J癌症 2022; 13(6):1972-1984. doi:10.7150/jca.66830 这个问题 引用
研究论文
METTL3通过COL12A1/MAPK信号通路促进食管鳞癌的进展 李佳丽 1 、李振华 2 、徐燕照 2 、赵煌 2 ，报恩山 1
1.河北医科大学附属第四医院研究中心，河北石家庄，050011，中华人民共和国 2.河北医科大学附属第四医院胸外科，河北石家庄，050011
引用： Li J，Li Z，Xu Y，Huang C，Shan B.METTL3通过COL12A1/MAPK信号通路促进食管鳞癌的肿瘤进展。 J癌症 2022; 13(6):1972-1984. doi:10.7150/jca.66830。 https://www.jcancer.org/v13p1972.htm
复制 其他样式 摘要 背景 食管鳞状细胞癌（ESCC）是世界上最常见的侵袭性肿瘤之一。 m6A修饰在许多生物过程中起着重要作用。 METTL3是主要的甲基转移酶，已在包括ESCC在内的许多癌症中发现。 在这里，我们研究了METTL3在ESCC发展中的潜在机制。
方法 ：采用定量实时PCR（qRT-PCR）、免疫组织化学（IHC）和western blot检测METTL3的表达。 为了评估METTL3、MTS的功能，进行了集落形成、划痕愈合试验、穿孔和侵袭试验。 为了找到METTL3的下游靶点，进行了mRNA测序（mRNA-seq）。 进行GO和KEGG功能富集分析，以预测可能的生物过程和信号通路。 qRT-PCR和western blot检测COL12A1的表达和RAF、MRK和ERK的磷酸化状态 并进行以下增益和损耗实验，以检测METTL3介导的ESCC进展中COL12A1的靶基因功能。
结果 ：使用TCGA数据库，发现食管鳞癌组织中METTL3表达较高。 此外，我们发现与正常组织相比，食管鳞癌患者组织中METTL3显著增加，并且与预后不良相关。 评估METTL3在ESCC细胞系中的表达。 METTL3的增失功能表明其促进细胞增殖、迁移和侵袭。 此外，我们证实METTL3可以促进COL12A1的表达，上调RAF、MER和ERK的磷酸化，而且COL12A可以抑制siMETTL3-介导的对ESCC增殖、迁移和侵袭的抑制。
结论 ：我们的研究表明METTL3可能具有致癌作用，通过COL12A1/MAPK信号通路促进ESCC的进展和转移。
关键词 ：食管鳞癌（ESCC）、METTL3、COL12A1、MAPK、增殖、侵袭
介绍 食管癌是最具侵袭性的肿瘤之一，占全球癌症相关死亡的第六大主要原因[ 1 ]. 食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管癌的主要组织学类型，占世界病例的90%[ 2 ]. 尽管食管鳞状细胞癌的治疗方法（包括手术、放疗和化疗）取得了很大进展，但食管鳞状上皮细胞癌患者的总体5年生存率仍不理想[ 三 ]. 尽管已经进行了大量的研究，但肿瘤发生和远处转移的确切机制仍不清楚。 因此，迫切需要更多的研究来探讨潜在的分子机制，以开发新的ESCC治疗方法[ 4 ]。
N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA中最丰富的调节因子，由m6A甲基转移酶、去甲基化酶和读取器组成[ 5 ]. 近年来，人们对m6A的修饰和功能进行了许多研究，其中发现m6A修饰在mRNA和非编码RNA的剪接过程、稳定性、翻译效率和核保留方面发挥着重要作用[ 6 ， 7 ]. 甲基转移酶样3（METTL3）是主要的RNA甲基转移酶，与其辅助伙伴METTL14和WTAP形成甲基转移酶复合物来催化m6A修饰[ 8 ， 9 ]. 或者，去甲基化酶FTO和ALKBH5从mRNA中移除m6A，以动态调节m6A修饰[ 10 ， 11 ]. 此外，m6A读取器，包括YTH家族蛋白、IGF2BP和eIF3s，可以特异性识别m6A修饰并调节下游mRNA的剪接、运输、翻译、稳定性和其他功能[ 12 ， 13 ]. METTL3是第一个报道的m6A读取器，被确定为甲基化过程中的主要甲基转移酶，并被进一步证明影响许多癌症的发展[ 14 - 17 ]. 然而，很少有研究关注METTL3在ESCC发展中的潜在机制。
