PKHD1, the Polycystic Kidney and Hepatic Disease 1 Gene, Encodes a Novel Large Protein Containing Multiple Immunoglobulin-Like Plexin-Transcription–Factor Domains and Parallel Beta-Helix 1 Repeats

Luiz F. Onuchic; Laszlo Furu; Yasuyuki Nagasawa; Xiaoying Hou; Thomas Eggermann; Zhiyong Ren; Carsten Bergmann; Jan Senderek; Ernie Esquivel; Raoul Zeltner; Sabine Rudnik-Schöneborn; Michael Mrug; William Sweeney; Ellis D. Avner; Klaus Zerres; Lisa M. Guay-Woodford; Stefan Somlo; Gregory G. Germino

doi:10.1086/340448

美国人类遗传学杂志。2002年5月；70(5): 1305–1317.

2002年3月15日在线发布。数字对象标识：10.1086/340448

预防性维修识别码：项目经理447605

PMID：11898128

PKHD1、，多囊肾和肝病1基因编码一种新的大蛋白，包含多个免疫球蛋白样Plexin转录因子域和平行β-螺旋1重复序列

路易斯·奥努奇,^1,3 拉兹洛·富鲁,^4,^* 长泽靖国神社,^1,^* 侯晓英,⁶ 托马斯·艾格曼,⁸ 任志勇,⁶ 卡斯滕·伯格曼,⁸ 扬·森德雷克,⁸ 厄尼·埃斯基维尔,⁴ 拉乌尔·泽特纳,⁴ 萨宾·鲁德尼克·施奈本,⁸ 迈克尔·姆鲁格,⁶ 威廉·斯威尼,⁹ 埃利斯·D·阿夫纳,⁹ 克劳斯·泽雷斯,⁸ 丽莎·瓜伊·伍德福德,^6,7 斯特凡·索姆洛,^4,5和格雷戈里·杰米诺^{1, 2}

路易斯·奥努奇

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拉兹洛·富鲁

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长泽靖国神社

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侯晓英

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托马斯·艾格曼

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任志勇

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卡斯滕·伯格曼

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扬·森德雷克

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厄尼·埃斯基维尔

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拉乌尔·泽特纳

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萨宾·鲁德尼克·施奈本

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迈克尔·姆鲁格

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威廉·斯威尼

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埃利斯·D·阿夫纳

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克劳斯·泽雷斯

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丽莎·瓜伊·伍德福德

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斯特凡·索姆洛

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格雷戈里·杰米诺

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摘要

常染色体隐性遗传性多囊肾病（ARPKD）是一种严重的多囊肾病，主要出现在婴儿和儿童期，其特征是肾脏增大和先天性肝纤维化。我们已经确定PKHD1、，ARPKD基因突变。PKHD1系列延伸超过⩾469kb，主要在人类胎儿和成人肾脏中表达，并包括至少86个外显子，这些外显子可变地组装成许多选择性剪接的转录物。最长的连续开放阅读框编码一个4074氨基酸蛋白，即聚ductin，预计在其羧基末端附近有一个跨膜（TM）跨域，免疫球蛋白样的丛转录因子域，在其氨基末端有平行的β-螺旋1重复。一些转录本编码缺失TM的截断产物，如果翻译可能会被隐藏。这个PKHD1系列-基因产物是一类新的蛋白质，与肝细胞生长因子受体和丛蛋白具有相同的结构特征，属于调控细胞增殖、细胞粘附和排斥的蛋白质超家族。

介绍

常染色体隐性遗传多囊肾病（ARPKD[MIM263200])是一种影响肾脏和胆道的遗传性严重多囊肾病，估计其发病率为1/20000活产（Zerres等人。1998). 临床谱变化很大，大多数病例出现在婴儿期（Guay-Woodford1996). 人类胎儿的典型表型特征包括肾脏增大和回声，以及继发于尿量不足的羊水过少（Reuss等人。1990). 多达50%的受影响新生儿在出生后不久死亡，原因是严重的肺发育不全和继发性呼吸功能不全。那些在围产期幸存下来的人表现出广泛可变的疾病表型。在围产期存活的亚组中，发病率和死亡率主要与严重的系统性高血压、肾功能不全和门脉纤维化所致的门脉高压有关（Zerres等人。1996).

单个基因座的突变，PKHD1系列(第页溶囊的k个艾德尼和小时埃及的d日疾病1)负责所有典型形式的ARPKD。在之前的研究中，我们绘制了PKHD1系列至6p21.1-p12（Zerres等人。1994; Guay-Woodford等人。1995). 随后，我们构建了一系列物理和遗传图谱，以细化PKHD1系列至～1 cM的候选区域，由D6S1714和D6S1024分别作为端粒和着丝粒侧翼标记（Lens等人。1997; Mucher等人。1998; Park等人。1999). 最近的重组图谱研究进一步将区间缩小至834 kb，KIAA0057（CA）28作为新的着丝粒边界（Onuchic等人。，出版中).

在本研究中，我们描述了PKHD1、，一个新基因编码在至少86个外显子中，以复杂的选择性剪接变异体模式组装。预测的翻译产物是与参与调节细胞增殖和细胞粘附和排斥的蛋白质超家族具有同源性的新蛋白质。

患者、材料和方法

患者和样本

本研究中使用的患者数据库来自伯明翰阿拉巴马大学和德国亚琛Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule。诊断标准与其他地方报告的标准相同（Zerres等人。1998). 所研究的患者组具有代表整个ARPKD临床谱的临床特征。在ARPKD患者及其家人的知情同意下，招募了谱系，并采集了血液样本。在获得知情同意后，还获得了40名个人的对照DNA，并从Coriell细胞库购买了另外20份对照DNA样本。如其他地方所述提取DNA（Eggermann等人。1993).

