《公共科学图书馆·病理学》。2010年7月；6（7）：e1000994。
水泡性口炎病毒脱膜过程中基质蛋白和核衣壳转运的时空分析
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乍得E.沼泽
1美国田纳西州孟菲斯市田纳西大学健康科学中心分子科学系
朱迪思·怀特
2美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学细胞生物学系
迈克尔·A·惠特
1美国田纳西州孟菲斯市田纳西大学健康科学中心分子科学系
Douglas Lyles，编辑器
1美国田纳西州孟菲斯市田纳西大学健康科学中心分子科学系
2美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学细胞生物学系
美国维克森林大学医学院
¤:当前地址：美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院微生物系国家新兴传染病实验室研究所
构思和设计实验：CEM JMW MAW。执行实验：CEM MAW。分析数据：CEM JMW MAW。贡献的试剂/材料/分析工具：CEM MAW。论文撰写人：CEM JMW MAW。
2010年1月14日收到；2010年6月9日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
摘要
为了研究病毒脱膜过程中VSV的进入和传入基质（M）蛋白的命运，我们使用了编码M蛋白的重组病毒，该M蛋白带有C末端四胱氨酸标签，可以使用双砷（Lumio）化合物进行荧光标记。我们发现脱膜在内吞途径的早期发生，并被显性阴性（DN）Rab5的表达抑制，但不被DN-Rab7或DN-Rab11抑制。脱膜，如从M蛋白中分离核衣壳所定义的，发生在进入后15至20分钟，不需要微管或完整的肌动蛋白细胞骨架。出乎意料的是，大部分M蛋白在脱膜后仍然与内胚体膜相关，最终被转运到回收的内胚体。另一小部分但很重要的M分布在核孔复合体中，也不依赖微管或聚合肌动蛋白。高分辨率共焦显微照片的荧光定量显示，膜融合后，M蛋白在内胚层膜上扩散，同时Lumio标记的荧光也随之增加，这是RNP释放到细胞质后不久发生的。这些数据支持一种新的VSV脱膜模型，即膜融合后复合物释放到细胞质中后，RNP从M释放出来，而不是M蛋白从RNP中分离出来。
作者摘要
水泡性口炎病毒（VSV）是一种典型的包膜病毒，在细胞内吞和病毒与内胚层膜之间的低pH依赖性膜融合后进入细胞。为了引发生产性感染，病毒核衣壳必须在一个称为脱膜的过程中从病毒膜下的基质（M）蛋白中分离出来。人们对VSV脱涂层的要求知之甚少。在这里，我们使用了一种含有荧光M蛋白的病毒来跟踪活细胞中VSV的脱膜。该分析得出了三个新的发现，首次描述了VSV脱膜过程中基质和核衣壳的运输。我们发现，在病毒-基因组融合后，大多数M蛋白仍与内胚体膜结合，核衣壳被释放到细胞质中进行复制。虽然M的大部分仍然是膜结合的，但在脱膜过程中会释放出一小部分但可以检测到，并被输送到核孔中。这以前没有观察到，可能有助于关闭宿主对感染的反应。通过可视化活细胞中的脱膜过程，我们提供了第一个VSV脱膜的时空描述。
介绍
利用氯氰菊酯依赖性内吞途径的包膜病毒的进入涉及病毒附着到细胞表面，以及病毒在被包膜囊泡中的吸收，这些囊泡被运输到早期或晚期内体。当病毒粒子到达内腔具有适当pH值的隔间时，内腔和病毒膜发生酸诱导融合，导致病毒脱膜并将基因组释放到细胞质中[1],[2].水泡性口炎病毒（VSV），一种原型包膜非片段负链RNA病毒鼠疫病毒科家族通过网格蛋白和pH依赖的内吞途径进入宿主细胞[3],[4],[5],[6]VSV基因组编码五种主要病毒蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和大聚合酶蛋白（L）。病毒基因组由N蛋白包被，并与病毒RNA-依赖性RNA聚合酶（RdRp）结合，该聚合酶由L和P蛋白复合物组成。N-RNA-RdRp共同形成核糖核蛋白（RNP）复合物。病毒粒子中的M蛋白与RNP在称为骨骼
[7],[8]最近，对完整VSV颗粒的冷冻电子显微镜成像显示，RNP骨架由一个紧密的左手螺旋组成，该螺旋由M蛋白外层包围，将RNP锚定在病毒膜上[9]从病毒表面突起的是由G蛋白三聚体组成的糖蛋白尖峰。G蛋白负责将病毒粒子附着到细胞上，并使内胚体和病毒膜融合，从而导致RNP转移到细胞质中，在细胞质中发生VSV复制[3]早期的VSV脱膜模型提出，无论是在膜融合后还是伴随膜融合，M蛋白都会从RNP中分离出来，从而导致细胞膜的去凝聚骨架
[7],[8]并完成病毒脱衣[10]最近，有人提出，VSV最初与多泡体中发现的小泡融合，核衣壳释放到细胞质中发生在运输到晚期内体之后，这需要回流事件[11]以及Tsg101控制核衣壳内体到胞浆的释放[12]在解开外壳后，去浓缩的RNP充当通过包装的RNA依赖性RNA聚合酶转录病毒mRNA的模板。
VSV脱膜，定义为M与RNP的分离，是生产性感染所必需的一个基本步骤[13]。如果不脱去外壳，病毒mRNA的转录就不会发生，因为已经证明来自RNP的转录被M蛋白抑制[14],[15],[16]这一关键步骤也与另一种包膜负链病毒共享，流感病毒需要释放其基质蛋白（M1）才能进行生产性感染[17],[18]为了更好地理解VSV脱外壳的要求，我们生成了重组VSV（rVSV），该病毒编码在N端或C端具有四环素（-CCRECC-）Lumio标记的M蛋白，并恢复了感染性病毒[19]其他人也描述过类似的rVSV[20]并用于研究VSV进入和装配。以前，我们使用含有带有Lumio Green标记的M蛋白的rVSV（rVSV-MLG），发现在进入VSV病毒时，病毒内部酸化，酸化需要G蛋白[19]此外，我们获得了病毒离子酸化促进M蛋白释放的证据，并提出了一个模型，其中G蛋白诱导的酸化通过引起M蛋白的细微构象变化促进VSV脱膜，从而导致M与RNP分离。