在本研究中，我们阐明了METTL3在ESCC中的功能作用。 我们的研究表明，上调的METTL3通过COL12A1/MAPK通路与ESCC的增殖和转移相关，提示METTL 3具有致癌作用，可能是预测ESCC预后的潜在生物标志物。
材料和方法 抗体 兔抗METTL3多克隆抗体（56339）、兔抗MEK1/2多克隆抗体（5605）、兔抗ERK1/2多克隆抗体（5594）和兔抗GAPDH多克隆抗体（2597）购自proteinstech（中国）； 兔抗COL12A1抗体（ab121304）、兔抗RAF单克隆抗体（ab181115）、兔抗RAF单抗（磷酸化S259）单克隆抗体。 小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体（60/11461/81822，Beyotime，中国）购自Beyotime（中国）。
临床标本 食管癌组织及其配对正常组织取自2015年8月至2016年6月在河北医科大学第四医院接受手术的食管癌患者。 后续行动的最后期限是2021年6月。 入选患者根据临床症状、影像学检查和病理诊断被诊断为食管癌，所有患者均完成了年龄、性别、淋巴结转移、远处转移、病理分化、肿瘤分期、肿瘤大小、， TNM分期系统和家族史。 所有患者均未进行术前化疗和放疗。 排除的患者包括其他良性和恶性肿瘤，以及严重的心血管和肾脏疾病。 所有患者在使用临床材料前签署知情同意书。 河北医科大学第四医院伦理委员会已证明本研究使用组织。
细胞培养 食管癌细胞系Eca109、TE1、KYSE30、YES2、EC9706、KYSE170和KYSE150来自Procell Life Science&Technology Co.（中国武汉）。 Eca109、YES2、EC9706、KYSE170和KYSE150在含有10%胎牛血清（FBS；以色列Beit-Haemek生物工业公司）和1%青霉素链霉素（中国索拉比）和5%CO的DMEM培养基（美国GIBCO）中培养 2 在37°C的加湿培养箱中。 TE1和KYSE30细胞在含有10%FBS和1%青霉素-链霉素和5%CO的1640培养基（美国GIBCO）中培养 2 在37°C的加湿培养箱中。
小干扰RNA转染 RiboBio（中国广州）设计并合成了靶向METTL3（siMETTL3-1和siMETTL2）和阴性对照RNA寡核苷酸（siControl）的小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸。 siRNA的序列如下：siMETTL3-1:CAAGTATTCATCATGAA和siMETTL2:GACTGCTCTTCTTAATA。 用核糖FECT将siRNA转染6孔培养皿中30-50%融合的食管癌细胞 TM（TM） CP转染（RiboBio，中国）遵循制造商的说明。 40h后通过qRT-PCR和western blot评估敲除效率。
质粒转染 使用表达质粒（Vigenebio，Shandong）（称为oeMETTL3）进行METTL_3的过度表达，并使用空载体（称为eeVec）作为阴性对照。 将食管癌细胞置于6孔培养皿中，以50-70%的融合率将其转染FuGENE®6转染试剂（美国Promega）。 48小时后，通过qRT-PCR和western blots检测过度表达的效率。
共转染 通过使用表达质粒（Vigenebio，Shandong）（称为oeCOL12A1）进行COL12A1的过表达，并使用空载体（称为oeVec）作为阴性对照。 使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，USA）将6孔培养皿中60-70%融合率的食管癌细胞转染siMETTL3-1，转染时间为6 h，转染后使用FuGENE®6转染试剂（Promega，USA，FBS）转染oeCOL12A1或oeVec，转染24 h。
RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR） 根据制造商的方案，使用RNAiso Plus（日本TaKaRa）从患者组织和细胞中分离出总RNA。 使用MonScript合成cDNA TM（TM） 使用MonAmp对mRNA进行RTⅢ全合一混合（Monad Biotech，中国）和qRT-PCR TM（TM） ChemoHS qPCR Mix（Monad Biotech，中国）基于Step One Plus实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）。 GAPDH被用作内部标准对照。 每个样本重复三次，通过比较Ct值分析数据。 所有PCR引物均购自Sangon Biotech（中国上海），并列于补充表中。
蛋白质印迹 用含有磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液（中国SEVEN）裂解细胞总蛋白。 采集蛋白质提取物，并通过双钦酸（BCA）分析进行定量（中国SEVEN）。 通过12%SDS-PAGE分离蛋白质提取物，并将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，USA）上。 在阻断非特异性蛋白结合后，将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜，分别以1:1000的稀释度使用识别METTL3、RAF、RAF（磷酸化S259）、MEK1/2、ERK1/2、β-肌动蛋白和GAPDH的一级抗体。 使用COL12A1、MEK1/2（磷酸化S221+S221）和ERK1/2（磷化T202+Y204）的一级抗体，浓度分别为0.1μg/ml、0.1μg/ml和0.075μg/ml。 然后用过氧化物酶（HRP）结合二级抗体（1:10000，protentech，中国）培养膜。 清洗后，使用化学发光系统检测信号（美国Bio-Rad）。
免疫组织化学（IHC） 通过IHC比较食管癌组织及其配对正常组织中METTL3蛋白的表达。 用二甲苯和100%乙醇处理石蜡切片，然后降低乙醇浓度。 抗原提取后，石蜡切片被阻断，并在4°C下用抗METTL3抗体（56339，protentech，中国）染色过夜。 在37°C下将相应的二级抗体加入切片15分钟后，进行DAB（ZSGB-Bio，中国）染色、苏木精复染和脱水。 根据先前报道的评分方法评估免疫组织化学染色[ 18 ]. 评分结合了污渍区域和强度的表示。 简言之，分数是阳性细胞百分比（0，小于25%阳性细胞；1，26-50%阳性细胞；2，51-75%阳性细胞；3，大于75%阳性细胞）和染色强度（0，阴性；1，弱；2，中等；3，强）的总和。 0到2之间的总和为负数； 3分和6分为阳性。 三位经验丰富的病理学家，他们不知道临床数据，同时审查了幻灯片。
细胞增殖和集落形成试验 为了进行细胞增殖试验，将转染细胞以每孔2000个细胞的密度接种到96个平板中。 播种后0、24、48、72和96小时，根据制造商的说明，使用cell Titer 96®AQueous One Solution试剂（美国Promega）评估细胞活力。 简单地说，在每个孔中添加20μl MTS溶液，并在37°C下培养平板2 h。使用微孔板阅读器在492 nm处测量吸光度（美国帝肯公司）。 对于集落形成分析，将转染细胞以每孔1000个细胞的密度接种到6孔板中，并在含有10%FBS的DMEM/1640培养基中维持10天。 用甲醇固定后，用0.1%结晶紫染色30分钟，然后对菌落进行成像和计数。
划痕愈合试验 通过伤口愈合试验测定细胞迁移水平。 简言之，5×10 5 细胞（每孔）接种到6孔培养板中。 培养过夜后，用200μl移液管尖端的细端进行划痕（时间0 h）。 再培养24小时的细胞，拍摄照片以估计缝隙的闭合。 测量细胞迁移到划痕区域的相对距离，并计算愈合百分比。 实验重复三次。
Transwell和侵入分析 根据制造商的说明，使用Millicell细胞培养插入物（24孔插入物，8μm孔径，美国康宁公司）进行Transwell和侵入分析。 迁移分析，4×10 4 将200μl无血清培养基中的细胞（每孔）加载到插入物的底部，然后用500μl DMEM/1640培养基填充下层培养箱，并添加10%的FBS。为了进行入侵检测，在加载细胞之前，将Matrigel（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）涂布到插入物中4小时。 在30小时（用于迁移试验）或42小时（用于侵入试验）培养后，将膜下侧的细胞固定并用0.5%结晶紫溶液染色。 在显微镜下对每个孔中的五个随机场进行计数。
