蜗牛家族成员蜗牛和鼻涕虫在胚胎发育和肿瘤进展过程中触发上皮-间质转化（EMT）(Nieto 2002年). 在发育过程中，它们参与原肠胚形成时早期中胚层细胞的侵入和神经管神经嵴的分层(Nieto 2002年). 雏鸡的功能分析(Nieto等人，1994年)鸡和小鼠胚胎中EMT位点的表达模式发生了显著变化(Sefton等人，1998年)表明Slug在小鸡中诱导了这种转变，而蜗牛在小鼠中触发了EMT。的确，在哺乳动物细胞中蜗牛诱导EMT并抑制E-钙粘蛋白转录(Batlle等人，2000年;Cano等人，2000年)、和蜗牛突变小鼠在原肠胚形成时因EMT缺陷和E-钙粘蛋白表达维持而死亡(Carver等人，2001年). 对所有主要脊椎动物类群的基因家族的分析表明蜗牛控制鱼类、两栖类和哺乳动物神经嵴发育的基因层次较高(Locascio等人，2002年;Aybar等人，2003年).
蜗牛也参与了EMT，EMT是伴随着肿瘤侵袭性的获得而发生的(涅托2002;Thiery 2002年). 在小鼠皮肤中诱导的肿瘤浸润细胞中表达(Cano等人，2000年)以及乳腺导管癌患者的活检(Cheng等人，2001年;Blanco等人，2002年)，胃癌(Rosivatz等人，2002年)和肝细胞癌(Sugimachi等人，2003年).蜗牛显示为恶性表型的早期标记，并作为预后因素(Blanco等人，2002年).
EMT的过程意味着一个显著的表型变化，包括上皮标记物的丢失、间充质标记物的获得和细胞形状的改变。因为蜗牛能够诱发完全的EMT(Batlle等人，2000年;Cano等人，2000年)，它一定有很多目标。的确，加上E-钙粘蛋白已确定的蜗牛抑制的其他直接靶点包括上皮木素-1(Guaita等人，2002年)以及紧密连接的组件克劳丁和闭塞素(池内等人，2003年). 蜗牛是参与基底膜和细胞外基质降解的分子的上游，如金属蛋白酶2（MMP-2；横滨等人，2003年)间充质标志物波形蛋白和纤维连接蛋白(Cano等人，2000年;Guaita等人，2002年)以及其他转录因子，如ZEB-1和LEF-1(Guaita等人，2002年). 尽管还没有报道蜗牛表达与细胞骨架蛋白之间的直接联系，但RhoB，一种参与细胞骨架肌动蛋白重排的小GTPase，在鸡神经嵴分层期间位于Slug的下游(Del Barrio和Nieto 2002年).
通过分析转染了蜗牛以及小鼠和小鸡胚胎，我们在这里表明蜗牛也调节细胞周期的进展和存活。蜗牛调节G1早期到晚期过渡和G1/S检查点的组成部分，包括抑制周期素D2抗原转录和p21/Cip1的增加。同时，蜗牛通过激活MAPK和PI3K生存途径，抵抗血清耗竭或TNF-α给药的致死效应。这些生存特性赋予了在胚胎发育和肿瘤传播期间侵袭和迁移细胞的选择性优势。
结果
蜗牛影响细胞周期的进展
当在不同的上皮细胞系中稳定表达时，小鼠和人类蜗牛都显著降低了细胞生长，这促使我们分析这些细胞的细胞增殖和周期进展。转染后蜗牛（MDCK蜗牛），MDCK细胞进行了完整的EMT(Cano等人，2000年)并在培养24小时后加入较低水平的BrdU（模拟转染细胞中观察到的25%，). FACS分析()表明培养72h后，绝大多数蜗牛表达细胞（93%）在基础条件下处于细胞周期的G0/G1期。然而，这些细胞可以对有丝分裂原产生反应并增殖，用10%的血清替换16小时后观察到(). MDCK-Snail转染剂在培养24小时后，G0/G1中的细胞百分比再次高出许多（61%对36%），并且在所有其他时间进行分析(). 为了检查蜗牛表达细胞是否难以通过G1/S检查点，我们分析了Cip/Kip蛋白的表达，这些蛋白对抑制cdk2–Cyclin E复合物的活性至关重要，并负责视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的过度磷酸化以及从G1晚期到S期的后续进展(Ortega等人，2002年). 尽管在MDCK-Mock和MDCK-Snail细胞中p27（Kip1）的水平仍然较低，但蜗牛在基础状态和8小时后显著增加了p21（Cip1）表达()培养12小时(). 然而，16小时后观察到Rb过度磷酸化，同时出现下降()并进入S阶段(). 当我们稍后分析p21的水平时，我们发现24小时后蜗牛表达细胞中的p21水平再次升高，并且始终保持在高于对照转染细胞的水平(). 因此，p21的表达受到严格调控，并保持在较高水平，除非是在细胞暴露于高浓度有丝分裂原的短时间内，并通过循环进行反应。
蜗牛表达抑制细胞增殖。(一)在稳定转染蜗牛（MDCK-Snail）或空载体（MDCK-Mock）的MDCK细胞中脉冲1h后，BrdU掺入。培养24小时后的亮场图像。(B类)培养不同时间后MDCK Mock和MDCK Snail细胞中细胞周期的FACS分析。
蜗牛改变参与从G1期向S期进展的蛋白质的表达。MDCK-Mock和MDCK-Snail细胞的Western blot分析。(一)G1检查点分子、cdk抑制剂p21和p27的水平以及Rb磷酸化的程度。(B类)培养不同时间后p21的水平。视网膜母细胞瘤蛋白；pRb，次磷酸化状态；ppRb，过度磷酸化状态。显示了具有代表性的实验(n个= 4).
