). 在同时表达RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7的细胞中，雷帕霉素诱导MTM1快速募集到Rab7-阳性LEL膜(图4b). 我们注意到我_TRPML1公司从Cos-1细胞中分离出的液泡在液泡蛋白-1预处理时间较长（>5h）时，液泡始终较大（数据未显示）。在从MTM1转染细胞分离的液泡中我_TRPML1公司雷帕霉素治疗前出现(图4c). MTM1招聘后(图4d)，但不是非活性突变体（C375S）MTM1(图4e)然而，基底的全基因组受到很大的抑制我_TRPML1型被看到了(图4d–f). 总之，这些结果表明PI（3,5）P₂水平是内溶酶体中TRPML1通道活性的主要决定因素。

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图4

PI（3,5）P下降₂易位脂类磷酸酶水平抑制内溶酶体膜TRPML1通道活性

a）通过RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7的雷帕霉素依赖性异二聚将MTM1募集到内溶酶体膜。Rab7是一种LEL特异性Rab蛋白。MTM1是一种PI-3磷酸酶，可以转化PI（3,5）P₂和PI（3）P分别转化为PI（5）P和PI。b）RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7依赖于雷帕霉素的异二聚体改变了MTM1的亚细胞定位。用RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7转染Cos-1细胞。雷帕霉素（500 nM；20分钟）治疗促进MTM1-RFP与Rab7-EGFP的共定位。比例尺=10µm。c-f）MTM1对我_TRPML1公司Cos-1细胞与人TRPML1-myc、RFP-FRB-MTM1或RFP-FRB-MTM1-C375S和EGFP-2*FKBP-Rab7共转染。通过RFP-FRB-MTM1和EGFP-2*FKBP-Rab7依赖于雷帕霉素（500 nM）的异二聚作用将MTM1招募到LEL膜。c） 我_TRPML1公司雷帕霉素治疗前，在MTM1转染细胞中。d） 我_TRPML1公司雷帕霉素处理后的MTM1转染细胞。e） 我_TRPML1公司雷帕霉素处理后的MTM1-C357S转染细胞。f）WT和非活性突变体（C375S）MTM1对基础全基因组的差异效应我_TRPML1公司统计分析：*，0.01<P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01).

PI（3,5）P的绑定₂至TRPML1的N端在体外

已知磷脂以静电方式与PI-结合模块（如PH或FYVE结构域）或带有带正电荷氨基酸残基（如Arg和Lys）的非结构簇的多碱区域具有高亲和力²⁷π（4,5）P₂可以直接结合到几种质膜TRP的细胞质N端和C端^26,29值得注意的是，TRPML1的细胞内N末端具有多碱区²⁶（参见图5a). 测试PI（3,5）P₂直接与TRPML1结合，我们将GST融合到小鼠TRPML1的整个N末端，直到残基69（参见图5a假定膜拓扑）。蛋白质GST-TRPML1-N（缩写为GST-ML1-N）用于探测固定在硝化纤维素膜上的磷脂酰肌醇^26–27,29.GST-ML1-N，但不限于GST，受PIP约束_三和PIP₂s、 但不适用于其他PIP或磷脂(图5b). 脂质体实验表明，GST-ML1-N与PI（3,5）P强烈相关₂，但不包括PI（3）P或对照脂质体(图5c). 在下拉试验中，琼脂糖珠与PI（3,5）P结合₂，但不控制血脂，降低GST-ML1-N(图5d). 综上所述，这些结果表明PI（3,5）P₂直接绑定在体外到TRPML1的细胞质N末端。