mRNA-sequencingassay（mRNA-sq） 使用RNAiso Plus提取并纯化转染siMETTL3-1或siControl KYSE150细胞的总RNA（每组三份）。 然后，按照供应商推荐的方案，在Illumina Novaseq™6000（中国LC-Bio Technology）上同时执行mRNA-seq。 使用gffcompare软件检测转录物组装( http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/gffcompare.shtml ，版本：gffcompare-0.9.8.Linux_x86_64）。 领带和舞会礼服( http://www.bioconductor.org/packages/release/bico/html/ballgown.html )用于评估所有转录物的不同表达。
统计分析 所有统计分析均采用SPSS 21.0软件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）进行。 测量数据表示为Mean±SD，并通过Student t检验进行分析。 采用卡方检验评估表达与临床病理参数的相关性。 采用Kaplan-Meier方法评估患者的总体生存率（OS），并使用对数秩检验比较各组之间的差异。 所有统计检验均为双侧检验，P值小于或等于0.05被认为具有统计学意义。 每个图中至少进行了三个独立的实验。
结果 METTL3在人食管鳞癌组织中上调，并与食管鳞癌患者的预后相关 为了探讨主要m6A-修饰酶在ESCC中的表达，包括METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5、YTHDF1和YTHDF2，我们首先查询了已发表的临床数据集TCGA（the Cancer Genome Atlas），发现METTL3mRNA表达、WTAP表达、， 与正常组织相比，食管鳞癌组织中的YTHDF1和YTHDF2显著增加（图 1 A） ●●●●。 为了进一步验证结果，我们获得了60对ESCC肿瘤组织和邻近正常组织，并用qRT-PCR测定了METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5、YTHDF1和YTHDF2的表达模式。 结果表明，METTL3、WTAP和YTHDF1在食管鳞癌组织中的表达显著高于邻近正常组织（图 1 B） ●●●●。 作为主要的“作者”，METTL3在食管鳞癌患者组织中有显著的高表达，我们在实验中对其进行了研究。 此外，IHC结果显示，与正常组织相比，肿瘤组织中METTL3的表达显著升高（图 1 C） ●●●●。 正如预期的那样，通过western blot，与邻近正常组织相比，具有代表性的食管鳞癌患者组织中METTL3的蛋白水平显著增加（图 1 D） ●●●●。 我们通过qRT-PCR评估了METTL3在七种ESCC细胞系（Eca109、TE1、KYSE30、YES2、EC9706、KYSE170和KYSE150）中的表达（图 1 E） ●●●●。 METTL3在KYSE170和KYSE150细胞系中的相对mRNA表达较高，而在Eca109、TE1和KYSE30细胞系中METTL3mRNA表达较低。 根据mRNA水平，在下一个功能增强和丧失实验中，选择KYSE150和KYSE170细胞株敲除METTL3，选择TE1和KYSE30细胞株上调METTL4，以评估METTL5可能参与的作用。 Kaplan-Meier曲线和log-rank检验表明，METTL3高表达的食管鳞癌患者与METTL4低表达的患者相比，预后较差，生存时间较短（图 1 F） ●●●●。 为了进一步表征METTL3表达与临床特征之间的相关性，根据qRT-PCR结果，根据中值将60例患者分为两组（高：n=30，低：n=300）。 METTL3的高表达与淋巴结浸润和远处转移相关（表 1 ).