转录图

数据库搜索包括对非重复序列、桑格（参见人类序列数据网站），TIGR（参见老虎数据库网站），塞莱拉（公共领域），以及GenBank概述网站。基因预测算法FGenesh（参见核苷酸序列分析网站）（萨拉莫夫和索洛维耶夫2000)和GENSCAN公司（布尔塞特和吉戈1996; 伯格和卡林1997)用于注释可用的基因组序列。以人成年肾mRNA为模板，通过RT-PCR在假定的剪接连接处确认表达的序列，通过使用一组多组织cDNA样品作为模板的PCR扩增（Origene）和通过使用人多组织印迹的northern印迹分析（Clontech）确认表达的序列。

PKHD1系列cDNA分离

大部分PKHD1系列以人成体肾脏双链cDNA（Marathon Ready cDNA，Clontech）为模板扩增cDNA产物。第二组产物通过RT-PCR产生，使用20 ng成人肾脏mRNA（Clontech）或1.5–4.0μg成人肾脏总RNA作为模板。总RNA用Trizol试剂（Invitrogen）提取，并用随机六聚体引物和上标逆转录酶（Gibco BRL）逆转录。第三组cDNA产物通过1:20稀释的寡核苷酸引物人类成人肾脏cDNA文库（Gibco/BRL）进行扩增。根据制造商的说明（Clontech）进行5′RACE和3′RACE实验。用于扩增cDNA产物集的引物序列如所示表A1，在中附录.

突变检测

该程序设计了侧翼单个外显子并从内含子-外显子连接处偏移约20 bp的PCR引物底漆3并用于从患者和对照组中扩增20 ng基因组DNA。在外显子>400 bp的情况下，设计了几个重叠引物，以确保扩增子的大小保持在<500 bp。所使用的所有引物序列均在表A2，在中附录通过转基因波高变性高效液相色谱系统（DHPLC）（转基因）进行突变检测。PCR产物在98°C下变性4分钟，然后再退火；将8–12 ml每个扩增子注入柱中，并用线性乙腈梯度洗脱，流速为0.9 ml/min。流动相由缓冲液a（0.1 M三乙基乙酸铵和1 mM EDTA）和B（0.25%乙腈溶于0.1 M三甲基乙酸铵）的混合物组成。根据Wavemaker 3.3版（以及随后的4.1版）（Transgenomic）系统控制软件确定每个扩增子的缓冲梯度。该软件还确定了成功拆分杂双体所需的最佳变性温度。如果DHPLC剖面的分辨率不够，则使用第二个温度（通常高于或低于第一个温度2°C）来提高分辨率。在两个方向上对显示出对照组中不存在的洗脱作用改变的样品进行测序，并通过目视检查和对电泳结果的比较来确定序列变化。当扩增子改变了对照组和患者DNA的洗脱特性时，在两个样本中对其进行测序，以在序列水平上确认其身份。

序列分析和蛋白质建模

通过BLAST2对已确认的表达序列和区间基因组序列进行比对，建立基因组结构和基因定向（参见爆破网站）。序列同源性由BLASTP/N/X程序鉴定（参见爆破网站）。智能(秒简单米模数一建筑第页研究t吨ool（Schultz等人。1998; Letunic等人。2002)和PROSITE（参见ExPASy分子生物学服务器网站）用于识别结构域结构和蛋白质基序。所有分析均使用默认参数进行。

Northern Blot分析

用克隆的基因片段作为模板扩增探针。PCR产物经凝胶纯化[³²P] -用多质点方法标记，并与人类成人和人类胎儿MTN印迹杂交（Clontech）。用ExpressHyb（Clontech）在68°C或42°C下用基于甲酰胺的缓冲液进行杂交，并在严格的条件下进行清洗（68°C，1小时，在0.1 SSC，0.1%SDS中）。图像由荧光成像仪（分子动力学）获得。

结果

最小区间的转录图

我们使用数据库搜索、cDNA文库筛选、基因结构预测程序的基因组序列注释、RT-PCR和northern印迹分析，组装了最小间隔的转录图谱。共有35组非重叠的基因、cDNA克隆、EST和RT-PCR产物被映射到关键区域(图1一). 基因KIAA0057号机组（Onuchic等人。1999),FLJ10466型（Onuchic等人。，出版中),MCM3型（Hofmann等人。2000),白介素17（Rouvier等人。1993)、和ML-1型（川口等人。2001)其他地方也有描述。这些基因中的每一个都被排除在候选基因之外PKHD1系列或者，根据其已知功能，被视为不太可能的候选人。

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图1

家蚕的染色体定位和基因组组织PKHD1.A、，染色体6p12的示意图。最左边是目前已知的基因(斜体字)，STS/多态标记位于右侧。定义最小值的最接近的侧翼遗传标记PKHD1系列显示间隔(黑体). 文本中描述的35组重叠表达序列并未全部显示。B、，基因组组织PKHD1。通过数字识别的外显子已被证明是PKHD1系列抄本。字母表示属于其中一个的外显子hCT1642763型或hCT1646988型我们的分析还没有证实这一点。黑色钻石(♦) 标识，在hCT1642763型和hCT1646988，边界与本研究中使用的外显子不同的重叠外显子。箭头表示基因单元6和基因单元442L12文本中描述的成绩单。C、，桑格中心对涵盖间隔的BAC和PAC进行测序。

具有肾脏表达的转录物优先作为突变分析的靶点。一个这样的转录物，一个新的1.82-kb表达序列，基因单元442L12，通过基因结构预测程序进行鉴定，并通过RT-PCR从肾mRNA中确认，该mRNA定位于关键间隔远端的BAC 442L12(图1B类和C类). 第二个1.03 kb的新转录本(基因单元6)，最初通过类似方法识别，并映射到BACs 771D21和374E4(图1B类和C类)随后发现，其部分外显子（尽管不是全部）与两个转录本都相同hCT1642763型（Venter等人。2001)和一个人类EST(BF822430型)来源于肾脏肿瘤库；基因单元6在UniGene集群Mm.25855中似乎有一个小鼠同源基因，由从肾脏和肝脏库中获得的EST组成。

这个PKHD1系列转录本和基因组组织

假定的表达序列在PKHD1系列通过DHPLC筛选20名无关的受累患者和20名正常对照组（见下文），他们对该区域的突变进行了系统分析。事实上，同时，我们发现基因单元6和基因单元442L12，两个明显无关的表达序列，仅在我们患者的样本中出现，而在对照组的样本中没有出现。到那时为止，在该地区分析的数百个扩增子中，没有一个提供了受影响个体特有的变异模式。我们对另外40个对照个体进行了分析，以确认这两种变异均不存在于120条控制染色体中。随后以肾脏mRNA为模板的RT-PCR研究证实基因单元6和基因单元442L12是同一基因的一部分。我们接着确定了完整转录物的结构及其基因组组织。