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图5

PI（3,5）P的直接结合₂TRPML1 N末端需要多个带正电荷的氨基酸残基

a）TRPML1的细胞质N末端包含一个多碱区域和作为潜在PI（3,5）P的带正电氨基酸残基簇₂结合位点。本研究中突变为中性氨基酸Gln（Q）的带正电氨基酸残基（Arg和Lys）显示为放大的圆圈及其氨基酸残基数。b）类蛋白质覆盖物。该条含有15种不同类型的油脂：PA、磷脂酸；S1P，1-磷酸鞘氨醇。三种纯化蛋白用于探针条带：GST单独（左面板）、GST融合到TRPML1的N末端片段（ML1-N-GST；右面板）和ML1-N-GST的Gln-取代突变体（ML1-7Q-N-GST；中间）。用抗GST抗体检测蛋白质。c）脂质体下拉试验。脂质体与纯化的GST融合蛋白孵育，离心，并用GST抗体通过Western blot观察相关蛋白。d）GST-ML1-N与与PI（3,5）P偶联的琼脂糖微球的结合₂，但不控制血脂；仅GST未能降低PI（3,5）P₂-共轭珠子。e）与GST-ML1-N相比，GST-ML1-7Q-N与PI（3,5）P的结合明显较弱₂-共轭琼脂糖珠。f）全内溶酶体我_{TRPML1-7个季度}被高浓度的PI（3,5）P弱激活₂.g）PI（3,5）P₂剂量依赖性我_{TRPML1-7个季度}.虚线表示我_TRPML1公司（报告自图1d).h）大的基底全基因组我_{TRPML1-Va-7Q型}.在增益函数中引入电荷迁移Gln替代（7Q）弗吉尼亚州背景。i）GST-ML1-N肽（5µg/ml）降低PI（3,5）P₂-整个内溶酶体的依赖性激活我_{TRPML1公司·}.j）荷移Gln-取代取代（7Q）消除了GST-ML1-N肽的抑制作用。

PI（3,5）P中的关键氨基酸残基₂结合

进一步绘制PI（3,5）P₂结合位点，我们系统地用非带电的Gln残基替换多碱区域内和附近带正电荷的氨基酸残基（Arg和Lys），并分析Gln取代的纯化GST融合蛋白用于PI（3,5）P₂结合。我们还测试了PI（3,5）P₂使用全基因组记录激活Gln-取代TRPML1通道。PI（3,5）P下降幅度最大₂绑定和激活(图5e–g)在一个7Q突变体中观察到，有7个替换（R42Q/R43Q/R44Q/K55Q/R57Q/R61Q/K62Q；图5a). 与GST-ML1-N相比，GST-ML1-7Q-N未能与PI（3,5）P显著结合₂或PIP条带中的其他PIP和下拉分析(图5b、5e). 考虑PI（3,5）P的特异性₂对于TRPML1激活，我们的生化分析之间明显差异的一个合理解释（参见图5b)和电生理测量（参见图1f)即纯化的GST-ML1-N蛋白片段没有重现内溶酶膜中全长TRPML1的PIP结合的特异性。然而，ML1-N与PI（3,5）P的结合亲和力₂通过去除7Q突变的电荷而显著降低(图5e)表明多个带正电荷的氨基酸残基对PI（3,5）P至关重要₂结合。

与野生型（WT）TRPML1相比，高浓度PI（3,5）P对TRPML1-7Q的激活较弱₂，最大反应（疗效）约为20%我_TRPML1公司（欧共体₅₀=2.2±2µM，山坡（n）=0.8，n=6个液泡）(图5f，5g). 类似TRPML1^{弗吉尼亚州}、TRPML1^{弗吉尼亚州}−7Q也表现出较大的基础电流(图5h)表明7Q突变对PI（3,5）P的相对特异性影响₂-依赖激活。与PI（3,5）P一致₂结合分析结果，我们发现GST-ML1-N，而不是GST-ML1-7Q-N，竞争性地降低了PI（3,5）P的激活作用₂(图5i、5j). 总之，我们的结果表明PI（3,5）P₂直接与TRPML1的细胞质N末端结合，导致构象变化，有利于TRPML1.的开放。