图1 METTL3在ESCC患者组织中上调，并与不良预后相关。 （A） 从TCGA数据下载的ESCC组织中评估了参与m6a修饰的催化蛋白，蓝色方框表示正常组织，n=11； 肿瘤组织的红色方框，n=184）** P＜0.01。 （B） 根据GAPDH标准化的qRT-PCR（n=60）证实了参与m6a修饰的催化蛋白在ESCC原发肿瘤样本和邻近正常组织中的相对mRNA表达。 METTL3、WTAP和YTHDF1在食管鳞癌组织中的表达显著高于邻近正常组织* P<0.05，**P<0.01。 （C） 放大200倍后，两个患者组织中METTL3抗体免疫组化染色的代表性图像。 比例尺显示100μm。 （D） western blot检测METTL3蛋白在8对食管鳞癌组织（T）和邻近正常组织（N）中的表达。 METTL3的相对蛋白水平根据β-肌动蛋白进行标准化。 （E） 通过qRT-PCR检测METTL3在ESCC细胞系中的mRNA表达水平。 数据表示为平均值±标准偏差。 （F） 基于METTL3 mRNA表达的60例食管鳞癌患者OS的Kaplan-Meier生存曲线。 所有患者根据METTL3的中位数分为两组。 采用log-rank检验比较差异* P<0.05。
METTL3基因敲除抑制ESCC的增殖和转移能力 为了研究METTL3异常表达是否与ESCC的增殖和转移能力有关，将两种不同的siRNA与对照RNA一起转染KYSE150和KYSE170细胞系（图 2 A） ●●●●。 通过qRT-PCR和western blot检测敲除效率，结果表明siRNA可以有效地敲除KYSE150和KYSE170细胞株中METTL3的表达。 增殖能力用MTS法和集落形成法测定。 正如预期的那样，MTS分析显示METTL3敲除导致细胞增殖显著降低（图 2 B） ●●●●。 菌落形成试验还显示，METTL3的沉默降低了菌落形成效率（图 2 B） ●●●●。 然后进行划痕愈合实验和穿孔实验，检测METTL3缺失是否会影响ESCC的迁移和侵袭能力。 划痕愈合试验表明，与对照组相比，METTL3表达的减弱显著阻碍了ESCC细胞的迁移能力（图 2 C） ●●●●。 相应地，跨阱迁移和基质凝胶侵袭实验证实，ESCC细胞的侵袭能力在METTL3基因敲除后显著受到抑制（图 2 D） ●●●●。
表1 食管鳞癌患者METTL3表达分析的相关性。
METTL3级 特点 n个 低 高 χ 2 P（P） 年龄（岁） <65 29 14 15 0 1 >65 31 16 15 性别 男性 46 24 22 0.093 0.760 女性 14 6 8 淋巴结转移 否定 22 16 6 5.813 0.016 * 积极的 38 14 24 远处转移 否定 39 24 15 4.689 0.030 * 积极的 21 6 15 病理分化 嗯 19 11 8 0.308 0.579 可怜的 41 19 22 肿瘤分期 阶段1,2 25 15 10 1.097 0.295 第3、4阶段 35 15 20 TNM分期系统 T1+T2 24 14 10 0.625 0.429 T3+T4 36 16 20 肿瘤大小（cm） >3个 37 16 21 1.128 0.288 <3 23 14 9 家族史 否定 48 23 25 0.104 0.747 积极的 12 7 5
注：用X平方检验比较METTL3低表达组和高表达组* P<0.05
METTL3的过度表达促进了ESCC的增殖和转移能力 为了进一步证实METTL3的作用，根据其表达模式，选择了两个细胞系，包括TE1和KYSE30进行进一步研究。 用METTL3过表达质粒和对照质粒转染TE1和KYSE30细胞，然后在mRNA和蛋白质水平上证实上调效率（图 三 A） ●●●●。 在MTS分析和集落形成分析中，TE1和KYSE30细胞中METTL3的上调显著增强了它们的增殖能力（图 三 B） ●●●●。 划痕伤口愈合试验表明，METTL3过度表达加速了TE1和KYSE30细胞的迁移和侵袭（图 三 C） ●●●●。 此外，跨阱分析结果表明，METTL3的上调明显增强了ESCC的迁移和入侵能力（图 三 D） ●●●●。