Northern印迹分析(图2)建议PKHD1系列转录本的长度比最初由基因单元6和基因单元442L12抄本。我们使用基于PCR的方法，将引物战略性地定位在基因单元6和基因单元442L12确定最长开放阅读帧（ORF）的顺序PKHD1、，阐明其基因组结构并确定外显子组装的复杂模式。以人肾RNA、成人肾cDNA文库和成人肾双链cDNA为模板(图3). 为了建立全长基因的复合序列，需要大量的引物组合和末端克隆扩增，以及5′RACE和3′RACE反应(图A1在中附录). 一个成人肾脏cDNA文库、人类肾脏mRNA和总RNA以及双链cDNA作为这些研究的模板。所有外显子和剪接连接的序列都是通过PCR产物的双链测序和与区间的公开基因组序列进行比较来确定的(图3).

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图2

PKHD1表达谱。A、，成人多组织northern印迹PKHD1系列外显子59：第1通道，胰腺；车道2，肾脏；3道，骨骼肌；4号车道，肝脏；5巷，肺；6巷，胎盘；泳道7，大脑；8号跑道，心脏。B、，与面板中的螺栓相同A、，用探测PKD1。箭头指示已知拼接变体的位置PKD1.C、，人胎儿多组织northern杂交PKHD1：巷，1，肾；泳道2，肝脏；3巷，肺；第四车道，大脑。D、，与面板中的螺栓相同C、，用探测PKD1。

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图3

全长结构PKHD1系列及其剪接变体。A、，一组71个非重叠外显子，跨越PKHD1系列(上排)和15个使用不同剪接位点的额外重叠外显子(灰色框，下一行). 外显子不存在于编码最长ORF的cDNA中，由阴影框表示。指出了重要蛋白质结构域的位置。B、，用于扩增各种cDNA的每个引物集的大致位置，以及具有代表性的扩增产物集(在每个模式下). 白框表示相应转录本中的非编码外显子，而灰框表示具有可选边界的外显子(一). 每个扩增所用的模板如下：引物集1-4、6和8的人类成人肾脏双链cDNA；引物集5和7的人肾脏mRNA和总RNA；引物组9的人成年肾脏cDNA文库。“SC”表示终止密码子的大致位置，“ORF”表示开放阅读框延伸至整个片段长度。C、，通过RT-PCR/cDNA扩增鉴定的最长ORF。该ORF是面板产品2.1和4.1的组合序列B类共包含67个外显子。

这些研究严格证实了基因单元6和基因单元442L12是同一基因的一部分，但它们也产生了一些意料之外的结果。我们发现了hCT1646988型（Venter等人。2001)之前报道为独立基因，实际上是PKHD1。然而，无论使用何种方法，我们都未能成功连接hCT1646988型至PKHD1系列成绩单。我们遇到了类似的问题hCT1642763，由于RT-PCR、cDNA扩增和5′RACE不能证实外显子1-3的存在PKHD1系列成绩单。然而，这些相同的方法确实在假定的5′端鉴定了两个以前未知的外显子PKHD1、，其中一个包含预测的翻译起始点。我们还发现了公共数据库中可用序列中的少量错误。虽然大多数都相对较小，但预计其中一个会改变蛋白质的阅读框架。我们已经通过确定几个模板中两条DNA链的序列，验证了我们的序列对相关区域的准确性。

这些数据表明PKHD1系列跨越基因组序列的⩾469kb，如果未经验证的5′和3′外显子hCT1642763型和hCT1646988，分别包含643kb。这些结果还表明PKHD1系列位于侧面遗传标记D6S1714的远端⩾74-kb(图1)这就解释了为什么我们在这个标记和疾病表型之间发现了如此少的减数分裂重组。我们确定的外显子总数PKHD1系列成绩单是86(图3B类). 这可能是一个保守的估计，因为很可能其中至少有一些未经验证的外显子hCT1642763型（外显子1-3、9、19、23、32和33），hCT1646988型如果使用来自合适组织的mRNA或cDNA作为模板，则最终将通过实验确认（外显子9-11）或EST数据库或计算机算法预测的结果。

在我们试图组装一个完整的cDNA的过程中，我们鉴定了大量不同的转录物，这些转录物具有独特的PKHD1系列外显子。典型示例如所示图3B。差异拼接产物的绝对数量几乎肯定会更高，因为我们没有对每个引物组合进行详尽的分析。在许多情况下，在克隆和测序后，发现PCR反应似乎产生一个单一扩增产物，包括大小几乎相同的多个差异拼接产物。我们相信，这些数据为northern blot分析中缺乏离散信息提供了一个可能的分子解释PKHD1系列-基因片段(图2).

突变分析

我们通过使用DHPLC对包含最长潜在ORF的67个外显子进行突变检测（图。（图3三和和44和中的表A2附录). 我们将患者组扩大到25人（50条疾病染色体），将对照组扩大到60人（120条染色体）。我们的大多数突变检测工作都集中在那些我们有家庭资料能够确认等位基因分离的个体上。患者来自不同的民族，临床疾病种类齐全(表1). 在所有可以建立分离的情况下，突变等位基因都位于不同的染色体上(图4一). 在每个个体中筛选了至少67个外显子（最长的ORF），在所有病例中都发现了0、1或2个假定的致病性变体。我们在50条疾病染色体中的21条（42%）中发现了潜在致病性变体；这些被定义为DHPLC在患者中检测到的变异，并通过测序确认，而DHPLC在120条控制染色体中未观察到任何变异。这些突变的发现确立了该基因为PKHD1系列(表1).