蜗牛抑制细胞周期蛋白D2转录
G1/S检查点需要细胞周期蛋白E的活性，而细胞周期蛋白D的活性有助于从G1早期到晚期通过限制点（R）进行细胞的另一轮分裂。因此，我们决定分析细胞周期蛋白D和E在两种细胞系中的表达。虽然我们无法检测到细胞周期蛋白E（数据未显示）或细胞周期蛋白D3的数量存在显著差异()在MDCK蜗牛表达细胞与非表达细胞中，我们观察到细胞周期蛋白D1和D2的水平降低(). 此外，我们还发现，在MDCK-Snail细胞中，其伴侣细胞周期素依赖性激酶cdk4的表达降低(). 这些结果表明，表达蜗牛的细胞在限制点进展时受到损伤，细胞周期蛋白D的含量有限。
蜗牛抑制周期素D2抗原转录。(一)D细胞周期蛋白及其伴侣cdk4的分析。总erk2的免疫印迹用作凝胶负荷的控制。(B类)分析细胞周期蛋白D1和D2类通过Northern blot对培养不同时间后从MDCK-Mock和MDCK-Snail细胞中提取的RNA进行转录。这个GAPDH公司探头被用作加载控制。(C类)的活动周期素D2抗原发起人。荧光素酶报告子构建携带野生型人类周期素D2抗原将启动子（-1624）或两个E盒中的独立缺失/突变与小鼠蜗牛表达载体或空载体（pcDNA3）一起转染到MCA3D细胞中作为对照。转染40 h后检测荧光素酶活性。活动是相对于野生型构造来表示的。结果是来自四个独立实验的副本的平均值±S.E。
在我们观察到蜗牛表达细胞含有低水平的细胞周期蛋白D后，我们想评估它们是否可以成为蜗牛转录抑制的直接靶点。虽然我们发现细胞周期蛋白D1与模拟转染细胞相比，表达蜗牛的细胞中的mRNA水平较低周期素D2抗原被强烈下调(). 因为周期素D2抗原发起人包含两个蜗牛绑定电子盒子共识(Mauhin等人，1993年)在小鼠、大鼠和人类中保存的(Bouchard等人，1999年)，我们分析了蜗牛对周期素D2抗原转录。我们表达了老鼠蜗牛人的cDNA和报告结构周期素D2抗原角质形成细胞系MCA3D中的启动子，以前用于研究近端E-钙粘蛋白发起人(Cano等人，2000年). 蜗牛抑制了野生型启动子的活性周期素D2抗原至～55%的活性()但不影响携带突变或缺失远端E-box（位于-1600）的启动子结构。当近端E-box（位于–1400）突变或缺失时，报告者活性显著降低（降至～40%）。由于当远端盒完好无损时，这种构建体对Snail不敏感，因此需要两种电子盒来介导抑制。紧邻其3′的近端盒和序列对启动子活性至关重要，因为-1303 D2-Luc缺失导致活性降低10倍(). 当使用人类蜗牛cDNA构建物时，也获得了类似的结果（数据未显示）。因此，蜗牛可以抑制周期素D2抗原上皮细胞中的启动子。远端盒（-1600）需要近端E-box（-1400）的存在来抑制，而包含近端盒的-1400和-1300之间的区域充当增强子。
蜗牛与小鼠胚胎中的细胞周期
看到蜗牛被压抑了周期素D2抗原在培养细胞中表达，我们开始确定在胚胎发育过程中是否会发生同样的情况。因此，我们比较了细胞周期蛋白D1和D2类使用的蜗牛8.5天受精后小鼠胚胎(). 在这个发展阶段，蜗牛在经历EMT的区域中表达，如消化前神经嵴和原始条纹(Nieto等人，1992年;Smith等人1992;Sefton等人，1998年)中胚层衍生物，包括去致密体节和尿囊().周期素D2抗原在神经板中很容易检测到高水平的转录物()和神经管()，而他们不在蜗牛-表达区域()，表明它们的表达模式存在明显的负相关。细胞周期蛋白D1也在神经管中表达()在高水平蜗牛尿囊等抄本(). 然而，细胞周期蛋白D1在以下区域观察到转录物：蜗牛仅适度表达，包括去致密体节(). 因此，我们的数据与蜗牛对周期素D2抗原转录，与Northern对两者的分析结果一致细胞周期蛋白D1和D2类和那些周期素D2抗原上皮细胞中的启动子活性。