在本报告中，我们使用rVSV-MLG检测了VSV脱膜的动力学以及VSV进入期间和脱膜后病毒相关M蛋白和RNP的去向。我们发现，在病毒膜与内体融合后，大部分M蛋白仍与囊泡结构相关，并最终与回收内体的标记物共定位。虽然大多数M仍然与内胚层膜结合，但M蛋白的一小部分却被释放出来并定位于核膜。M蛋白传递到核膜并不依赖微管或完整的肌动蛋白细胞骨架。使用共焦显微镜，我们观察到RNP进入细胞质并在进入后15到20分钟内与M蛋白物理分离，RNP释放到细胞质中也不依赖于微管或完整的微丝。RNP释放后，膜结合的M蛋白在内胚层膜上扩散，同时MLG荧光增强。总之，这些数据提供了强有力的证据，证明VSV脱膜涉及RNP从膜相关M蛋白直接释放到细胞质中，病毒在细胞质中转录，从而引发生产性感染。
结果
生产性感染需要Rab5，但不需要Rab7或Rab11
最近，我们使用含有Lumio-Green标记M蛋白（rVSV-MLG）的rVSV，报告称在内吞后不久，VSV病毒内部酸化，导致输入的MLG荧光降低[19]随后，在进入后大约10分钟，荧光恢复到原始输入水平，我们认为这是由于MLG暴露于细胞质的中性pH值，因此是VSV膜融合和病毒脱膜开始的标志[19]这些结果与VSV RNP从早期内体释放的模型一致。
为了进一步确定VSV脱膜的细胞内位置，我们检测了显性阴性（DN）Rab蛋白对rVSV-wt感染的影响。Rab5、7和11是内吞货物向早期（Rab5）、晚期（Rab7）或再循环（Rab11）内体移动所需的GTP酶[21],[22],[23]DN-Rab5的表达阻止了内吞小泡与早期内吞小体的融合，而DN-Rab7和11则分别阻止了从早期到晚期的运动或再循环内吞小粒。用编码eGFP标记的DN-Rabs的质粒转染BHK-21细胞，然后在转染后18 h用rVSV-wt感染细胞。8小时后固定细胞，渗透，并用N特异性单克隆抗体（mAb-10G4；[24])与Alexa Fluor-568缀合。如所示大多数表达DN-Rab7和DN-Rab11的细胞受到感染，但表达DN-Rab 5的细胞没有受到感染，感染受到约70%的抑制。wt-Rab蛋白的表达对VSV感染的影响很小(). 这些数据支持先前的报告，即VSV可以感染表达DN-Rab7的细胞，但不能感染表达DN_Rab5的细胞[4],[5]DN-Rab5对VSV感染的抑制作用非常显著（p=0.002），但DN-Rab11对VSV感染的抑制作用不大（p=0.1549）。为了确保我们的DN-Rab7结构具有功能性，我们检测了DN-Rabs对甲型流感病毒感染的影响。如前所示[5]、DN-Rab5和7抑制流感病毒感染()而DN-Rab11没有。总的来说，这些数据表明，大多数VSV病毒在输送到早期内体后融合并脱壳，并且VSV感染不需要转移到晚期内体。
DN-Rab表达对VSV感染的影响。用表达DN-或wt-Rab eGFP蛋白的质粒转染细胞，并在转染后18小时用rVSV-wt或流感病毒感染。细胞在感染后8小时固定、渗透并染色以检测VSV N蛋白或流感NP。（A） 荧光和亮场显微照片显示DN-Rab5（顶部面板）、DN-Rab7（中间面板）和DN-Rab11（底部面板）对VSV感染的影响。箭头标记表达Rab-eGFP蛋白的细胞。（B） 通过测定也感染了VSV或流感病毒的Rab阳性细胞的数量来量化病毒感染的抑制作用。使用Student t检验（*=p<0.002）从152个细胞（Rab5）、153个细胞和156个细胞中测定VSV感染效果的统计显著性。
rVSV-MLG的Live-cell入口
为了研究VSV脱膜和传入M蛋白的命运，将rVSV-MLG和转铁蛋白-Texas Red（Tfn-TR）在4°C下吸附到细胞中90分钟，以防止内吞，然后用预加热至37°C的培养基替换接种物开始进入。在下文所述的大多数研究中，Tfn-TR被用作表面（t-0）和内体（t-0后）标记物。为了区分表面结合型和内吞型Tfn-TR，用含有铁螯合剂的酸性缓冲液处理细胞，该缓冲液去除细胞表面与转铁蛋白受体结合的转铁蛋白。在加入温培养基和开始内吞作用之前对细胞进行酸洗（AW），导致Tfn-TR信号丢失(，t-0 AW），但对结合病毒没有影响。将细胞转移到37°C后5分钟，几乎所有Tfn-TR都被内吞(，t-5 AW）。基于Tfn-TR和MLG荧光的共定位，rVSV-MLG的绝大多数也被内吞，这与最近的两份报告一致，这两份报告显示VSV被迅速内吞[4],[6]由于担心酸处理可能导致表面结合病毒的膜融合，因此所有后续研究都是在没有酸洗步骤的情况下进行的。
表面结合的Tfn-TR和rVSV-MLG的胞吞作用。rVSV-MLG和Tfn-TR在4°C下与细胞结合90分钟，细胞立即用冰镇3%多聚甲醛（t-0）固定（顶部面板），或用酸性去铁胺处理（中部面板），从细胞表面（t-0，AW）剥离Tfn-TR，然后固定，或（底部面板）将接种物替换为37°C培养基加热2分钟，然后添加冰镇PBS快速冷却，然后在冰上清洗酸脱铁胺。酸洗后，将细胞加热至37°C，再培养3分钟（t-5，AW），然后在加热阶段用LSCM进行检查，但不固定。棒材=5µm。DIC=差分干涉对比度。
大部分M蛋白仍与转铁蛋白阳性内体相关