METTL3通过COL12A1/MAPK信号通路促进ESCC增殖和转移 我们之前的实验证明METTL3在ESCC中起肿瘤基因的作用。 随后，使用带有siMETTL3-1的KYSE150细胞对METTL3可能参与的下游靶基因和信号通路进行了深入研究。我们进一步通过mRNA-seq研究了mRNA表达，发现432个上调的mRNA，表明这些mRNA可能受到METTL 3的负调控（图 4 A） ●●●●。 相应地，147个mRNA被下调，表明这些mRNA可能被METTL3正调控（图 4 A） ●●●●。 进行GO和KEGG功能富集分析，以预测可能的生物过程和靶mRNA介导的信号通路（图 4 B、 C）。 GO分析表明，mRNA的异常表达主要与细胞表面、细胞外间隙的正调控和葡萄糖跨膜转运的正调控三个生物学过程有关。 通路分析发现，这些mRNA主要包含在有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联中。 MAPK信号通路包含23个mRNA，富含10种不同的细胞功能，包括甘氨酸和丝氨酸代谢、蛋氨酸代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢（图 4 D） ●●●●。 构建了siMETTL3-1组和siControl组的热图，显示了两组间前30个显著差异表达的基因（图 4 E） ●●●●。 通过查阅文献，30个基因中有11个在图中突出显示 4 E、 据报道参与了肿瘤的发生发展。 然后，我们使用qRT-PCR来选择并确认最显著相关的基因COL12A1，在siMETTL3-1组中其表达降低到28.55%（图 4 F） ●●●●。 此外，有报道称COL12A1通过MAPK途径积极促进胃癌转移[ 19 ]. 为了进一步确认METTL3是否通过COL12A1/RAF/MEK/ERK/MAPK信号通路参与ESCC的进展，通过qRT-PCR评估编码MEK1蛋白的MAP2K1（p<0.01，log2（fc）=-1.00，mRNA-seq建议）（图 4 G） ●●●●。 KYSE150和KYSE170细胞中的METTL3沉默降低了MAP2K1的表达，TE1和KYSE30细胞中METTL3的过表达加速了MAP2K1的表达。 Western blot进一步用于检测COL12A1的表达和MAPK信号通路的磷酸化状态。 结果表明，KYSE150和KYSE170细胞中METTL3的敲低阻碍了COL12A1的表达和RAF/MEK/ERK的磷酸化（图 4 H） ，并且TE1和KYSE30细胞中METTL3的上调增加了COL12A1的表达和RAF/MEK/ERK的激活（图 4 一） ●●●●。 这些结果证明，METTL3通过COL12A1介导的RAF/MEK/ERK/MAPK信号通路调节ESCC的增殖和转移能力。
图2 METTL3沉默可抑制ESCC细胞系的增殖、迁移和侵袭。 （A） 通过qRT-PCR和western blot检测左右面板显示转染siMETTL3或siControl的KYSE150和KYSE170细胞株中METTL 3的表达水平。 （B） 通过MTS试验和集落形成试验评估转染siMETTL3或siControl的KYSE150和KYSE170细胞的增殖能力和集落生成能力。 （C-D）通过伤口愈合实验、跨阱迁移和基质凝胶侵袭实验评估转染siMETTL3或siControl的KYSE150和KYSE170细胞的细胞迁移和侵袭能力。 所有数据均表示为平均值±标准偏差（n=3）* P<0.05，**P<0.01。
图3 METTL3的过度表达促进了ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭。 （A） 通过qRT-PCR和western blot检测转染oeMETTL3或oeVec质粒的TE1和KYSE30细胞中METTL 3的表达水平。 （B） 用MTS法和集落形成法评价转染oeMETTL3或oeVec质粒的TE1和KYSE30细胞的增殖能力和集落生成能力。 （C-D）通过伤口愈合实验、跨阱迁移实验和基质凝胶侵袭实验评估转染oeMETTL3或oeVec质粒的TE1和KYSE30细胞的细胞迁移和侵袭能力。 所有数据均表示为平均值±标准偏差（n=3）* P<0.05，**P<0.01。
图4 mRNA-seq分析用于验证差异表达基因和信号通路。 （A） 使用mRNA-Seq分析鉴定ESCC中METTL3调节的基因。 （B-C）GO分析和KEGG通路分析预测了靶mRNA介导的可能生物过程和信号通路。 （D） MAPK信号通路中23个mRNA的GO生物过程富集分析。 （E） METTL3沉默KYSE150细胞中前30个差异表达基因的热图。 （F） qRT-PCR分析了30个差异表达基因中的11个。 （G） 通过qRT-PCR评估METTL3敲除或过度表达的ESCC细胞系中MAP2K1的相对水平。 数据表示为平均值±标准偏差。**P<0.01。 （H-I）western blot检测转染siMETTL3或oeMETTL3质粒的ESCC细胞中COL12A的表达和RAF/MEK/ERK通路的磷酸化状态。