两者之间存在反向相关性周期素D2抗原和蜗牛在小鼠胚胎中的表达。8.5-dpc小鼠胚胎的整体原位杂交(一–C类)以及在后脑水平采集的同一胚胎的横向石蜡切片(D类–F类)，后备箱(G公司–我)还有尿囊(J型–L（左）).蜗牛在神经板边缘可以观察到表达(D类，pnc），其对应于经历EMT的前增殖嵴细胞。蜗牛分层后嵴细胞保持表达(G公司，nc），在去致密体节中也很明显(G公司，s）和尿囊内(J型，al）。之间的反向相关性蜗牛和周期素D2抗原在所分析的所有组织中都可以很容易地观察到转录物（参见。D、 G、J和F、 I、L). (K（K）)虽然这种相关性并不显著蜗牛和细胞周期蛋白D1，请注意细胞周期蛋白D1在高水平的蜗牛尿囊等抄本。（al）尿囊炎；（hb）后脑；（nc）神经嵴；（np）神经板；神经管；（pnc）前消化神经嵴；（s） 索米特。
蜗牛表达细胞的细胞周期进展受损不仅是由于持续下调周期素D2抗原转录，也可以改变G1/S检查点的其他成分的表达。事实上，蜗牛的表达与G0/G1细胞比例的增加有关(). 为了评估体内是否发生了类似的变化，我们比较了蜗牛在小鼠胚胎中表达BrdU掺入，以可视化周期S期细胞(). 与细胞培养的数据一致，在胚胎中蜗牛表达时，细胞核积累BrdU的比例要低得多。一般来说，可以看出蜗牛BrdU在胚胎中的表达和掺入(). 总的来说，随着BrdU公司的增加，蜗牛表达减少(，参见A和B[沿尿囊的近轴]、C和D[通过前脑的断面]）。我们还分析了组蛋白H3的磷酸化，以量化正在进行有丝分裂的细胞(Prigent和Dimitrov 2003)在8.5-dpc小鼠胚胎发育中的神经系统中。我们在神经上皮的心室表面观察到高水平的磷酸化H3，在那里细胞核进行有丝分裂(). 当量化时，在头部和躯干水平，在蜗牛-表达区域与位于中间或腹侧区域的相似区域相比。这些结果表明蜗牛-在培养物和胚胎中，很难找到进行DNA合成或有丝分裂的表达细胞。
增殖与蜗牛在小鼠胚胎中的表达。胚胎一和B类显示以下各项之间的并排比较蜗牛表达和BrdU掺入作为培养中整个胚胎细胞增殖的测量。观察到一个整体互补模式，可以在前脑水平的切片中更好地进行检查(C、 D类)和尿囊的底部(E、 F类).G公司和H（H）在主干级别显示要比较的部分蜗牛组蛋白H3磷酸化的表达，作为细胞有丝分裂的衡量标准。方块标记了蜗牛-神经上皮表达区。（a） 羊膜；（al）尿囊炎；（fb）前脑；（h） 心脏；（hb）后脑。
蜗牛对血清耗竭诱导的细胞死亡具有抵抗力
在肝细胞的几项研究中(Valdés等人，2002年)和癌细胞向恶性转化(Thiery 2002年;Siegel和Massague，2003年)间充质表型的转变与细胞凋亡敏感性降低有关。因为蜗牛在MDCK细胞中诱导完全EMT(Batlle等人，2000年;Cano等人，2000年)，伴有肿瘤恶性(Blanco等人，2002年;Sugimachi等人，2003年)在接受EMT的肝细胞中诱导(Spagnoli等人，2000年;Valdés等人，2002年)，我们测试了蜗牛是否能抵抗细胞死亡。两种主要途径可引起细胞凋亡，即由发育线索或细胞内损伤（γ射线照射、细胞因子剥夺等）触发的应激途径，以及由细胞外信号介导的死亡受体（如TNF家族的受体）的激活，其中包括TNF-α、Fas配体和Trail。
为了分析细胞应激反应，将细胞保存在无血清状态。MDCK-钉子细胞存活至少7天，而模拟转染细胞在血清剥夺2–3天后出现大量细胞死亡(). 在培养48小时后，用碘化丙啶标记显示，尽管模拟转染子有10.3±0.1%的阳性细胞核，但只有3.8±0.2%的Snail表达细胞的细胞核被标记。Caspase-3参与细胞死亡反应，在模拟转染细胞中的活性是相应蜗牛表达细胞的三倍().