为了检测病毒进入的动力学并跟踪M蛋白的运输，rVSV-MLG和Tfn-TR在寒冷条件下与细胞结合，如在加入温培养基后，将细胞培养指定时间，并用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM；). 在t-0时，rVSV MLG和Tfn TR修饰了细胞表面并显示出一些共定位。5分钟后（未显示），两个标记物都被内化，大多数rVSV-MLG病毒位于转铁蛋白阳性内体中。在10到30分钟之间，含有Tfn-TR和MLG的内体从细胞外围向细胞内部移动。值得注意的是，直到最后一个检查时间点（t-150），大部分MLG仍然与Tfn-TR阳性内体相关。
M蛋白在活细胞中的脱膜和分布。细胞在4°C下接种rVSV-MLG和Tfn-TR 90分钟，然后立即用冰镇3%多聚甲醛（t-0）固定或通过添加37°C培养基快速加热，并由LSCM在指定时间在加热台上进行检查，无需固定，每个时间点使用单独的35mm玻璃底皿，以减少光漂白造成的信号损失。棒材=10µm。箭头表示MLG向NPC本地化。
将M交付至核封套
除了内胚体相关部分外，从进入后20分钟开始，少量MLG开始积聚在似乎是核膜的地方(，箭头）。MLG与该结构的关联性持续增加，直至最后一个检查的时间点。我们在任何时候都没有观察到与核膜相关的Tfn-TR，这表明这不是由于细胞核周围内质网的膜再循环所致。
为了确定将MLG运输至核膜是否需要膜融合和脱病毒涂层，rVSV-MLG和Tfn-TR与用巴非霉素A1预处理过的细胞结合，巴非霉素可抑制内体酸化并防止VSV感染，LSCM在不同时间对其进行检查，如前所述在用巴非霉素A1处理的细胞中，我们没有观察到MLG与核膜相关(). 为了确定是否需要进行蛋白质合成，我们在环己酰亚胺存在下使用氯化铵同步融合病毒和内胚体膜。氯化铵（NH4Cl）是一种溶酶体促生长剂，可防止内体酸化，从而抑制内吞病毒的融合和脱膜[10],[25]，但不像巴非霉素A1，NH4氯可以很容易地从细胞中洗掉，从而使内吞小室迅速重新酸化。NH在场的情况下进入4Cl、接种物和NH4去除Cl，将细胞清洗4次，并添加含有环己酰亚胺的培养基。NH后立即或60分钟固定细胞4Cl去除。然后将细胞渗透并用抗Nup62抗体染色，该抗体与核膜上的核孔复合体（NPC）结合，并用抗M单克隆抗体（23H12；[24])并由LSCM审查(). t-0时，rVSV-MLG颗粒呈小泡状结构（内体），核膜上未检测到M蛋白(，顶部面板）。与中显示的结果类似在t-60时，MLG主要存在于大的、主要是核周内胚体中，少量但重要的MLG定位于核膜(，t-60箭头）。这些数据表明，虽然大多数传入的（例如，与病毒相关的）M蛋白仍然与Tfn阳性内体相关，但在脱涂层后，少量M蛋白会进入鼻咽癌。据其他人报道，M单抗（23H12）没有检测到与核膜结合的M蛋白(，黄色箭头），这解释了为什么早期研究检查VSV脱涂层[10]未观察到向NPC输送M蛋白。23H12MmAb识别的表位与结合核穿梭蛋白RaeI的M区域重叠[26],[27]表明与核膜相关的MLG部分可能与RaeI络合。
MLG在核膜上的定位。（A） 用巴非霉素A1（Baf）预处理BHK细胞，然后将rVSV MLG和Tfn TR在含有Baf的培养基中冷结合细胞90分钟。取下接种物，将细胞在37°C的含有Baf的培养基中培养150分钟。细胞通过LSCM成像，如棒材=10µm。（B） 细胞在NH存在下感染rVSV-MLG4Cl作用90分钟，使病毒在内体中积聚，然后通过在无NH的培养基中培养开始进入4氯，但含有环己酰亚胺，以防止新的病毒蛋白合成。将细胞固定在t-0（顶部面板）和t-60（底部面板），使用罗丹明偶联抗M单克隆抗体（红色）和Nup62抗体标记Alexa Fluor-647（蓝色）对M蛋白进行染色，并由LSCM进行检查。白色箭头表示MLG在核包膜处的定位。请注意，M单抗没有检测到定位于核膜的M蛋白（中间面板，黄色箭头）。棒材=2µm。
细胞骨架抑制剂存在下MLG的贩运
为了确定是否需要微管或微丝将MLG输送至核膜细胞，在NH存在的情况下接种rVSV-MLG4Cl作用60分钟，然后加入细胞骨架抑制剂细胞松弛素D或诺克唑作用30分钟。NH4用含有或不含细胞骨架抑制剂的环己酰亚胺培养基清洗细胞，去除氯离子，然后再培养60分钟。然后固定细胞，并使用德克萨斯红血球蛋白染色丝状肌动蛋白()或用于微管蛋白(). 无论是在没有抑制剂（顶部面板）还是在有抑制剂（底部面板）的情况下，MLG都与内体和核膜相关（箭头所示）。这些结果表明，MLG传递到核膜并不需要完整的肌动蛋白细胞骨架或微管。
细胞松弛素D或诺康唑存在时MLG的分布。BHK细胞在NH存在下感染rVSV-MLG4Cl如所述在NH之前添加细胞骨架抑制剂30分钟4氯洗脱和抑制剂保留在洗脱后的培养基中，直到60分钟后细胞固定。MLG、Nup62和肌动蛋白（A）或微管蛋白（B）在没有（顶部面板）或（底部面板）细胞骨架抑制剂的情况下的分布。箭头表示核膜定位。使用Canvas 11软件调整所有图像的亮度级别，以在转换为灰度后最大化MLG信号。棒材=10µm。
MLG的染色和再循环内体的标记
中的图像表明MLG的大部分在进入后至少150分钟内仍与Tfn阳性内体相关。为了确定这些核周结构的身份，我们使用了与溶酶体（LAMP-1）、晚期内体/溶酶体相对应的标记（甘露糖-6-磷酸受体，M-6-P-R）或再循环内体（Tfn-TR和Rab11）。rVSV-MLG在NH存在下被内吞4Cl，如所述、接种物和NH4去除Cl，将细胞再孵育60分钟，然后使用各种内胚体标记物的抗体进行染色，或直接可视化以进行Tfn-TR。用各种标记物对MLG共定位的量化表明，大多数传入的M蛋白仍然与成熟为再循环内胚体的膜相关()，而只有一些MLG被输送到晚期内体()和溶酶体().