π（3,5）P₂空泡钙²⁺酵母释放

TRPML1是Ca²⁺-透水渠道^30–31，因此通过PI（3,5）P激活₂可能导致钙²⁺内溶酶体释放。虽然PIKfyve/Fab1是一种负责PI（3,5）P的PI5激酶₂酵母细胞和哺乳动物细胞的生成^11,13–15，导致哺乳动物细胞中PIKfyve激活的细胞外信号尚未确定。此外，内溶酶体钙²⁺由于内溶酶体较小，很难在哺乳动物细胞中检测到释放^5,32相反，Fab1介导的PI（3,5）P₂酵母中的生产已被充分记录^11,13例如，高渗性休克增加PI（3,5）P₂几分钟内水平增加20倍以上^11,13有趣的是，高渗性休克也可诱导钙²⁺从与哺乳动物溶酶体有许多相似特征的酵母液泡中释放。钙的诱导²⁺释放是通过Yvc1/TRPY1（酵母中的一种TRP通道同源物）进行的，释放速度稍快，但在其他方面PI（3,5）P的时间进程相当₂高程³³根据我们的数据，我们假设高渗压诱导空泡钙²⁺释放取决于升高的PI（3,5）P₂水平。为了测试这一点，我们使用了一种基于绿原蛋白（一种遗传钙）的发光分析²⁺传感器，³³测量细胞内钙的变化²⁺（[钙²⁺]_{细胞色素氧化酶})级别。与以前的报告一致³³在培养基中添加0.9M NaCl引起的高渗休克导致[Ca]迅速急剧增加²⁺]_细胞周期峰值[Ca所需的时间²⁺]_细胞周期增加48±4秒（N=10个酵母菌落/实验）；发光强度比基础（N=4；图6a、6b). 在yvc1型Δ突变体，但[Ca没有显著增加²⁺]_细胞周期观察到（比基础高29±6%，N=4），与[Ca²⁺]_细胞周期增加主要是由于Yvc1的液泡释放³³。有趣的是，在工厂1Δ突变，高渗休克也未能诱导[Ca显著增加²⁺]_细胞周期（20±8%，N=4；图6a、6b)与野生型细胞的700%相比。两者都有yvc1型Δ和工厂1Δ细胞对14%乙醇或0.03%十二烷基硫酸钠（数据未显示）产生反应，已知这会诱导钙²⁺流入，流入³³与以往研究一致^11,13,工厂1Δ突变酵母在高渗休克反应中未能表现出空泡破裂(图6c).

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图6

钙²⁺高渗性休克后酵母液泡的释放依赖于PI（3,5）P₂生产

a）代表性Ca²⁺在野生型（wt）中用aequorin介导的发光测量响应，yvc1Δ和PI（3，5P）₂-缺陷菌株(真空度7Δ,真空14Δ,图4Δ,fab1Δ)添加0.9M NaCl引起的高渗休克。b）定量数据显示不同酵母菌株对高渗休克的发光反应。折叠反应在电击前被归一化为基础发光。c）高渗休克增加了野生型酵母的液泡数量，减少了液泡体积，但fab1突变酵母菌株没有。WT和工厂1用FM4-64染料标记Δ细胞，观察空泡体积和空泡叶数量。用0.45M NaCl处理细胞并用荧光显微镜观察。d、 e）YVC1在中的过度表达工厂1Δ细胞无法恢复高渗压诱导的钙²⁺响应。f、 g）的过度表达制造厂1在里面工厂1Δ细胞恢复高渗压诱导的钙²⁺响应。h、 i）在WT酵母细胞中过度表达TRPML1增加高渗诱导的钙²⁺响应。j）高渗性休克诱导钙空泡²⁺在中释放vma3型突变酵母菌株。k）TRPML1的过度表达，而不是孔突变TRPML1-KK（在pCu和pVT表达载体中）yvc1型Δ酵母细胞导致小而显著的高渗诱导钙²⁺响应。