蜗牛对血清剥夺诱导的细胞凋亡具有抵抗力。(一)血清耗尽48小时后，通过碘化丙啶染色评估细胞活力。(B类)去除血清后不同时间的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性表示为用重复培养皿进行的三个独立实验的平均值±S.E。请注意蜗牛-与mock转染细胞相比，血清剥夺后48h表达细胞。(C类)使用尼罗兰硫酸盐染色观察细胞死亡，并与蜗牛8.5-dpc小鼠胚胎头部的表达。尼罗河蓝硫酸盐（NBS）染色（星形）评估的细胞死亡模式与蜗牛（括号）。与之杂交的类似胚胎克罗克斯-20指出前菱形体（pr）3和5在后脑中的相对位置，以帮助比较细胞死亡模式和蜗牛表达式。在高功率照片中，可以更好地评估反向相关性。（fb）前脑；（h） 心脏；中脑；（sc）脊髓前部。
为了检查蜗牛是否对发育线索诱导的死亡产生抵抗力，我们将细胞死亡模式与蜗牛小鼠胚胎中的表达(). 虽然已经在雏鸡后脑发育中的菱形体（r）2、3和5中发现了明确的细胞死亡模式(Graham等人，1996;Ellies等人，2000年)，鼠标中的情况不太清楚(Trainor等人，2002年). 通过与已知的克罗克斯-20在这个发育阶段的假定菱形体（pr）3和5中()在pr2、3、5和6（NBS；). 相反，pr4和脊髓前部是细胞死亡不明显的区域，与蜗牛表达式(，高倍率）。缺少蜗牛在中脑和前脑以及中枢神经系统以外的其他组织（如发育中的心脏）中，也可以明显地看到其他细胞强烈死亡区域的表达(). 相反，头部的间充质组织，包括迁移的神经嵴细胞，显示出高水平的蜗牛转录本和无细胞死亡。总之，细胞死亡与蜗牛分析的胚胎中存在表达().
鉴于蜗牛表达细胞对血清耗竭具有抵抗力，我们研究了这些细胞中不同生存途径的活性。MAPK和PI3K通路在蜗牛表达细胞中高度活跃(). 与较高水平的PI3K活性一致，我们还发现其下游效应器Akt的磷酸化程度更高(). MEK/Erk和PI3-K/Akt通路均可介导Bcl-x的上调L（左）表达式(Ramljak等人，2003年)，Bcl-2家族的一个死亡抑制成员，阻止应激诱导的线粒体细胞色素c释放。因此，我们观察了Bcl-x的表达L（左）MDCK-Snail细胞中，发现其在分析的所有时间都在增加(). 这些数据表明，MEK/Erk和PI3-K/Akt通路的激活可能解释了与蜗牛血清耗竭后的表达。
蜗牛激活生存路径。在无血清培养的细胞中分析不同存活途径的分子，并在不同时间收集。活性ERK水平（phospho-erk1和phosphoy-erk2；一)，活动Akt(B类)和Bcl-xL（左）(C类)通过Western blot分析，发现蜗牛表达细胞中的表达增加。使用总erk2作为凝胶负载的对照。(B类)通过薄层色谱分析，在蜗牛表达细胞中也检测到较高水平的PI3K活性，与Akt的较高磷酸化水平相一致。
蜗牛对TNF-α诱导的细胞死亡具有保护作用
因为蜗牛的表达能够抵抗应激诱导的细胞死亡，所以我们检查了蜗牛表达细胞是否也能够抵抗激活死亡受体途径（如TNF-α）的促凋亡信号诱导的细胞凋亡。事实上，虽然模拟转染的MDCK细胞在治疗后24小时内死亡，但MDCK钉子细胞存活了下来(). Caspase-8在配体结合后被特异性招募到死亡受体，然后被自动激活启动凋亡途径。因此，我们发现用TNF-α治疗可诱导模拟转染细胞中caspase-8的激活。与模拟转染剂相比，在处理24小时后，在蜗牛表达细胞中观察到caspase-8活性下降了约五倍。这一结果证实了MDCK细胞中观察到的死亡是由该通路的激活介导的(). 正如预期的那样，在这两种细胞类型中，启动子caspase-8的活性与效应子caspase3的活性相关()证实蜗牛的表达可保护MDCK细胞免受TNF-α诱导的死亡。
蜗牛对TNF-α诱导的细胞死亡具有抵抗力。在用环己酰亚胺（0.5μg/mL，30 min）预处理后，用TNF-α（5 ng/mL）处理Mock和MDCK-Snail表达细胞，以阻止存活蛋白NFκB的诱导。(一)治疗16或24小时后拍摄的培养物照片。(B、 C类)死亡受体特异性caspase-8和效应caspase-3的活性分别来自一个代表性实验。请注意蜗牛表达细胞中两种半胱天冬酶的活性均较低，这解释了一.