利用标记物对MLG进行染色，以回收内体。按照所述进行同步融合分析，将细胞固定在t-60处，对（A）LAMP-1、（B）甘露糖-6-磷酸受体、（C）Tfn-TR或（D）Rab11进行染色，然后用LSCM进行检查（Bars=10µm）。合并图像的右上角显示了来自两个独立实验的大约20个单个细胞的MLG与指示标记的共定位百分比。
从MLG中分离RNP与生产性感染相关，不需要微管
目前尚不清楚VSV RNPs是否被释放到细胞质中，或者它们在解开外壳后是否仍与细胞膜相关体内为了进一步确定病毒脱膜的位置，我们询问是否可以检测到内吞后从MLG物理分离的核衣壳。细胞接种rVSV-MLG，如，但不包括Tfn-TR，且在转移至37°C后开始进入。固定细胞，在指定时间通过N蛋白染色检测RNP。在t-5，大多数RNP与MLG共同定位(). 从进入后大约10分钟开始，可以看到RNP从MLG-内体中分离出来。RNP-MLG共定位的最大变化发生在15到20分钟之间；与MLG共定位的RNP比例的量化从t-5到t-15的约80%下降到t-20的不到50%(). 我们还使用细胞分馏方案对RNP-M的分离进行了生化检验，以确定荧光共焦显微镜观察到的结果是否可以通过独立的方法重现。如所示，RNPs在进入后10至20分钟从t-0的完整病毒中重新分配到细胞质部分，与RNPs从MLG中分离的时间类似同样，M蛋白重新分布到一个片段中，该片段从10分钟开始在内胚体标记中富集，一直持续到实验结束(). 因此，当使用共焦显微镜或细胞分馏分析时，RNP和M蛋白的分布具有良好的相关性。
从MLG-内体中分离RNP的动力学。（A） rVSV-MLG在寒冷条件下与细胞结合，如下所述但省略了Tfn-TR。在指定的时间固定细胞，通过使用与Alexa Fluor-568偶联的N单克隆抗体对N蛋白进行染色来检测RNP。LSCM使用相同的探测器、偏移和增益设置收集图像。棒材=10µm。（B） （A）中图像的RNP与MLG的彩色化，作为进入后时间的函数。通过Student t检验（n=9个细胞）确定显著性。（C） 在Adobe Photoshop中调整了来自（A）的t-5和t-60图像的红色和绿色通道电平，以提供类似的红色和绿光强度，这表明在t-5时间点，LSM软件检测到的MLG与RNP的共定位效果更好。
病毒进入过程中RNP和M蛋白的细胞分离和分布分析。将rVSV-wt在放线菌酮存在下的低温下与细胞结合90分钟，以防止新的蛋白质合成，取出接种物并清洗细胞，然后立即从培养皿中取出（t-0）或加热至37°C，然后在指定的时间收获进行分馏。使用多克隆抗VSV血清对组分进行免疫印迹分析。显示了免疫印迹的相关区域。NV（无病毒）表明细胞被模拟感染并在t-0收获。印迹下方的图表显示了每个组分中N或M蛋白的定量。（A） 在P16（质膜相关病毒）和NDG颗粒（耐洗涤剂核衣壳）组分中检测到N蛋白。输入后的时间显示在免疫印迹上方。VSV N是一条含有纯化病毒的通道。（B） 在S16（质膜和线粒体膜）和NDG上清液（内膜和核膜）部分检测到M蛋白。NV（无病毒）模拟感染细胞。VSV M是含有纯化病毒的泳道。（C） 这四个组分用针对所示细胞标记物的抗体进行检测。