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图4

PKHD1系列研究了家族中的突变。A、，典型的家庭隔离分析PKHD1系列患者AL 1、AL 11、AL 36、AL 48、AL 52和340/1395的突变（参见表1). 每个系谱图的右侧显示了显示每个家族中包含各自变体的扩增子的野生型和突变序列的序列电泳图。标记为“突变”的痕迹显示基因组PCR产物中的杂合性改变。所研究的每个家族都显示了突变等位基因的分离（用“Ex”表示，后跟外显子编号）。AL 1有两个错义变化，而AL 11、AL 36和AL 48各有一个错义和移码突变。患者340/1395有两个移码突变。AL52和她的兄弟姐妹是血亲结合的产物，Ex32突变为纯合子（标记为AL52）。Ex32标记为“突变体”的痕迹来自杂合子父亲。黑色符号表示受影响的个体；白色符号表示未受影响的个体。B、，PKHD1家族中几个序列变体的代表性DHPLC配置文件（参见面板一和表1). 黑色痕迹表示控制剖面；红色轨迹表示患者的变异轮廓（红色轨迹向上移动以便于比较）。

表1

中的突变PKHD1系列

患者（ARPKD表型）和核苷酸（ORF）变化^一	外显子^b条	识别变体的父级	国家
AL 1（晚发）：
107C→T（T36M）	三	父亲	美国
664A→G（I222V）	9	母亲
AL 11（围产期发病）：
3761_3762 delCCinsG（A1254Xfs1302）	32	父亲	美国
3364G→A（G1122S）	29	母亲
AL 18（晚发）：
8829_8830英寸C（I2944Xfs2949）	58	父亲	南非语（南非荷兰语）
664A→G（I222V）	9	母亲
AL 36（围产期发病）：
8870T→C（I2957T）	58	父亲	美国
5895_5896英寸A（L1966Xfs1969）	36	母亲
AL 45（晚发）：
4870C→T（R1624W）	32	父亲	沙特阿拉伯
AL 47（晚发）：
2279G→A（R760H）	22	父亲	沙特阿拉伯
4870C→T（R1624W）	32	母亲
AL 48（晚发）：
5895_5896英寸A（L1966Xfs1969）	36	父亲	美国
757T→C（F253L）	11	母亲
AL 52（晚发）：^c（c）
4870C→T（R1624W）	32	父亲	沙特阿拉伯
4870C→T（R1624W）	32	母亲
376/1559（围产期发病）：
1620_1621insAGTT（E541Xfs556）	18	父亲	德国
9415G→T（D3139Y）	59	母亲
340/1395（围产期发病）：
711_714delAATG（S237Xfs244）	11	父亲	大不列颠联合王国
5895_5896英寸A（L1966Xfs1969）	36	母亲
306/1272（未知）：
10075delG（G3359Xfs3399）	61	母亲	土耳其
291/1207（晚发）：
3306德尔特（Y1102X）	29	母亲	土耳其

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^一核苷酸和密码子数基于最长ORF的预测67倍转录本(图3C类；另请参见附录中的图A1和图A2）。序列变化描述的术语来自序列变化描述术语网站。在120条控制染色体中没有发现这些变异。

^b条基于71个外显子图3答：。

^c（c）血缘结合。

在我们发现突变的21条疾病染色体中，有12条发生了8种不同的非保守错义变化。其中，9415G→T（D3139Y）对应于基因单元442L12，和107C→T（T36M）对应于基因单元6；其余9条疾病染色体由6种不同的移码突变构成。一个人，340/1395(表1和图4)，在两个等位基因中都有移码突变。这个人也许是我们已经确定的最清楚的证据PKHD1。这一发现也与以下概念最为一致：PKHD1系列通过功能丧失机制导致疾病。一个移码变体5895_5896insA发生在三个无关个体（AL36、AL48和340/1395）中。两个错义变异体也再次出现：变异体664A→G（I222V）见于两名未知亲属且具有不同民族血统的个体；另一方面，变异体4870C→T（R1624W）在一个已知血缘的家族和来自同一地理区域的另外两个个体中被鉴定。该变异可能代表该人群中的创始等位基因。除了血亲家庭外，所有其他个体都是复合杂合突变，其中两种变体都已被鉴定。在只发现一个或没有发现突变的个体中，应用的DHPLC突变筛查可能无法检测到第二个（或其中一个）变体。

的表达式特征PKHD1系列

将商业化获得的成人和胎儿多组织northern印迹与两种不同的探针（外显子59和外显子66-70；图3一)，以确定PKHD1。这两个探针检测到的涂片不是单一的离散信息，而是介于～8.5 kb到～13 kb之间的涂片(图2). 在人类胎儿和成人肾脏样本中观察到最高水平的表达，这与该基因在肾脏发育和功能中的作用一致。在成人标本中，观察到峰值信号为两条弥散带，分别为～9 kb和～12 kb。在人类胎儿肾脏中，转录物的大小分布似乎更低、更均匀。PKHD1系列也存在于胰腺中，但水平要低得多。PKHD1系列在人类胎儿和成人肝脏中几乎检测不到。其余组织样本没有可见信号。然而，考虑到转录物的扩散信号，我们不能排除其他器官中的低水平表达。当相同的印迹与识别人类第43–46外显子的探针杂交时PKD1中，产生了大小正确的离散的高分子量条带，排除了样品中高分子量mRNA的非特异性降解，以此作为解释PKHD1系列northern杂交结果。

PKHD1产物：一种具有多个免疫球蛋白样Plexin转录因子（IPT）结构域（SMART登录号SM0429）和平行β-螺旋1（PbH1）重复序列（SMART-登录号SM0710）的膜锚定蛋白

从肾脏cDNA中实验扩增出的合成cDNA，作为两个重叠片段，产生了最长的连续ORF(图3B类)，长12.6kb，包括67个外显子，预计编码4074个氨基酸的蛋白质(图A2在中附录). SMART预测，这种我们命名为“polyductin”的新蛋白是一种完整的膜蛋白，具有3858个氨基酸胞外氨基末端、一个跨膜结构域和一个短羧基末端(图5).

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图5

聚乙烯和相关蛋白质的结构。多个相互重复的IPT域是该组的常见特征。Polyductin-M具有HGFR和丛蛋白A3的一般结构，具有长的胞外结构域、单个TM结构域和短的细胞质羧基末端，而Polyductin-S更像D86。

BLASTP（参见爆破网站）的分析显示，polyductin与小鼠蛋白D86的同源性最高。同源区开始于两个分子的氨基末端附近，并延伸至D86的大部分全长（1944个氨基酸）。D86的功能尚不清楚，但在GenBank中，它被描述为一种由淋巴细胞分泌的新蛋白（参见GenBank概述网站）。两个表达序列KIAA1412和TM蛋白2（登录号AAF21348[参见序列变化描述术语网站]），编码未知功能的相同新蛋白质（Nagase等人。2000; Scott等人。2000).