鼻涕虫在小鸡体内的行为就像蜗牛在老鼠体内的行为
我们之前证明了蜗牛家族成员Slug在鸡胚中诱导EMT(Nieto等人，1994年)一般来说，这两个家族成员的表达模式在鸟类和哺乳动物的EMT位点互换(Sefton等人，1998年). 事实上，神经管中经历EMT的细胞和原始条纹表达蜗牛在鼠标和鼻塞在小鸡身上。然而，当蜗牛在鸡胚后脑中外源性表达时，它可以诱导EMT(Del Barrio和Nieto 2002年)表明这两种蛋白在胚胎发育过程中功能相当。然而，尽管它们在功能上是等效的，但在每个相应的胚胎中只有一个基因表达，因此，蜗牛不能在控制小鸡神经管中的细胞分裂或存活中发挥作用，因为它没有在那里表达。因此，这种功能等效性和表达模式的显著互换性使我们分析了在鸡体内表达的家族成员Slug是否能够调节神经管中的细胞周期进展和存活。
为了分析细胞周期，我们测量了鸡胚中BrdU掺入和磷酸化H3的表达，就像我们对小鼠所做的那样。我们观察到神经管上皮基底半部的细胞增殖水平较高，细胞核在此进行DNA合成。相反，如前所述(Burstyn-Cohen和Kalcheim，2002年)，神经管背侧的结合水平远低于上皮体节水平(). 有趣的是，背神经管被前消化神经嵴占据，它表达高水平的鼻塞成绩单(). 对BrdU阳性细胞的定量分析表明，周期S期的细胞比例大约是鼻塞-表达区域与相似大小的非表达区域相比（未显示数据）。当我们量化沿着神经管背腹轴含有磷-H3的细胞时，我们发现鼻塞-表达区，阳性细胞仅为邻近区域阳性细胞的～15%（数据未显示）。因此，就细胞周期而言，鼻塞-鸡胚发育中神经管中的表达细胞表现为蜗牛-在小鼠胚胎中表达细胞以及类似的细胞，很难找到正在进行DNA合成或有丝分裂的细胞。
Slug的表达与小鸡的少量增殖相关，并保护发育中的神经管免受生理细胞死亡的影响。(一)在卵泡内对BrdU掺入进行横截面分析。图中显示了11级鸡胚躯干的一个这样的部分。(B类)与鼻塞探查。注意，前消化神经嵴中缺少BrdU，显示高水平的鼻塞表达式。(C、 D类)NBS和TUNEL染色分别评估12期鸡胚后脑区的细胞死亡模式。比较细胞死亡模式（蓝色和棕色恒星C、 D类)使用的鼻塞成绩单(E类). 如前所述，r4显示很少凋亡细胞，与高水平的鼻塞成绩单（括号）。(F类–H（H）)用含有鸡鼻涕和GFP公司第8阶段的cDNA，15小时后分析（第12阶段）。(F类)GFP（因此，鼻塞)在神经管右侧和从神经管移出的细胞中观察到表达(G公司)同一胚胎的NBS染色显示，此处的细胞死亡显著减少鼻塞过度表达。(H（H）)更高识别度的图片，可以更好地评估保护免受细胞死亡的区域。虚线划定了神经管和耳泡的边界。黑星表示胚胎两侧对称的外胚层细胞死亡区域（见正文）。（hb）后脑；中脑；（nc）神经嵴；神经管；（v）耳泡，体节。
如前所述，已经详细分析了鸡胚后脑的细胞死亡(Ellies等人，2000年)，来自r3和r5的神经嵴细胞的细胞死亡对鳃区的模式形成至关重要(Graham等人，1996;Ellies等人，2002年;Trainor等人，2002年). 我们通过TUNEL和NBS染色对细胞死亡进行了仔细分析，并将数据与鼻塞。我们发现，r4在细胞死亡中具有天然保护作用，表达了更高水平的鼻塞转录本比相邻的菱形体(). 这个结果让人想起了有关细胞死亡和蜗牛小鼠胚胎的表达（参见).