为了确定RNP分离是否需要微管rVSV-MLG在NH存在下被内吞4Cl作用1小时，然后添加诺卡唑和环己酰亚胺30分钟，以解聚微管并停止蛋白质合成。要么立即固定牢房()或在这两种抑制剂存在的情况下培养，或仅与诺卡唑培养2小时。MLG和N蛋白共定位的定量显示，在t-0时，92.8%（+/-3.4%，N=50个细胞）的RNP与MLG共定位，而在t-120时()RNP-MLG共定位显示，大多数核衣壳与M蛋白分离，仅为31.3%（+/-8.2%，n=50个细胞）。与在,和在t-120处，有非常明显的与核膜相关的MLG荧光，但重要的是核膜没有N蛋白染色。这表明M蛋白仅定位于核膜，与RNP无关。如其他人之前报告的[28]我们还观察到VSV转录和病毒蛋白合成可能发生在缺乏组织化微管网络的细胞感染后()如细胞质中广泛的N蛋白染色所示，这表示新的N蛋白合成。这些结果也证实了在代表传入的RNP，而不是来自新的N蛋白合成。
诺康唑存在下内体RNP的释放和病毒蛋白的合成。NH后t-0（A）和t-120（B和C）接种rVSV-MLG的细胞的共焦图像4在环己酰亚胺和诺卡唑（B）或仅在诺卡唑中氯洗脱，并使用与Alexa Fluor-568偶联的N单克隆抗体对VSV N蛋白进行染色。使用LSM软件3.2版中的共定位功能，对50个单个细胞的共定位量进行量化。与MLG共定位的N蛋白的百分比指示t-0和t-120（N＝50个细胞）。棒材=5µm。
VSV脱膜过程中膜结合MLG的空间分布
当病毒和内胚体膜发生融合时，在膜融合处，病毒膜被添加到内胚体薄膜上，从而在内胚体中产生不对称。基于MLG与病毒膜的紧密结合，应该可以使用MLG作为标记物来可视化病毒内体融合事件。
为了检测病毒进入和脱膜过程中MLG的空间分布，我们分析了来自类似于为了进行此分析，我们使用了100X-1.4 N.a.复消色差物镜，并在捕获之前使用1024×1024像素分辨率将图像数字放大5倍。显示了进入后15分钟收集的图像示例，该示例清楚地显示了MLG相对于Tfn-TR在内体中的不对称分布。为了确定这种不对称性是否需要膜融合，我们产生了缺乏G蛋白的MLG病毒颗粒（ΔG-MLG）。我们之前已经证明，“秃顶”ΔG-VSV能够结合并进入细胞，尽管其效率略低于wt-VSV，并且由于缺乏G蛋白，该病毒是非感染性的[29]与感染性rVSV-MLG相比，我们发现来自ΔG-MLG颗粒的MLG没有获得不对称分布()可能是因为颗粒停留在内体的内腔内。不出所料，我们也没有在任何时间点观察到与核膜相关的ΔG-MLG粒子的MLG（数据未显示）。
病毒进入和脱膜期间MLG的时空分布。按照所述进行同步进入分析使用rVSV-MLG（A）或“秃顶”ΔG-MLG（B），在添加37°C培养基15分钟后对细胞进行成像。使用LSM软件的“裁剪”功能将具有高浓度内体的区域放大到500倍，以显示含有MLG和Tfn-TR的胞内囊泡。箭头显示了rVSV-MLG感染细胞中，MLG在Tfn-TR阳性内体中的不对称分布。棒材=5µm。（C） 入场后150分钟MLG分发。（D） 活细胞实验中发现的Tfn-TR内体（n=30内体）上MLG“斑块”的大小与使用蔡司LSM510软件3.2版的Profile函数进行测量，并绘制为输入后时间的函数。
除了在膜融合部位观察MLG外，我们还跟踪MLG融合后的命运。我们发现，进入后20至30分钟，不对称性开始消失，MLG阳性膜面积增大，大约60分钟后达到稳定(). 这些数据表明，病毒与冰上细胞结合后，病毒-基因组融合在细胞升温至37°C后的10至15分钟内发生。数据还表明，随着膜融合后M蛋白暴露在细胞质中，它开始扩散到内胚体膜，在那里随着病毒膜和内胚体薄膜的脂质继续混合，它变得均匀分布。MLG表面积增加的动力学与我们之前公布的结果相关[19]结果表明，在初始低pH诱导MLG荧光降低后，荧光在进入后约60分钟内稳定增加。根据中显示的结果，荧光的增加可能代表MLG从病毒粒子内的有序螺旋晶格转变时的堆积减少[9]到脱涂层后发现的更分散的形式。这种荧光变化和MLG在内胚层膜上的移动在时间上也与RNP与MLG共定位的减少有关，这表示RNP释放到细胞质中，如.