图5 COL12A1挽救了siMETTL3-1对ESCC增殖、迁移和侵袭的影响。 与siControl+oeVec组相比，（A-B）siControl+oeCOL12A1组增加了ESCC的增殖和克隆形成，而与siMETTL3-1+oeVec组相比，siMETTL1+oeCOB12A1组也增加了ESCC+克隆形成。 与siControl+oeVec组相比，（C-D）siControl+oeCOL12A1组促进了ESCC的迁移和侵袭，而siMETTL3-1+oeCOB12A1组则加速了ESCC迁移和侵袭* P<0.05，**P<0.01。
COL12A1对抗siMETTL3-1对ESCC生物学的抑制作用 为了研究COL12A1在METTL3促进ESCC增殖、迁移和侵袭中的靶基因作用，我们构建了COL12A的过表达质粒，在KYSE150和KYSE170细胞中与siMETTL3-1共转染。 结果表明，与对照组（siControl+oeVec）相比，过表达COL12A1（siContral+oeCOL12A）组增加了KYSE150和KYSE170细胞的增殖和克隆形成，并且在siMETTL3-1细胞（siMETTL1+oeCOL12A1）中过表达COL12A1 与对照组（siMETTL3-1+oeVec）相比，还增加了KYSE150和KYSE170细胞的增殖和克隆形成（图 5 A、 B）。 在伤口愈合和跨孔分析中，与对照组（siControl+oeVec）相比，过表达COL12A1（siContral+oeCOL12A）组促进了KYSE150和KYSE170细胞的迁移和侵袭，并且在siMETTL3-1细胞（siMETTL-1+oeCOL12A1）中过表达COL12A1 与对照组（siMETTL3-1+oeVec）相比，挽救了KYSE150和KYSE170细胞的迁移和侵袭（图 5 C、 D）。 这些结果表明，METTL3阳性调控的COL12A1可能是靶基因，在ESCC的发展中起肿瘤基因的作用。
讨论 近年来，m6A修饰已成为另一个表观遗传学热点。 由于研究方法的局限性，m6A研究于20世纪70年代首次被发现，并于2000年代复兴[ 10 ]. 直到2012年，随着高特异性抗体的开发和高通量测序技术的普及，m6A位点的转录全方位定位成为可能，这是RNA表观转录组学领域的一个里程碑[ 20 ， 21 ]. 此后，对m6A改性进行了深入研究。 m6A的安装是一个可逆的过程，通过m6A“写入器”和“擦除器”蛋白的平衡活性从去甲基化形式调节到甲基化形式，反之亦然。 m6A修饰参与哺乳动物的许多生物学过程，如RNA剪接、蛋白质翻译和干细胞更新[ 22 - 24 ]. 最近的许多研究部分揭示了癌症中m6A修饰的潜在机制。 有趣的是，不同m6A调节器的表达之间存在高度相关性，表明m6A机制在癌症发展中存在广泛的串扰[ 25 ]. m6A修饰和m6A调节剂的失调已被证明通过调节不同下游靶点的mRNA稳定性或蛋白翻译，在多种癌症进展中发挥着重要作用，包括癌症干细胞形成、上皮-间充质转化（EMT）、癌症代谢和信号转导。 在乳腺癌中，ALKBH5的表达是以HIF依赖的方式诱导的，ALKNH5的过度表达减少了m6A修饰并稳定了Nanog mRNA，有助于乳腺癌干细胞的形成[ 26 ]. m6A修饰通过靶向ATG5/7调节自噬，通过促进6PGD翻译调节磷酸戊糖流量，从而控制癌症代谢[ 27 ， 28 ]. m6A修饰通过METTL3和YTHDF1依赖性方式调节蜗牛翻译，在EMT和癌症转移中也起着重要作用[ 29 ]. 此外，m6A修饰还调节多种信号通路，包括AKT、MYC、NF-κB和YAP通路，以促进肿瘤生长[ 30 - 32 ]. 作为主要的“作者”，METTL3在人类癌症中经常被研究，无论是作为癌基因还是作为抑癌基因。 据报道，大肠癌组织中METTL3经常上调，METTL3/YTHDF2 m6A轴通过抑制YPEL5加速大肠癌的发生[ 16 ]. METTL3增加通过抑制miRNA let-7g促进乳腺癌的进展[ 33 ]. 在口腔鳞癌中，METTL3通过BMI1 m6A甲基化促进肿瘤发生和转移[ 17 ]. 另一方面，METTL3在一些病例中也被报道为肿瘤抑制因子[ 34 ]. 