多导蛋白的几个短片段与其他功能已知的蛋白质具有弱同源性，包括肝细胞生长因子受体（HGFR[登录号P08581]）和几个丛蛋白。使用SMART，我们确定这些序列编码IPT域。已确定了几种含IPT的蛋白质的结构（Cramer等人。1997)，但其功能仍然未知。IPT结构域由免疫球蛋白样折叠组成，含有IPT结构域的蛋白质通常属于两类中的一类：细胞内DNA转录因子（Rel家族）或单程细胞表面受体，它们是蛋白质Sema超家族的成员（即HGFR、Ron和丛蛋白大家族）。虽然Rel家族的所有成员都有一个参与DNA结合的IPT单元，但实际上所有受体蛋白都包含多个IPT结构域，通常是串联的。拓扑预测表明，polyductin在其胞外段中包含六个IPT结构域(图5). 聚乙烯和受体分子之间的总体相似性，如HGFR和丛蛋白A3（登录号P51805[参见序列变化描述术语网站]）建议对聚乙烯使用类似的功能。然而，结构上的差异表明聚乙烯是独特的。Polyductin缺乏Sema结构域（SMART登录号SM0630）和plexin/semaphorin/整合素（PSI）结构域（SMART登录编号SM0423），这是Sema超家族所有其他成员共有的。它还缺少(一)存在于HGFR中的细胞内激酶结构域，以及(b条)丛蛋白亚类中存在其他保守的细胞质序列。

SMART分析确定了polyductin中的第二个基序，该基序可能提供额外的功能线索。该项目显示，在最后一个IPT域和TM域之间的三个组中，至少有9个（可能还有10个）PbH1重复序列(图5). PbH1重复序列最常见于多糖酶，在这一酶类中，细菌多糖酶是研究最广泛的。这些细菌酶是植物病原体的重要毒力因子，因为它们允许细菌降解植物细胞壁多糖。PbH1重复序列对酶的功能至关重要，形成配体结合和催化位点。聚乙烯中存在多个PbH1结构域表明，聚乙烯可能具有类似的催化性能。

PROSITE程序的基序分析确定了多个潜在的N-糖基化位点和一个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）结构域。该基序存在于纤维连接蛋白和许多其他蛋白质中，在这些蛋白质中已被证明在细胞粘附中发挥作用。此外，在细胞质羧基末端发现了三个假定的cAMP/cGMP磷酸化位点。在这个细胞质尾部中没有发现酪氨酸磷酸化共有位点，这进一步区分了多导蛋白和丛蛋白家族成员。

最后，我们研究了各种剪接安排如何影响蛋白质结构。事实上，如果一些选择性剪接产物也被翻译，那么基因产物被预测为两大类：一类包括最长的连续ORF，但也可能包括缺少一些中间结构域的分子，具有单个TM元素，并且可能与质膜（polyductin-M）相关；另一组缺乏TM结构域，因此其成员可能被分泌（polyductin-S）(图5).

讨论

我们在这里报道了一个新基因的初步描述和特征，PKHD1、，牵涉到所有典型的ARPKD形式。多种证据强烈支持该基因突变在ARPKD中发挥的致病作用。首先，该候选基因的基因组结构延伸到了关键基因的近50%PKHD1系列由重组映射定义的区间。仅此项观察就提供了一个较高的先验概率，即该基因是疾病易感位点。其次，该基因主要在肾脏中表达，肾脏是一个与该疾病相关的器官。第三，我们已经确定了大量的蛋白突变和错义变异体，它们只在受影响的个体中发现，而在大量的对照组中没有发现。对于我们已经确定了两个突变的个体，我们已经表明突变发生在不同的单倍型上，并且它们与疾病染色体分离。在任何情况下，我们都没有发现一个人有两个以上的假定致病性变体。

使用的患者资料包括严重的围产期疾病和轻度、迟发性疾病表型(表1). 有限的样本量留下了关于基因型-表型相关性的任何结论，但它确实允许一些初步假设。在两种突变均被确认的个体中，唯一一个具有两个链终止突变的个体（即个体340/1395）具有严重表型。两个等位基因均发生错义突变的三个个体（即个体AL 1、AL 47和AL 52）具有迟发表型。在同时存在链终止移码突变和错义突变的5名个体中，2名具有迟发表型，3名具有严重表型；没有人拥有相同的错义等位基因。可能并非所有错义变体在功能上都是等价的，有些可能导致等位基因形态低下，从而导致临床症状较轻。基因型-表型相关性的扩展研究应该澄清这一点。鉴于复杂的剪接模式和多个转录本，鉴定致病突变是鉴定转录本中存在的外显子对PKHD1系列在肾脏和肝脏。目前的分析表明，外显子3、9、11、18、22、29、32、36、58、59和61（最长ORF中的67个外显子中）对正常的多导蛋白功能至关重要。这些数据还突显出，缺乏证据表明突变在基因的任何一个区域或假定蛋白质的任何功能域中聚集。

这个PKHD1系列基因及其翻译产物具有几个值得特别注意的独特特征。首先，基因组大小为469 kb，PKHD1系列是迄今为止最大的人类基因之一。其次，该基因编码一系列复杂而广泛的剪接变体，这些变体是通过RT-PCR和cDNA克隆发现的，并通过northern blot分析证实的。我们排除了在northern blots上观察到的扩散信号是由RNA降解引起的可能性，因为存在完整的14-kbPKD1系列相同印迹上的转录本。此外，公共数据库中发现的、肾脏mRNA的RT-PCR显示的、从等分双链cDNA中扩增的以及cDNA文库提供的不同转录物的多样性与northern blot分析的结果密切相关。值得注意的是，几乎所有外显子都显示出一致的供体和受体剪接位点，进一步支持了这些是合法转录物的结论。