利用鸡胚对实验操作的适应性，我们进一步研究了Slug通过在卵的神经管中过表达来促进细胞存活的作用。通过将Slug和GFP编码载体共同电穿孔到发育中的神经管右侧，可以实现GFP（和Slug，数据未显示）的高水平表达(). 观察到几股电穿孔神经嵴细胞从后脑迁移过来(). 同一胚胎的NBS染色显示，Slug过度表达的区域显著减少了自然发生的细胞死亡(). 在53%的电穿孔胚胎中可以观察到细胞死亡的挽救(n个=30），表明Slug可以在鸡胚后脑中起到生存因子的作用。值得注意的是，不同菱形体中自然发生的细胞死亡数量与死亡诱导剂BMP表达的平衡相关吗(Graham等人，1994年)和生存因子Slug。事实上，r4表达了高水平的鼻塞和极低水平的骨形态发生蛋白4这种平衡也解释了为什么在我们的过度表达实验中r2细胞死亡（两种细胞的水平都很低骨形态发生蛋白4和鼻塞)Slug的过度表达比r5（表达非常高的骨形态发生蛋白4; 数据未显示）。
尽管有些迁徙鼻塞-表达细胞通过靠近耳泡的地方，耳泡是由黑星所指示的死亡细胞是非电穿孔的外胚层细胞（根据部分评估，数据未显示）。这些结果突出了电穿孔细胞中这种拯救的特异性，并证实了Slug对发育中胚胎的细胞死亡具有抵抗力。
材料和方法
细胞系和抗体
犬MDCK（Madin-Darby犬肾）和小鼠表皮角质形成细胞MCA3D细胞分别在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和Ham的F12培养基中培养。使用以下抗体：针对细胞周期蛋白D1、D2和D3、cdk4、p21、p27、Erk2和Bcl-x的多克隆抗血清（Santa Cruz Biotechnology）、抗磷酸Akt（New England Biolabs）和磷酸组蛋白-3（Upstate Biotechnology）；单克隆p21/Cip1和视网膜母细胞瘤蛋白（Pharmingen BD Biosciences）和抗MAPK（p44/p42；细胞信号技术）抗体。作为二级抗体，使用了过氧化物酶偶联物（抗鼠和抗兔）（Bio-Rad实验室）和生物素化抗兔血清（载体）。
胚胎
小鼠胚胎是从卡哈尔研究所动物设施的Balb-C小鼠自然交配中获得的。受精鸡蛋取自西班牙科尔多瓦的Granja Santa Isabel。小鼠胚胎的年龄确定为生后天数（dpc），检测到阴道堵塞的日期指定为0.5 dpc。根据汉堡包和汉密尔顿的说法，孵化并打开鸡蛋，并对胚胎进行分级(1951).
通过BrdU掺入和磷酸组蛋白-3免疫组化分析细胞增殖
为了测量加入5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）的百分比，细胞在DMEM加10%FCS的盖玻片上生长。在不同时间加入BrdU（在PBS中为10μM），并在加入后1小时根据检测试剂盒II（Roche）对细胞进行固定和染色。使用Leica DMR显微镜观察并量化含有BrdU的细胞。为了进行卵内标记，将PBS中含有固绿（0.25μL/mL）的BrdU（10 mM）注射到鸡胚中，然后处死。小鼠胚胎在DMEM加10%FCS中以8.5 dpc的速度解剖，保持胚胎外膜完整。立即将BrdU（10 mM）注入羊膜腔内，将胚胎培养1 h。将其在4°C的4%多聚甲醛中固定过夜，通过一系列乙醇脱水，然后再水化。对于鸡胚，在固定、脱水和复水后，在15μm石蜡切片上进行免疫组织化学（Fibrowax，BDH）。用HistoClear去除石蜡后，鸡胚切片再水化，并按照制造商的说明处理鸡胚切片和小鼠胚胎，以形成BrdU掺入（Roche）。
有丝分裂的细胞通过磷酸-雌酮-3的存在进行鉴定(Prigent和Dimitrov 2003)取小鼠和鸡胚50μm振动切片。切片在4°C下用PBT（PBS，0.5%Triton X-100）孵育过夜，然后用0.1%H处理2O（运行）2在室温下保持4小时。清洗后，在4°C下用10%FCS和1 mg/mL BSA在PBT中封闭3 h。在4°C下用初级和次级（生物素化）抗体孵育过夜。清洗后，用ABC试剂盒（Pierce）冲洗切片。
流式细胞术分析DNA含量