Fab1激酶活性由Vac7、Vac14和Fig4调节，其突变导致Fab1介导的PI（3,5）P部分或几乎完全丢失₂生产^{11–13,15,34}所有这些突变体都表现出空泡钙减少²⁺释放：533±60%（N=4）图4Δ，357±77%（N=4）真空14Δ和106±18%（N=4）真空7Δ (图6a、6b). 钙的含量²⁺-释放减少(工厂1Δ >真空7Δ>真空14Δ>图4Δ）与PI（3,5）P缺陷的严重程度密切相关₂这些菌株的产量¹¹.钙的损失²⁺中的响应工厂1Δ细胞不是由于Yvc1表达减少所致(图6d、6e)，因为Yvc1-GFP的转换未能恢复响应。相反，当野生型酵母制造厂1被转化为工厂1Δ突变酵母，高渗诱导[Ca²⁺]_细胞周期增长基本恢复(图6f，6g). 突变体工厂1Δ据报道，酵母使液泡低酸^11,13，这可能导致钙减少²⁺因H减少而释放⁺-液泡钙的依赖性再灌注²⁺Vcx1介导的储存（液泡钙²⁺-H（H）⁺交换器）³⁵然而，vcx1型Δ细胞显示正常钙²⁺高渗性休克反应性释放³³表明交替的Pmc1（液泡Ca²⁺ATP酶介导的再灌注系统足以维持空泡钙²⁺商店。作为支持，我们发现低酸性细胞缺乏vma3型是液泡ATP酶的重要组成部分³⁵，表现正常[Ca²⁺]_细胞周期释放(图6h). 这些结果表明Fab1介导的PI（3,5）P₂高渗透压诱导的依赖于Yvc1的空泡钙需要生成系统²⁺释放。尽管TRPML1与Yvc1具有一定程度的序列同源性，但它们在通道特性上存在显著差异^5,36为了测试TRPML1在酵母中是否起作用，我们在野生型和yvc1型Δ背景。野生型酵母中TRPML1的过度表达导致Ca的显著增加²⁺高渗性休克反应性释放(图6i、6j). 在yvc1型Δ细胞，TRPML1的过度表达，而不是TRPML1-KK的非功能性孔突变体，导致[Ca²⁺]_细胞周期响应，比基础发光增加114±14%（N=9）(图6k). 相反，TRPML1在工厂1Δ未能产生显著的[Ca²⁺]_细胞周期响应(补充图S5)，而YVC1在yvc1型Δ细胞完全恢复[Ca²⁺]_细胞周期响应(补充图S6). 由于Yvc1（而非TRPML1）被细胞质钙激活，救援可能是不完整的²⁺和机械力³⁶两者可能与PI（3,5）P有协同作用₂然而，这些结果表明溶酶体钙的调节²⁺PI（3,5）P通道₂这可能是真核细胞中的一种保守机制。