观察到的剪接变体的多样性PKHD1系列是哺乳动物基因的一个罕见特征。对小鼠组织的初步研究表明，复杂的剪接模式可能是保守的（Y.N.，未发表的观察结果），表明这一特性具有功能性作用。富含聚A的样品中这些剪接变异体的丰度表明，许多（如果不是全部的话）都经过了充分加工，包括聚A尾巴。目前尚不清楚有多少转录物实际转化为蛋白质。如果大多数mRNA被翻译，这可能意味着这个单一基因可能编码许多不同的多肽。类似的发现也被报道用于神经连接蛋白基因家族（Missler和Sudhof1998). 只有三个基因可以编码超过1000个亚型，通过选择性剪接，这些亚型的大小和氨基酸序列不同。有趣的是，最大基因产物的一般结构与polyductin-M的相似。同样，预计转录子的一个子集包含终止密码子，并产生不含TM区域的分泌蛋白。神经氨酸酶家族蛋白在神经元中表达，在神经元中作为受体发挥作用，对神经细胞识别起重要作用。

如此复杂的剪接模式对推测致病性突变的功能后果的预测提出了重大挑战。对于大多数基因来说，蛋白质截短突变的含义相对容易定义。临界域的丧失通常会导致本构激活或功能丧失。在以下情况下PKHD1、，许多正常的剪接产物预计会产生缺失关键结构域的截短蛋白质，包括TM区和polyductin的细胞质尾部。本文所述的许多突变也预测了类似的结果，但这些突变引起的疾病实际上是对正常多导蛋白功能的生物测定。我们提出了两种可能的解释来调和这些发现。首先，所有观察到的突变都会改变最大ORF的序列。这可能表明正常功能需要临界量的全长蛋白质。另一种可能性是，突变破坏了不同蛋白质产品之间的关键功能化学计量或时间平衡，而这些蛋白质产品通常是通过精心设计、严格调控的剪接模式来维持的。

northern blot分析的数据表明PKHD1系列主要表达于肾脏，与ARPKD中观察到的表型一致。鉴于ARPKD中异常的胆道小管仅占总组织的一小部分，因此在肝脏中检测到的转录表达要低得多，这并非意外。人类胎儿的表达模式PKHD1系列与肾脏和肝脏异常在子宫内发生的观察结果以及疾病发病机制涉及终末上皮分化缺陷的假设一致（Calvet1993). 继续表达PKHD1系列在人体组织中，它的基因产物在成熟的终末分化器官中还有一个不明确的作用。PKHD1系列胰腺中的表达略高于肝脏中的表达。该器官中尚未描述疾病相关表型。这种情况与显性多囊肾病的情况没有什么不同，在小鼠研究的基础上，多囊蛋白基因在胰腺发育中的作用变得明显之前，胰腺囊肿是该疾病未被充分认识的表现（Lu等人。1997; Wu等人。1998). 胰腺囊肿不会导致显性多囊性疾病的临床症状（Nicolau al。2000).

我们认为ORF最长的转录本是PKHD1、，因为它是唯一会被我们描述的所有突变改变的转录本。预测编码的产物polyductin与Ron类酪氨酸激酶受体和丛蛋白超家族都有一些结构特征，因此也可能调节细胞间识别或细胞运动。然而PKHD1系列-基因产物缺乏这些蛋白质类的关键结构元素，这表明其作用机制将与其他类不同。聚乙烯中存在多个PbH1重复序列表明该分子可能在碳水化合物识别和修饰中发挥作用。结合的靶点可能包括存在于细胞表面糖蛋白或基底膜基质中的碳水化合物部分；与聚乙烯的相互作用可能调节细胞-细胞或细胞-基质的附着。一个有趣的可能性是，由一些较短转录物编码的IPT和PbH1域的数量可变，可能会产生对靶因子具有不同特异性或结合亲和力的产物，正如对神经细胞粘附素（Missler和Sudhof）的假设一样1998). 我们目前还无法确定聚乙烯是否主要作为受体、配体或膜相关酶。

聚乙烯具有以前在单个分子中未观察到的独特结构特征组合。第二种蛋白质D86的发现具有非常相似的模式，这表明D86号和PKHD1系列基因座可能是一类新蛋白质的原型。从结构角度来看，D86与多肽的polyductin-S家族最为相似。通过与聚乙烯类似，我们提出可能存在更大的膜相关型D86。D86被描述为分泌蛋白的事实进一步支持了我们的假设，即聚乙烯-S可能具有相同的属性。

我们已经确定了负责ARPKD的基因，并确定它是一个新的、大的和复杂的基因。尽管这种复杂性可能对基于DNA的诊断测试的实施带来一些挑战PKHD1系列应该为上皮分化和器官发生提供重要的生物学见解。此外，这些新见解应有助于建立一个平台，为患有这种往往具有毁灭性疾病的患者制定有针对性的治疗干预措施。

致谢

作者要感谢与这些研究合作的许多家庭及其医疗保健提供者。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01 DK51259和圣保罗环境保护基金会拨款2000/00280-3和德国联邦基金会的支持。我们感谢Gabi Muecher、Jutta Becker和Kirstin Mangasser-Stephan所做的工作

附录

表A1

用于放大的引物对PKHD1系列人肾mRNA和总RNA的cDNA片段、人肾双链cDNA和成人肾cDNA文库(图3)

	底漆(5′→3′)
底漆套件	福沃德	反向
1:
第一道底漆	5′-CCTGTGACCAAAAACCCAAATG-3′	AP1（Clontech）
第二道底漆	5′-ATCCACGTTCCCCCTGCAAG-3′	AP2（Clontech）
2	5′-GAAGGATCATTTCTCCCTTGAGTC-3′	5′-CAGGAACTTGACTCACTCATAGGAAAG-3′
三	5′-TGTCTCCAGGAAGAGATGC-3′	5′-CAGGAACTTGACTCACTCATAGGAAAG-3′
4	5′-GCCAATCAGCATATTACG-3′	5′-TCTCTTAGTTGTCCCAGCAGC-3′
5	5′-GCACACGCACATCCTTTC-3′	5′-CAATATCACTCCAGATGTCC-3′
6:
第一道底漆	5′-TCCTTTTTCTGATGGTGG-3′	AP1（AP1）
第二道底漆	5′-CAACTCCCTTCTTTCCCTATG-3′	AP2（AP2）
7	5′-GATCTTCCATTCTTCAAAGGC-3′	5′-Ggatataaggtctgttaaactc-3′
8:
第一道底漆	5′-ACCAAATGCAGAGAGAGTGG-3′	AP1（AP1）
第二道底漆	5′-CTCTTCAAGGATTCTGGATG-3′	AP2（AP2）
9	5′-CTCTTCAAGGATTCTGGATG-3′	第7天