用胰蛋白酶从培养皿中分离细胞，在70%乙醇（-20°C）中固定1分钟，并在37°C下用RNA酶（1 mg/mL）处理15分钟。碘化丙啶染色后（0.05 mg/mL，PBS中，室温黑暗条件下15分钟），在FACS流式细胞仪（Becton-Dickinson）中评估细胞DNA含量。对于计算机分析，只考虑单个细胞的信号（10000个细胞/分析）。
蛋白质印迹和免疫沉淀分析
用冷PBS洗涤后，将细胞从平板上刮下，并在4°C下在以下缓冲液中裂解：20 mM pH 7.4的Tris-HCl、10 mM EDTA、100 mM NaCl、1%Triton X-100、1 mM NaF、100 mMβ-甘油磷酸、1 mM EGTA、5 mM NaPPi、5μg/mL亮蛋白肽、1 mM邻钒酸钠和1 mM PMSF。蛋白质通过SDS-PAGE在12%或7.5%（对于视网膜母细胞瘤蛋白质）上分离，并转移到PVDF膜（Millipore）中，然后将其封闭在含有5%脱脂奶粉的TTBS（TBS加0.05%吐温-20）中。在室温下，将膜与相应的一级抗体在封闭溶液中孵育2小时。清洗后，在室温（1:3000）下将其与过氧化物酶结合的抗鼠或抗兔免疫球蛋白孵育1小时。ECL（Amersham Biosciences）观察抗体结合。
对于检测p21和p27水平的免疫沉淀分析，如上所述对细胞进行裂解并纯化蛋白质。将等量的总蛋白（400μg）与1μg适当抗体（p21/Cip1或p27/Kip1）和蛋白A-琼脂糖珠（Sigma）在4°C下孵育3 h，用裂解缓冲液洗涤两次珠，离心，用SDS-PAGE分离，并按上述进行免疫印迹分析。
RT-PCR分析和引物序列
聚乙烯（A）+使用Microfast Track分离试剂盒（Invitrogen）从MDCK细胞中分离mRNA，并在cDNA合成前用DNAse I处理。如前所述进行逆转录(Sefton等人，1998年)和PCR扩增犬细胞周期蛋白D1和D2的编码片段，使用如下引物在55°C的退火温度下进行35个周期。对于细胞周期蛋白D1，使用来自小鼠序列的引物：正向，5′-CTGGCGAAGTGGACCAT CCG-3′；相反，5′-GTCCGTGTCACTACTTGATGAC-3′（小鼠特异性引物）。对于Cyclin D2，使用简并引物：正向，5′-GAA/GCAA/GC/AGITAT/CT/CTIC CICAA/GTG-3′；背面为5′-GAA/GTACATIGCA/GAAT/CTTA/GAAA/GTC-3′。扩增片段在pGEMT中亚克隆并测序。测序后，设计狗特异性引物，按照类似的扩增方案，对片段进行亚克隆、测序，并用于Northern blot分析。
北方斑点
按照Chomczynski和Sacchi的描述分离总RNA(1987). 在每次分析中，每条通道使用20μg变性RNA。如上所述，通过RT-PCR获得的犬细胞周期蛋白D1和D2的编码片段使用Rediprime II试剂盒（Amersham Biosciences）进行标记。使用人GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）探针作为RNA数量的对照。
瞬时转染和启动子分析
要分析周期素D2抗原启动子、小鼠表皮角质形成细胞MCA3D细胞与40 ng Renilla载体和400 ng pGL3载体（Promega）共转染，其中包含周期素D2抗原启动子与荧光素酶报告基因融合，分别与pZeo（Invitrogen）和pcDNA3（Invit罗gen）载体中的25ng人SNAI1或鼠蜗牛完整编码序列融合。用空质粒（Mock）进行对照转染。使用Lipofectamine（生命技术）进行转染。使用双荧光素酶报告系统试剂盒（Promega）检测荧光素素酶和Renilla活性，并将活性标准化为与对照载体共转染的启动子的活性。Brad H.Nelson善意地提供了人类D2-Luc（1624个碱基对）和缺失–1303 D2-Luc和–444 D2-Luc(Martino等人，2001年). D2-Luc（-1624）被用于删除和突变人类体内的两个电子盒周期素D2抗原带有Quickchange位点定向突变试剂盒（Stratagene）的启动子。核心序列5′-GC公司人类两个电子盒子中含有的ACGTGC-3′周期素D2抗原启动子独立突变为5′-TT公司ACGTGC-3′。这两个点突变（GC到TT）消除了E-box，并显示去抑制近端小鼠E-cadherin启动子(Cano等人，2000年).