讨论
为了研究VSV进入，我们使用Lumio技术生成了编码荧光标记M蛋白（rVSV-MLG）的rVSV，最近报道称，在rVSV-MLG进入后不久，MLG荧光出现暂时性降低，我们认为这是由于病毒内部酸化所致[19]。进入后5到10分钟，MLG荧光恢复到输入水平，随后荧光稳定增加，在进入后60到150分钟之间趋于稳定。在本报告中，我们通过检测VSV脱膜期间和脱膜后M蛋白的细胞内分布来扩展这些研究，并表明当RNP释放到胞浆中时，大部分M蛋白仍与内体结合。我们确认了其他人之前的报告[4],[5]，VSV感染需要Rab5，但不需要Rab7，并通过表明DN-Rab11也不能抑制VSV感染来扩展这些研究(). 我们的研究还首次对VSV脱膜过程中膜融合后RNP的释放以及脱膜过程中M蛋白和RNP的空间关系进行了动力学描述。
发现1：脱涂层后，M仍与内体相关
这些研究的一个重要新发现是，大多数传入的M蛋白在进入后的早期和晚期都与内体膜相关。这在寒冷条件下病毒与细胞表面结合的细胞中以及通过NH同步病毒融合的细胞中都可以看到4氯离子冲刷。通过量化从MLG内体中分离的N蛋白量()，似乎超过75%的病毒已经融合，因此只有一小部分是未融合的病毒。因此，大多数传入的病毒以生产性方式进入细胞，大部分M蛋白仍与内体膜结合。融合后病毒膜的拓扑结构可以预测与内体相关的M会暴露在细胞质中；因此，M与内胚体膜的结合必须很强。
调查结果2：向NPC贩运人口
随着感染的进展，例如进入后60至150分钟，在大的核周结构中观察到M蛋白，其被染色以寻找再循环内体的标记。脱膜后，M的一小部分明显释放出来，并迅速定位于核膜。这些观察结果与早期的一项研究有很好的相关性，该研究表明，使用生化分析，约15%的输入M在进入细胞后释放到胞浆中[10]; 然而，在该研究中没有观察到明显的核膜定位。我们的结果支持了这一发现，即只有一小部分进入的M蛋白在脱膜后以可溶性形式释放出来。然而，少量M与Nup62共定位，表明该可溶部分与核孔复合物（NPC）结合。这些数据与GFP-M融合蛋白与NPC相关的报道一致[27]根据我们的发现，来自传入病毒颗粒的M蛋白也与NPC结合，我们建议在VSV进入时，脱衣后释放少量M蛋白，该部分与NPC相关，可能会阻止核质转运[30]因此，这表明该病毒在病毒蛋白质合成开始之前，就已经开始努力抑制先天免疫反应。
将M贩运到NPC的机制尚不清楚。我们观察到在没有聚合肌动蛋白的情况下，MLG在核膜上的定位()或微管蛋白(). 这是意料之外的，因为早期研究表明M蛋白与细胞骨架结合[31],[32]据推测，向核膜输送M涉及微丝或微管。或者，向NPC贩运M可能涉及M对RaeI的约束力。众所周知，M与RaeI的结合会抑制mRNA核质转运，RaeI与有丝分裂纺锤体复合体中的微管结合[33],[34]因此，M可以在细胞质中与RaeI结合并传递给NPC；然而，我们观察到，在诺康唑存在下，M向核包膜的转运，这表明NPC的定位可能是通过不同的机制发生的。
我们的研究结果也为VSV的进入和脱膜机制提供了新的线索。目前有两种模型被提议用于研究VSV核衣壳如何传递到细胞质。这两种模型都是以公认的范式开始的，即VSV颗粒通过网格蛋白依赖性途径被内吞，并被输送到早期内体。在VSV进入的传统模型中，一旦早期内胚体腔的pH酸化至～pH6.3，G蛋白就会发生构象变化，从而导致病毒包膜与内胚体膜融合，RNP暴露在细胞质中发生初级转录。通过使用siRNAs敲除早期到晚期内体成熟所需的必需Rab蛋白，该模型得到了支持[5],[21]并使用特定抑制剂和TIRF显微镜[4]最近提出了第二种模型，即融合早期发生，但RNP不会立即释放，而是在多泡体中被转运到晚期内体，此时发生“回流”事件，将RNP释放到细胞质中[11],[12]我们的数据支持传统模型（至少对大多数粒子而言），即VSV病毒在内吞途径早期融合，RNP释放，意外观察到，在RNP释放发生后很长一段时间内，大量M蛋白仍与内胚层膜相关。
发现3：RNP从内体结合的M蛋白中释放
荧光标记M的使用和共焦显微镜对M分布的直接可视化使我们首次描述了VSV脱膜过程中病毒蛋白的时空关系(). 根据这些数据提出了以下事件。在2到5分钟内，病毒粒子被内化，在5到10分钟内，它们暴露在低pH值下，这可以通过病毒粒子内部MLG荧光的损失来检测(步骤A，[19]). 众所周知，低pH值也会导致G蛋白的构象变化[35],[36]导致了膜融合事件[37],[38]VSV感染所需(，步骤B）。在进入过程中，我们发现MLG呈不对称分布，并定位于内胚体膜的一侧，我们认为发生这种情况的原因是病毒膜与内胚体的分隔膜融合，RNP在其中释放到细胞质中(，步骤C）。进入后15至20分钟，RNP与MLG的共定位急剧下降，但由于我们的分析测量了RNP和MLG的物理分离，这些数据表明，初始脱膜事件将在此之前发生。我们还提出，病毒膜上浓缩的RNP与MLG之间的相互作用将MLG维持在一个有组织的晶格中，这最初限制了MLG荧光的量子产率，并且在RNP释放到细胞质中后，这种组织丢失，导致MLG穿过内体膜和我们在进入后大约15分钟开始观察到MLG荧光伴随增加(，步骤D）。脱膜后，一些M释放到细胞质中并与NPC结合(，步骤E）。通过生成编码M-Lumio的rVSV，以及与红色、黄色或青色荧光蛋白融合的其他病毒蛋白，或与Lumio-Green和Lumio-red差异标记的多个Lumio标记病毒蛋白，应该可以进一步了解VSV进入的早期事件和VSV脱外壳的机制。
VSV进入和脱涂层事件的时间线。基于rVSV-MLG中MLG和RNP的时空成像分析，建立了VSV进入和脱膜模型。分析中的相关数字显示在括号中。观察到的事件时间以红色字体显示。在该模型中，病毒粒子附着在细胞表面，以依赖Rab5的方式被内吞并运输到早期内体，低pH值会导致构象变化G，导致病毒粒子内部酸化（a），随后病毒膜和内体膜融合（B）。病毒内部酸化会影响M蛋白，破坏膜相关M（带橙色边界的绿色圆圈）和浓缩RNP之间的相互作用，导致RNP在膜融合（C）后释放到细胞质中。M的大部分仍然与内胚体相关，但在RNP释放（D）后开始扩散到内胚体膜。较小部分的M释放到胞浆中，以微管和肌动蛋白非依赖性的方式到达NPC（E）。
材料和方法
rVSV-ML的Lumio Green标记
如前所述，100 mm平板上的BHK-21细胞在～95%的汇合处感染rVSV-ML或G补体ΔG-ML 1小时[19]然后在感染后4小时（hpi），用还原的Opti-MEM I（Invitrogen）清洗细胞两次，并用含有200 nM Lumio Green（Invit罗gen）的10 ml Opti-EM I替换。收集上清液18 hpi，并在SW41摆动桶转子（Beckman）中以38000 rpm在20%蔗糖垫上离心45分钟，浓缩标记病毒。将病毒颗粒重新悬浮在1 ml 10%蔗糖-TN缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4；150 mM NaCl）中的冰上，并将病毒储存在−80°C下。根据制造商的说明，通过BHK-21细胞上的标准斑块试验测定滴定度，并通过BCA蛋白试验（Pierce）测定蛋白质浓度。按说明测定每种病毒制剂的荧光[19].