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表A2

用于放大的引物对PKHD1系列用于突变分析的外显子^[注]

	底漆(5′→3′)
外显子	福沃德	反向
1	5′-TACACATTTTGGCTGGGACAC-3′	5′-GGACAAAGTTGCAAGCACT-3′
2	5′-CAGAACAGCAAAATAATCGTATGT-3′	5′-TCAAGGTAACCTATTTGTTCTTACC-3′
三	5′-ctggtgattctgaggaggt-3′	5′-GCACTGTAAAACCCCAAC-3′
4	5′-TGACAATTCTATGCAGCCTGA-3′	5′-GGCAATTGAATCACAGAAAA-3′
5	5′-GCTAGCTTGGGAATTCATG-3′	5′-GACACGCTGGCTCATTTACA-3′
6	5′-GTCTGAGAAAGGCTTGTGC-3′	5′-TTTTCAAAACAGCATCAAAGAAGA-3′
7	5′-CATTGAGTTTGAGTAAGTCCATTA-3′	5′-AGCAATTCTGTGCCAACTGC-3′
8	5′-TTCATAGCCATGTTTCCTCTGA-3′	5′-TGGTGAGTGGGGAGAAAG-3′
9	5′-TTTTTGCTTTCTACTTCCTGGTT-3′	5′-ACAGAGAAAAAATGGATAACTT-3′
10	5′-CCCAGAAGACTCGTGCAGAT-3′	5′-TCAAGGAGTTATATGGGTCTCA-3′
11	5′-TTCAGCGAGCCAAAAA-3′	5′-TCATCAAGAAAATGGCCAAAA-3′
12	5′-TCATATTCTGTCTATTTGGAAGC-3′	5′-tggtctcaaccaaacaatga-3′
13	5′-TGTATACCACACACACAACACATACA-3′	5′-ACCAGGGCTCACTGAGTA-3′
14	5′-tctggtcatctttcaccttg-3′	5′-CCTGGAAATCTTGATACCTTCC-3′
15	5′-CAGTGATTCAGGCCTTGGTT-3′	5′-CTTCATGGGTATGGGACTGG-3′
16	5′-ATGCCTGGAAGCTTGCATAGT-3′	5′-TCAGTGCTCCTGCTACATGG-3′
17	5′-TTGGAGGAGAATGTCCTG-3′	5′-CACTCCCCTCCCTCATTT-3′
18	5′-GAGAACTGGGGGTGGTCTT-3′	5′-GGAAAATGGGATTGTTCA-3′
19	5′-cgggggttttcttaagtgage-3′	5′-CTACCCACCTGACCAGAAG-3′
20	5′-GGATGTGACTCCCACTACG-3′	5′-AATCCTCCCCAGCTGACTGAA-3′
21	5′-TAACCGGAGGACTGCAAG-3′	5′-CCCCTAGCAGGAAAGTTTGA-3′
22	5′-ACTGGGATTTTCCACACAGC-3′	5′-CTCAAGGCAACAGCATTC-3′
23	5′-CCCCAACCAGACGTTAATA-3′	5′-GAATTGTTGCAACCCAATC-3′
24	5′-ggatgaactctgtaaggtgga-3′	5′-TCCATGCCACTAGAGGATA-3′
25	5′-TTCGGTTCCATGACAGAAATTT-3′	5′-ACTGGAGCTTGCACTTAGG-3′
26	5′-TGGAAAAGAAAATTTTGCCTCA-3′	5′-GGCCTCTAAAAATCACTGC-3′
27	5′-TCTCCTTTAAGATGGTGACATCAA-3′	5′-TATGGAATTCATACAGAGA-3′
28	5′-TTGTCTGCCTGTATGGTTGG-3′	5′-CAGTGGTCACTCACCAGA-3′
29	5′-TGGAGTTCTCTTCCCTTAAGTCAG-3′	5′-TGCCCTTTTATAGACCAATG-3′
30	5′-CCCCACATGTCAGAGGCTAT-3′	5′-AGCTGAATGCTAGACAATCAAA-3′
31	5′-TGGCTCTTCTGGCTTACTTT-3′	5′-AACAAAATCTGAATATCCAGCAAA-3′
32个	5′-GGACTTCCACAGGTGCTATGA-3′	5′-TCCTTGCATGGCAGTGACTA-3′
32亿	5′-GGCAGCAACACCAGTAGTCA-3′	5′-ACCGCAACTGACCTCCTTCT-3′
32美分	5′-GCAGTGATGCCTCGGATAAT-3′	5′-GTGTGGCTAACCTCTGACC-3′
32天	5′-GGGGAATTGACTCTTTCA-3′	5′-CGTGGTGTTCTGTCCTCA-3′
第32页	5′-CGTCAGTCTATATTGACCAGCAG-3′	5′-CAATTCATTACAAAGAGAGTGC-3′
33	5′-TGGGTAGGAGGAGCAAATG-3′	5′-TGTGGCATCTTTACTCACCATC-3′
34	5′-GGTCAAAAGGAGGACACAGGA-3′	5′-CCCGAGAATGGAAAACAT-3′
35	5′-AGCTAATGGCTTTGCAATGAT-3′	5′-TCGCTGCCATTTTGGACTAA-3′
36	5′-CCAACCAGCTCTCTGTT-3′	5′-cagaagttccctcctcca-3′
37	5′-CAAAACGGTAAGCCTTATCC-3′	5′-TTTTCCACTGCTAGACAGCTC-3′
39	5′-AAATATTCTGGACACTTTTCC-3′	5′-AGACCACAATACAAATGTCCA-3′
40	5′-TTTTGGAGTGATGCCTCAGTTCT-3′	5′-GCAATGCACATCATCAGAC-3′
41	5′-CATGCTTTAGGTTCTCTGACTT-3′	5′-TGCCTTAAAACATGGAGAAAA-3′
42	5′-CAACAGAATCTCAGGAGCCATA-3′	5′-TTGGGGAGAATTCATTGA-3′
43	5′-TGCAGCATCTCTCTTGTTTTCC-3′	5′-ATTTGCCATCAGGCTTGTC-3′
44	5′-TGAAAATGCATTATGGAACTCTGA-3′	5′-TGCATTTTATGTGGACCCAAT-3′
45	5′-CACAGCACCTTATCATACATGG-3′	5′-AATGCCCCAAAGTCTCTCAT-3′
46	5′-TTGGCTTTAATTTCATGTTTCA-3′	5′-GGGCAAGTCAATCCATTTTA-3′
47	5′-AACAAGCCTCAGACCTTTG-3′	5′-GGCCCAGACACATGTAATTTT-3′
48	5′-TCCAGTTTTCTTATTTGCTTTCA-3′	5′-tggcctattattatcatctgttc-3′
49	5′-TTGCTATTGTGCCATTG-3′	5′-CCATCGGAGCATAAAGT-3′
50	5′-TGCAATTGATGAAGAGAGAAGAATG-3′	5′-TCAACCCATATCAAAAGA-3′
51	5′-AGGGTGTGTGGTGAGTAG-3′	5′-tggaattgaaggggtgattgg-3′
52	5′-CACATGCAAGTTGGCTTT-3′	5′-CTGGAGGACATTCTGCCATA-3′
53	5′-GAATTGGAAGTTATCACAATGGA-3′	5′-gggttcagcctgtctgtgtgt-3′
54	5′-TGGGAGACCAAGAATAA-3′	5′-GCACCTGCTTGATGATACC-3′
55	5′-TGCAATTTTCTCCCTCTCTTTC-3′	5′-TTGCCTAAAAGGGTGTTTGG-3′
56	5′-CACAACAGCCTCTGTGAATA-3′	5′-TCAAGCAGAAGCAACCTAAACA-3′
57	5′-TTCTCTGGTGGATGATGTTGG-3′	5′-TCCCCAGCTAGGTTACCAA-3′
58	5′-GGGTCCCCAGCTATT-3′	5′-CAGTTGGGATTTCTGGGTGT-3′
第59页	5′-GCCATTCTTCAGCCTTTGT-3′	5′-CCATGGAGGTGTCCTT-3′
59b个	5′-TTGGGTTCTGACACAGC-3′	5′-GACGGAATTTGTGGAGCAG-3′
59美分	5′-GCTCCAAAAAATTCCGTCAA-3′	5′-TGGACAGCACTACC-3′
60	5′-TTCGATATTTGTGGCTGGTG-3′	5′-TGTTAGGTGTGAAGAATTGC-3′
61	5′-CAATGTATTTCTTCTTGCTGCTT-3′	5′-TCAGTGAGCACAGCAAAACC-3′
65年	5′-GATGATGGCAAGAGTGATGG-3′	5′-GGCTCTGGAGCTCATGGTAG-3′
65亿	5′-AGAGCCCCCACGTCTTCTTA-3′	5′-TCCATGAGAGGCCTACG-3′
65摄氏度	5′-CCTGGCCATGAAGAGACCT-3′	5′-AATCAGCCCTCATTTGGATG-3′
66	5′-GAACACAGGCAAATGCAAA-3′	5′-GGCTGAATGCTACTACTC-3′
67	5′-TTTTCTTCCTCCCTCCTCCT-3′	5′-GGAGTTTTCTCCCCAATATTGA-3′
68	5′-TTGCCAAAATGTCTGCCTTC-3′	5′-CATGTGCTCTTTCTTCTCAAGC-3′
69	5′-GCATCTTATAACATACATTGAAACA-3′	5′-GTCTTGGGGAAAAGAAAACAA-3′
70	5′-TGCTGGTCCACTTACA-3′	5′-GGGGCTAAAACCAATTGC-3′
71	5′-AAACCATTTTCTTCCCCTATTTC-3′	5′-ccctgatcacagttctcct-3′