肾细胞癌（RCC）组织中METTL3的表达较低，而METTL 3的高表达可能预示着RCC患者更好的生存结局[ 35 ]. 基于一个新的统计模型和以下实验验证，METTL3被确定为膀胱癌的抑癌基因，METTL 3的体细胞突变可能促进癌细胞生长[ 36 ]. 然而，METTL3在ESCC发展中的潜在机制研究较少。 在这里，我们确定METTL3是ESCC中的关键调节因子，它促进肿瘤增殖和转移的发展。 我们发现，在食管鳞癌患者样本中检测到METTL3的高表达，并且METTL 3的增加与不良预后显著相关。 一项功能研究揭示了METTL3在促进ESCC增殖、迁移和侵袭方面的重要作用。 更重要的是，我们发现METTL3通过COL12A介导的MAPK信号通路调节肿瘤进展。 通过RNA-seq的GO分析，我们选择了CYP1B1、CASP1、SKP2、AXL、HNRNPL、TFAM、CCNG1、SNRPB2、COL12A1、RAB11FIP1和EGR1，它们在siMETTL3-1 KYSE150细胞中与siControl细胞相比显着差异表达，作为METTL3敲除的候选下游基因。 此外，我们通过qRT-PCR筛选出差异表达最显著的基因COL12A1，该基因受METTL3正调控。 KEGG通路分析表明，MAPK通路持有差异表达最多的基因。 因此，我们认为METTL3可以通过COL12A1介导的MAPK信号通路调节ESCC的进展。 关于COL12A1和MAPK通路之间的相关性，Yu等人报道COL12A通过MAPK通路促进胃癌转移，COL12Al可能是胃癌抗癌治疗的潜在靶点。 此外，我们通过western blot鉴定了COL12A1的表达和RAF/MEK/ERK的磷酸化状态，结果表明，METTL3的敲除降低了COL12A1的表达，降低了RAF/ME/ERK的活性。相反， 并且METTL3的过表达增加了COL12A1的表达和RAF/MEK/ERK的磷酸化状态。为了进一步验证COL12A1作为METTL3的下游靶基因的功能，进行了siMETTL3-1和oeCOL12A1的共转染试验。 在siMETTL3-1和siControl细胞中，oeCOL12A1增加了KYSE150和KYSE170细胞的增殖和克隆形成，并促进了细胞的迁移和侵袭。 这表明COL12A1作为METTL3的下游基因参与了ESCC的进展。
结论 在此，我们得出结论，METTL3作为一种致癌基因，通过COL12A1/RAF/MEK/ERK/MAPK信号通路促进ESCC的增殖和转移，表明METTL3可能是ESCC的候选预后生物标志物。
缩写 食管鳞状细胞癌； m6A:N6-甲基腺苷； METTL3：甲基转移酶样3； MAPK：丝裂原活化蛋白激酶。
补充材料
补充表。
致谢 道德认可 作者对工作的各个方面负责，确保与工作任何部分的准确性或完整性相关的问题得到适当调查和解决。 本研究中执行的所有程序均符合《赫尔辛基宣言》（2013年修订）。 所有患者在使用临床材料前签署知情同意书。 河北医科大学第四医院伦理委员会已证明本研究使用组织。
数据可用性声明 本文中包括支持本文结论的数据集。 可以向相应的作者进行进一步的查询。
作者贡献 构思与设计：李杰和B山； 行政支持：B Shan； 提供研究材料或患者：Z Li、Y Xu、C Huang； 数据收集与汇编：J Li、Z Li、Y Xu； 数据分析与解释：J Li，C Huang； 手稿撰写：所有作者； 手稿最终批准：所有作者。
资金来源 本研究得到河北省医学科学重点研究项目（20190693）的资助。
竞争性利益 提交人声明，不存在竞争利益。
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作者联系人 通讯作者：山宝恩。 河北医科大学附属第四医院研究中心，河北石家庄，050011，中华人民共和国。 电子邮箱：baoenshan1962 通用域名格式。
收到日期：2021-9-6 2022-3-6接受 发布日期：2022-3-28
引文样式 亚太地区 复制 Li，J.，Li，Z.，Xu，Y.，Huang，C.，Shan，B.（2022）。 METTL3通过COL12A1/MAPK信号通路促进食管鳞癌的肿瘤进展。 癌症杂志 , 13(6), 1972-1984. https://doi.org/10.7150/jca.66830。
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