野生型和显性阴性Rab蛋白的表达
根据制造商的说明，用表达野生型（wt）或显性阴性（DN）Rab蛋白的质粒（范德比尔特大学Terry Dermody博士慷慨捐赠）转染BHK-21或MDCK细胞，根据BHK细胞使用脂质体（Invitrogen），MDCK使用效应烯（Qiagen）。重量和DN-Rab5（S34N；[39],[40])，Rab7（N125I；[41])，或Rab11（S25N；[42],[43])蛋白与质粒p-eGFP（Clontech）中的eGFP融合。转染后18小时，BHK-21细胞感染rVSV-wt（MOI=10），MDCK细胞感染A/Aichi/2/68（H3N2）流感（流感库存是圣犹德儿童研究医院Charles Russell博士赠送的礼物），并固定在感染后8小时（VSV）或15小时（流感）。然后用单克隆10G4对细胞进行VSV N蛋白染色[24]，或与生物素缀合的多克隆流感NP抗体（来自圣犹达儿童研究医院Richard Webby医生的慷慨礼物）。使用配备HR Axiocam相机和Axiovision软件的蔡司Axioplan 2显微镜采集荧光显微照片。通过使用公式[（1−（病毒阳性细胞/Rab阳性细胞））*100]计算同样为VSV N或流感NP阳性的区域中Rab阳性（eGFP阳性）细胞的总数，确定10–20个单独区域中约90至150个细胞的抑制百分比。
免疫荧光（IF）染色和共焦显微镜
rVSV-MLG感染细胞用pH 7.4（PBS）的磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后在室温下用PBS中的3%多聚甲醛（PFA）固定15分钟。去除固定溶液，用含有10 mM甘氨酸和0.05%叠氮化钠（PBS-甘氨酸）的PBS洗涤细胞两次，然后在室温下用1%Triton X-100在PBS-甘氨酸中渗透1分钟。渗透后，用PBS-甘氨酸清洗细胞两次，然后用图图例中所示的以下抗体染色：a）使用单克隆抗体（mAb）23H12的M蛋白[24]使用单克隆抗体10G4与罗丹明结合，b）VSV N蛋白[24]与罗丹明缀合或在与与Alexa Fluor-633缀合的第二山羊抗小鼠抗体孵育后，c）使用mAb#610497的Nup62（BD Biosciences），d）使用mAb#MA1-066的甘露糖6磷酸受体（M-6-P-R）（亲和生物试剂），e）使用抗LAMP-1 mAb的LAMP-1（爱荷华大学的发育研究杂交瘤库），f）使用多克隆抗体的EEA1（#2411，细胞信号技术），g）使用多抗体的Rab11（#71-5300，Zymed实验室），或h）使用抗α微管蛋白单克隆抗体的微管（#a-11126，分子探针）。未结合的一级抗体用山羊抗鼠抗体或与罗丹明偶联的山羊抗兔二级抗体（Jackson Research Laboratories）检测，或用Zenon IgG2b Alexa Fluor-647（#A-21242 Invitrogen；Molecular Probes）标记的山羊抗鼠抗Nup62抗体检测。使用与Texas Red-X（Invitrogen；Molecular Probes）偶联的磷灰石染色肌动蛋白。使用激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss LSM 510和AIM软件3.2版），在1微米光学切片中使用多轨迹设置和488nm、543nm或633nm激光激发来检测所示蛋白质的分布。使用蔡司LSM生理学软件包的Profile功能，通过计算三个不同实验共50个细胞中与M共定位的N蛋白点的数量，实现了M和N蛋白的共定位百分比。通过选择单个细胞（n=5）并使用LSM Physiology软件的共定位功能，用内体标记物量化MLG的共定位。从靠近细胞中心平面的1微米光学切片上，用内体标记物测定MLG的染色。对于共定位分析，绿色和红色像素的阈值设置均设置为100。
活细胞进入分析
将BHK-21细胞镀在35 mm玻璃底培养皿（MatTek Corporation）上，用冰镇Opti-MEM I（Invitrogen）清洗两次，然后放置在4°C下15分钟。将发光标记病毒（MOI 50）和与德克萨斯红（50µg）结合的人转铁蛋白吸附在0.1 ml冰镇Opti-MEM I中60分钟，每15分钟在冰上摇晃一次。通过用冰冷PBS清洗细胞3次来检查细胞的表面结合。将细胞置于冰上，并用冰冷的100µM脱铁胺在PBS中清洗一次5分钟，以螯合残余铁。然后用冰镇酸洗缓冲液（100mM醋酸钠，50mM氯化钠，pH 5.5）清洗细胞5分钟，以从细胞表面的转铁蛋白受体释放转铁蛋白-TR。酸洗后，用PBS清洗细胞3次，然后在37°C的Opti-MEM I中培养5分钟。对于未经酸洗的MLG运输，用Opti-MEM I替换冰镇接种物，将其加热至37°C，并将细胞培养至指定的时间。在蔡司LSM 510激光扫描共聚焦显微镜上对活细胞（非固定细胞）中的MLG和Tfn-TR进行成像，使用37°C的加热台和多轨道模式下使用488nm和543nm交替激光激发的客观加热环。使用相同的探测器增益和偏移设置为每个时间点采集图像。在室温下的载物台上添加2ml冰镇Opti-MEM I后，检查非进入时间点（t-0）。为了减少样品光漂白的问题，每个时间点都要检查单独的平板。
细胞分馏分析