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注：-外显子<500 bp的引物定位在两侧的内含子序列中，以便分析剪接连接。较大的外显子被评估为一组包含侧翼内含子序列的重叠片段。

图A1

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PKHD1系列编码最长潜在阅读帧的cDNA序列。彩色碱基确定外显子-外显子边界：蓝色表示上游外显子的最后一个碱基；红，下游外显子的第一碱基；绿色，翻译起始站点；粉红色，终止密码子。

图A2

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由最长ORF编码的聚乙烯的氨基酸序列PKHD1。蓝色表示IPT领域；绿色，PbH1重复；红色，TM域；黄色，RGD域。

在证明中添加注释-

自本文提交以来，另一个小组报告了类似的发现（Ward等人。2002). 在该出版物中PKHD1系列-所描述的基因产物在大小和序列上与polyductin基本相同，并被命名为“纤维素酶。”

电子数据库信息

本文中数据的访问号码和URL如下：

爆炸，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast网站/

塞莱拉，http://public.celera.com/cds/login.cfm

ExPASy分子生物学服务器，http://ca.expasy.org/

GenBank概述，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/Genbank概述.html（用于所有86个外显子的序列和ORF最长的复合cDNA[登录号AF480064]）

GENSCAN公司，http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/genscan.html

人类序列数据，http://www.sanger.ac.uk/HGP/sequence网站/

序列变化描述术语，http://www.dmd.nl/mutnomon.html（对于PbH1重复序列[登录号SM0710]、Sema域、PSI域、IPT域、KIAA1412和TM蛋白2[登录号AAF21348]、HGFR[登录号PO8581]和丛蛋白A3[登录号P51805]）

核苷酸序列分析，http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gf.shtml（对于FGenesh算法）。

人类孟德尔在线遗传（OMIM），网址：http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/（用于ARPKD[MIM 263200]）

底漆3，http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

智能，http://smart.embl-heidelberg.de/（对于PbH1重复序列[登录号SM0710]、Sema域[登录号SM0630]、PSI域[登录编号SM0423]和IPT域[登录号码SM0429]）

老虎数据库，http://www.tigr.org/tdb网站/

尤尼金，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene网站/

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文章来自美国人类遗传学杂志由以下人员提供美国人类遗传学学会