内溶酶体电生理学

用改良的斑贴法在分离的内溶体中进行内溶体电生理学研究^20–21HEK293或Cos-1细胞用于所有异源表达实验，并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染TRPML1或融合到GFP或mCherry的突变体。来自ML4患者的人皮肤成纤维细胞（TRPML1^−/−，克隆GM02048）和年龄匹配对照（TRPML1^+/+，克隆GM00969）从科里尔医学研究所（美国新泽西州）获得。LEL尺寸通常小于0.5µm，这对于膜片钳来说是次优的。因此，我们用1µM液泡蛋白-1处理细胞约1小时，液泡蛋白-1是一种脂溶性多环三嗪，可以选择性地增加内涵体和溶酶体的大小⁴⁴在大多数真空处理细胞中观察到大液泡（高达5µm；电容=0.68±0.05 pF，N=44个液泡）。偶尔，未经空泡蛋白-1处理，从TRPML1转染的细胞中获得扩增的LEL。对于使用或不使用vaucolin-1处理获得的扩大LEL，TRPML通道特性没有显著差异。mCherry-TRPML1和EGFP-Lamp1的液泡阳性被视为LEL增大。对分离的放大LEL进行全内溶酶体记录。简言之，将贴片吸管（电极）压在细胞上，并迅速拔出以切片细胞膜。放大的LEL被释放到培养皿中，并通过监测EGFP-TRPML1、mCherry-TRPML1或EGFP-Lamp1荧光进行鉴定。除非另有说明，否则浴（内部/细胞质）溶液含有140 mM K葡萄糖酸盐、4 mM NaCl、1 mM EGTA、2 mM Na₂-ATP，2 mM氯化镁₂，0.39 mM氯化钙₂，0.1 mM GTP，10 mM HEPES（pH值用KOH调节至7.2；游离[Ca²⁺]_我约100 nM）。移液管（管腔）溶液为pH 4.6的标准细胞外溶液（改性Tyrode’s），含有145 mM NaCl、5 mM KCl和2 mM CaCl₂，1 mM氯化镁₂，20 mM HEPES，10 mM葡萄糖（用NaOH调节pH值）。通过快速灌注系统应用所有浴液，以在几秒钟内完成溶液交换。使用Axopatch 2A膜片钳放大器、Digidata 1440和pClamp 10.0软件（Axon Instruments）收集数据。全内溶酶体电流在10 kHz下数字化，在2 kHz下过滤。所有实验均在室温（21–23°C）下进行，所有记录均使用pCLAMP10（Axon Instruments，Union City，CA）和Origin 8.0（Origin Lab，Northampton，MA）进行分析。所有PIP抗体均来自Echelon Biosciences Inc.。所有PIP均来自A.G.Scientific，Inc。

GST融合蛋白

为了纯化GST标记的蛋白质，大肠杆菌用空pGEX载体或pGEX-TRPML1-N（缩写为pGEX-ML1-N）转化BL21DE3。生长到大约OD后₆₀₀=0.6，在添加氨苄西林的SuperBroth培养基中，用IPTG（1 mM）在37°C下诱导表达7 h。收集细胞并将其重新悬浮在30 ml冰镇PBS中，该PBS补充有蛋白酶抑制剂混合物、0.5 mM EDTA和脱氧核糖核酸酶，并用法国压榨机进行裂解。将1%Triton-X100中的细胞裂解物与2 mL混合谷胱甘肽Sepharose（GE Healthcare）在4°C下孵育1 h。用30 mL PBS进行三次洗涤后，用7 mL洗脱缓冲液（10 mM谷胱甘肽，50 mM Tris，pH 8）洗脱蛋白质。

脂条结合试验

使用PIP条带（Echelon Biosciences Inc.）对GST-ML1-N和GST-ML1-7Q-N融合蛋白进行脂质结合分析，每个点包含100 pmol活性脂质。在室温下用磷酸盐缓冲盐吐温（PBST）溶液（补充3%无脂肪酸牛血清白蛋白）封闭膜1 h，并在封闭缓冲液中与0.5–3µg GST融合蛋白孵育过夜。六次清洗后，在室温下将膜与小鼠抗GST抗体（1:5000，Sigma）孵育1小时，并在增强化学发光检测之前添加HRP标记的山羊抗小鼠二级抗体（1:500）。

PIP珠结合试验

将纯化的GST融合蛋白（10µg）在1mL结合缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，0.25%NP-40，pH 7.5）中稀释，并与50µl 50%脂质缀合的Sepharose珠（Echelon Biosciences Inc.）孵育2小时。三次洗涤后，通过在50°C下在2X SDS-PAGE样品缓冲液中加热10分钟，从PIP珠中洗脱蛋白质，并通过Western blot进行可视化。

脂质体结合试验

纯化的GST融合蛋白（3µg）与20µl脂质体（Echelon Biosciences Inc.）在1 mL结合缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，0.05%Nonide P-40，pH 7.5）中孵育10分钟。脂质体以16000×克持续10分钟，并用结合缓冲液洗涤多次。结合组分用Western blot分析。

酵母菌株

野生型和突变型酵母菌株列于表1菌株在24°C或30°C的YPD（酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖）或合成完整（SC）最小培养基中生长。