分馏方案基本上是其他人之前描述的[44]，对VSV感染进行以下修改。将BHK-21细胞放置在35 mm的培养皿中，用冰镇Opti-MEM I（Invitrogen）清洗两次，然后放置在4°C下10分钟。rVSV-wt（MOI 50）在0.3 ml冰镇Opti-MEM I中吸附90分钟，每15分钟在冰上摇晃一次。取下接种物，用冰镇Opti-MEM I清洗细胞两次，然后用冰镇PBS清洗两次。然后立即用1ml冰镇MES缓冲液（150 mM NaCl和25 mM MES，pH 6.5）培养约10分钟（直到通过移液从培养板上取下细胞为止），或在37°C下孵育Opti-MEM I中指示的时间。在37°C孵育后，通过添加冰镇PBS快速冷却细胞，然后在冰镇MES缓冲液中孵育10分钟，然后将细胞悬浮液转移到1.5 ml冰上的微量离心管中。所有后续步骤均在冰上进行，并使用冷却至4°C的微型离心机。使用装有25号针头的1 ml注射器，通过将细胞悬浮液快速穿过针头20次，使细胞分裂。通过台盼蓝染色评估细胞破坏，显示治疗后>95%的细胞是台盼蓝可渗透的。然后在1000×克持续10分钟。将上清液转移到冰上的干净试管中，上清液部分再次以1000×克，以清除残留的颗粒材料。第一个1000×克小球放在冰上。将上清液转移到新管中，然后以16000×g的速度旋转10分钟。将16000×g自旋（P16）的颗粒用冰镇MES缓冲液洗涤一次，排斥，然后再悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中。用10%三氯乙酸（TCA）沉淀上清液（S16），并将沉淀重悬于SDS-PAGE样品缓冲液中。初始1000×克用冰镇MES缓冲液洗涤一次纺丝，重新洗涤，然后将颗粒重新悬浮在NDG缓冲液中（1%Nonidet-40；0.5%脱氧胆酸盐；10%甘油；137 mM NaCl和20 mM Tris，pH 8.0）。在冰上培养2分钟后，以16000×克持续10分钟。将颗粒（NDG颗粒）在NDG缓冲液中清洗一次，将其排斥，然后再悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中。上清液（NDG-supt）经TCA沉淀并悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中。在含有SDS的9%丙烯酰胺凝胶上电泳组分，转移到Immobilon膜上，并使用以下抗体进行免疫印迹检测，使用制造商描述的Pierce Dura-West检测试剂进行检测。扫描胶片并将图像导入Photoshop（Adobe）as后，使用图像J量化相关组分中的N和M蛋白。畅通节能法。使用的抗体为a）多克隆抗VSV（#4006-F；Whitt lab），b）抗Nup62（mAb#610497；BD Biosciences），c）抗EEA1（多克隆抗体#2411；细胞信号技术），d）抗Rab11（多克隆抗抗体#71-5300；Zymed Laboratories），e）抗α微管蛋白（mAb#a-11126；分子探针），和f）抗线粒体膜蛋白OxPhos复合物-I 39 kDa（CI-39；单克隆抗体#A21344；分子探针）。
进入抑制和同步融合分析
如前所述，为了防止内体酸化，我们使用了质子ATP酶抑制剂bafilomycin A1[19]或溶酶体试剂NH4NH的Cl4Cl处理用于同步病毒与内胚层膜的融合，BHK-21细胞用PBS洗涤两次，然后用含有100mM NH的PBS洗涤二次4Cl.将带有或不带有50µg转铁蛋白-TR的病毒接种物吸附在含有100mM NH的无血清DMEM（SF-DMEM）中4Cl作用60或90分钟。吸附后，用PBS清洗细胞四次，以去除NH4Cl，然后立即（t-0）用3%多聚甲醛固定在PBS中，pH 7.4，或在37°C下添加2 ml含有10µg/ml环己酰亚胺的SF-DMEM后60分钟（t-60）。使用细胞骨架抑制剂细胞松弛素D或诺卡唑进行同步融合分析，如上所述，但病毒在SF-DMEM中用100mM NH吸附60分钟4用含有10µM细胞骨架抑制剂和100mM NH的SF-DMEM替换Cl和培养基4Cl持续30分钟。NH4然后如上所述清洗Cl，但细胞骨架抑制剂保留指定时间，然后用3%PFA固定细胞并准备用于IF。
致谢
我们感谢Terry Dermody博士和Mario Rinaudo博士（范德比尔特大学）对表达野生型和显性阴性eGFP-Rab融合蛋白的质粒的馈赠，感谢Charles Russell博士和Richard Webby博士（圣犹德儿童研究院）分别对H3N2流感病毒和NP抗血清的馈赠以及Dr。Kui Li（田纳西大学健康科学中心）为赠送抗线粒体CI-39抗体。我们还感谢Carolyn Matthews的技术援助和LSCM设施的管理，以及Elizabeth Matheni和Erika Dillard在手稿准备期间的评论。
脚注
提交人声明，不存在相互竞争的利益。
这项工作得到了NIH向JMW提供的AI22470赠款的部分支持。LSCM贷款通过NCRR拨款S10 RR13725提供给MAW。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备中没有任何作用。
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