原位杂交
如前所述，在鸡胚和小鼠胚胎的几个发育阶段进行了整体原位杂交(Nieto等人，1996年). 利用小鼠全长cDNA合成地高辛标记探针蜗牛和小鸡鼻塞.鼠标探针细胞周期蛋白D1和D2类由小鼠上皮细胞系NMuMG获得的cDNA合成，并使用上述引物和条件通过RT-PCR扩增。杂交后，用碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体孵育胚胎。碱性磷酸酶活性通过与NBT/BCIP底物（罗氏）培养检测。杂交后，将胚胎固定在PBS中4%的多聚甲醛中，清洗并在徕卡M10解剖镜下拍摄整个胚胎。随后，将小鼠胚胎包埋在石蜡（Fibrowax）中，在15μm处进行切片，并使用徕卡DMR显微镜进行拍照。
细胞系和胚胎的细胞死亡分析
细胞生长在6cm细胞培养皿中的盖玻片上，并在室温黑暗条件下用碘化丙啶（0.05 mg/mL）在PBS中染色15分钟。只有膜通透性改变的细胞被染色，并且可以使用徕卡DMR显微镜进行观察。
为了分析胚胎中的凋亡，使用TUNEL原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）或通过标记死亡细胞的硫酸尼罗兰（NBS；Sigma）染色检测DNA片段。为了进行TUNEL检测，将整个胚胎固定在4°C的PBT中的4%多聚甲醛中，脱水并在室温下在100%甲醇和1%h中处理2 h2O（运行）2，并在甲醇中洗涤多次。复水后，在室温下用蛋白酶K（10μg/mL，持续3分钟）消化胚胎，清洗并在4%多聚甲醛中固定30分钟。在多次清洗后，用反应混合物在37°C下处理2 h，清洗，用封闭溶液（KTBT 0.1%Triton X-100，15%FCS，0.7%Roche封闭粉末）封闭2 h，并用POD转换器培养（37°C时1 h）。胚胎在黑暗中用含0.03%H的DAB（3,3′-二氨基联苯胺，Sigma）发育2O（运行）2清洗后，对胚胎进行拍照，并将其嵌入0.5%明胶（Sigma）中，然后在震动器上以40μm的深度切片。解剖后立即对整个胚胎进行NBS染色。胚胎在含有0.1%吐温20的NBS（PBS中20μg/mL）中在室温下孵育30分钟，在PBS中短暂清洗，然后立即在4%PFA中拍照。
caspase-3和caspase-8活性分析
收集附着在培养皿上的细胞和上清液中的细胞，并在4°C下在pH 8.0、20 mM EDTA和0.5%Triton X-100的5 mM Tris-HCl中溶解。以Ac-DEVD-AMC和Ac-IETD-AFC为底物，分别测定caspase-3和caspase-8的酶活性(Herrera等人，2001年). 在发光分光光度计（Perkin-Elmer LS-50）中进行分析。半胱天冬酶活性单位被定义为在2小时内产生1个任意发光单位所需的活性酶量。细胞裂解物的蛋白质浓度用Bio-Rad分析试剂盒测定，结果以每μg蛋白质的半胱天酶活性单位表示。
PI3-激酶活性
在含有亮氨酸肽（10μg/mL）、抑肽酶（10μg/mL）和1 mM PMSF的裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、50 mM NaCl、30 mM NaPPi、50 mM-NaF、100μM邻钒酸钠、1%Triton X-100，pH 7.6）中溶解细胞后，通过离心澄清裂解产物，用单克隆抗酪氨酸磷酸抗体（Py72）免疫沉淀蛋白质。免疫沉淀物用于通过磷脂酰肌醇的体外磷酸化来分析PI3-激酶活性，如所述(Valdés等人，2004年).
鸡胚电穿孔
卵子内电穿孔基本上按照所述进行(Del Barrio和Nieto 2002年)经以下修改：pCX-EGFP构建物（1 mg/mL；Ikawa等人，1995年)与含有全长鸡Slug cDNA的pCX-Slug（1.5 mg/mL）或与空pCX载体共同电穿孔作为对照。将DNA在卵中注射到第8阶段的鸡后脑中，并使用两个50毫秒的10V脉冲进行电穿孔。胚胎被允许再发育14-16小时。在所有实验中，对照侧位于左侧。在卵子中拍摄胚胎以记录GFP的表达，并进行凋亡分析。