酵母钙²⁺成像

酵母钙²⁺成像实验是使用基于绿原蛋白的遗传钙进行的²⁺传感器法³³PEVP11/AEQ质粒由Patrick H.Masson博士（威斯康星大学麦迪逊分校，威斯康星州麦迪逊）提供。转化酵母从饱和过夜培养物接种到OD₆₀₀在含有3µM柯仑特拉嗪的合成定义（SD）介质中约0.3，并隔夜生长（OD₆₀₀=2–3）在24°C或30°C条件下，将载脂蛋白转换为绿原蛋白。对于每个实验，采集250µl的等分样品，重新悬浮在100µl SD介质中，并转移到94-well板上进行发光测量。使用PHERAstar平板阅读器（BMG实验室）每隔3 s记录一次基线发光，持续30 s。通过添加等体积的含有1.8 M NaCl的SD培养基（100µl）至0.9 M的最终浓度来进行高渗休克。所有实验均以14%乙醇或0.03%SDS结束，这会产生最大的发光，并作为艾quorin转化的阳性对照。

酵母液泡标记

对数期酵母细胞用FM4-64染料标记（分子探针）³⁴。相位对比度和荧光图像是使用带有100倍物镜的蔡司显微镜拍摄的。

小鼠成纤维细胞空泡试验

真空14^−/−如前所述分离和培养小鼠成纤维细胞¹²简而言之，通过电穿孔（260 V，950µF）将100µg以下表达结构瞬时转染成纤维细胞：mCit、mCit-Vac14、GFP-ML1、GFP-ML1-KK或GFP-ML1-7Q。细胞生长在100 mm的平板上，达到90%的汇合，并在电穿孔后分布到6个35 mm的平板。电穿孔24小时后用4%多聚甲醛固定细胞。如果成纤维细胞至少有一个增大（>3µm）的细胞质空泡，则认为成纤维细胞呈空泡状。

细胞分馏

进行溶酶体分馏研究⁴⁵，细胞裂解物在均质缓冲液（0.25 M蔗糖，1 mM钠₂EDTA，10 mM HEPES，pH 7.0）。然后在1900×克在4°C下持续10分钟以去除细胞核和完整的细胞。使用Beckman L8-70型超速离心机通过Percoll密度梯度对核后上清液进行超速离心。将2.5 M蔗糖、18%Percoll放入均质缓冲液中，并将核后上清液放在超离心管顶部。离心为67200×克在Beckman Coulter 70.1 Ti转子中在4°C下保持1.5小时。样品被分为16个体积不等的样品。顶部馏分含有最少的细胞成分，底部馏分含有浓缩的细胞器带，并被分成较小的馏分体积。

共焦成像

所有图像均使用徕卡（TCS SP5）共焦显微镜拍摄。Lamp1抗体来自爱荷华州杂交瘤银行。

这项工作得到了密歇根大学MCDB系和生物科学学者计划向H.X.提供的启动资金、NIH RO1拨款（NS062792至H.X）、UM罕见疾病研究倡议、密歇根州阿尔茨海默病研究中心、国家多发性硬化学会的试点拨款（至H.X.）的支持，以及NIH R01 GM50403致L.S.W.。我们感谢Amy Chang不断提供的帮助/支持和酵母菌株，感谢Patrick Masson提供的pEVP11/AEQ质粒，感谢Dan Kilonsky提供的pCuGFP416载体，感谢Rob Botelho提供的Fab1菌株，感谢Pietro De Camili博士提供的CFP-FRB-MTM1和CFP-FKBP*2-Rab5构建物，Banasfe Larijani博士负责RFP-FRB-MTM1和EGFP-FKBP*2-Rab5构建，Martha Cyert博士负责Yvc1-GFP构建，David Ginsburg实验室负责电穿孔。我们感谢S.Park、S.Punthambaker、S.Liu和C.Li的协助，以及L.Yue、D.Ren和M.Meisler对手稿早期版本的评论。我们感谢徐实验室其他成员的鼓励和有益评论。