釉原蛋白：用于牙齿和骨形成与修复的多面蛋白质

4.5亿年前（Ma），在早期脊椎动物中发现了与釉质有关的高矿化组织。珐琅质基质蛋白（EMP）、釉原蛋白（AMEL）、成釉细胞蛋白（AMBN）和珐琅质蛋白（ENAM）具有珐琅质特异性，我们可以推断它们在脊椎动物进化早期被征募。分子分析支持它们在前寒武纪末期（>600 Ma）出现，即之前的脊椎动物分化出矿化骨骼。然而，我们目前对EMP的了解仅限于四足类，即360 Ma。AMEL是由AMBN创建的，其本身是ENAM复制的结果。因此，EMP基因是并行的。AMEL的进化分析突出了保守和可变区域。N端和C端区域包含大量残基，在360 Ma期间保持不变，支持重要功能。已知只有少数职位发挥作用。其他职位被认为是至关重要的，因为它们没有改变。已知其中五种药物在被替代后会导致遗传病，即X连锁成釉不全症（AIH1）。由外显子6编码的最大AMEL区域在哺乳动物中的变异性小于在蜥脚下目和两栖动物中的变异性，但它在所有谱系中都积累了许多indel。它是通过重复PXQ三联体而创建的。在哺乳动物物种的同一位点上独立地出现了类似的重复，但其含义仍不清楚。AMEL的进化分析允许验证已知在改变时导致AIH1的功能残基和位置。它还强调了可能具有有趣功能的残基，并预测这些保守位置在被取代时将导致AIH1。

釉原蛋白基因编码保守的釉原蛋白，在发育中的牙齿成釉细胞的成釉分泌阶段高水平表达。迄今为止研究的大多数釉原蛋白基因都有7个外显子，但在一些啮齿类动物中已鉴定出外显子8和9。Amelogenin基因在人类、牛和其他一些物种中定位于X和Y染色体，而在啮齿类动物中，单个基因是X染色体，在单孔目动物中是常染色体。小鼠和牛基因的启动子和内含子分析揭示了调控区域，在所分析的所有物种中，初级RNA转录物的选择性剪接是一个显著特征。人类、小鼠、牛、狗和马的X染色体釉原蛋白（Amelx）基因嵌套在Arhgap6基因的内含子内，通常方向相反。在牙髓细胞和包括脑、骨和干细胞在内的一些非牙组织中也检测到了低水平的釉原蛋白mRNA和蛋白质。未来的研究预计将解决成釉细胞分泌期结束时的下调，与发育过程中选择性RNA剪接和稳定性调节相关的机制，以及成釉素在非牙齿细胞类型中表达的模式和后果。

尽管其他人和我们早先已经报道了釉原蛋白在正常釉质形成中起着关键作用，但由于其异质性和复杂性，每个釉原蛋白亚型的体内功能尚未明确定义。本章将回顾釉原蛋白剪接亚型、全长釉原蛋白和富含亮氨酸的釉原肽（LRAP）在釉质形成中的功能的最新信息。我们还将讨论LRAP作为牙周组织间充质细胞中信号分子的额外作用的新证据。我们相信，对由多功能釉原蛋白调节的信号通路的进一步了解将有助于开发治疗牙科疾病的新治疗方法。

形成钙化组织的细胞产生各种基质蛋白，为钙和磷离子有序沉积到碳酸化磷灰石矿物中创造有利环境。与基于胶原蛋白的钙化组织不同，釉质的有机基质由上皮衍生细胞（成釉细胞）产生，由两大类蛋白质组成，即釉原蛋白（AMEL）和非糖原蛋白[1]。AMEL类包括全长蛋白质、替代mRNA剪接产生的截短亚型和细胞外蛋白水解过程产生的片段[1]。釉质不同于其他钙化组织，因为它的有机基质最终必须几乎完全去除，才能达到完全矿化状态。因此，成釉包括形成和降解过程。过去几年的研究表明，AMEL除了在牙齿表面构建和组织矿物质外，还有着意想不到的潜力，尤其是其影响成骨事件的明显能力。这篇小综述的目的是强调AMEL与这两个过程相关的一些关键特征，并简要介绍我们在骨形成细胞中引入珐琅质蛋白转基因的工作。

造釉细胞素（AMBN）和釉蛋白（ENAM）是人类染色体4q上23个分泌性钙结合磷蛋白（SCPP）基因中的两个。他们是富含脯氨酸和谷氨酰胺组的成员。成釉细胞素和珐琅质在牙齿形成过程中都起着特殊的作用，可能两者都是牙釉质形成的关键因素。这两种基因在进化过程中失去了制造牙釉质能力的哺乳动物中都会退化。在牙齿形成过程中不能表达功能性成釉细胞素或珐琅质的小鼠中，沿成釉细胞质膜分泌部分的矿化前沿不能产生珐琅质矿物带。牙本质上形成了一层无功能的矿物外壳，当牙齿发挥功能时，它很容易磨损。成釉细胞发生病理变化，如细胞层矿化、结构紊乱和凋亡。在本章中，我们回顾了成釉素的结构和功能，并得出结论：釉素和成釉素在成釉分泌阶段对釉质矿物带的形成都至关重要，它们的主要功能位于矿化前沿。

通过体外方法鉴定，釉质基质蛋白（EMP）结合一类称为溶酶体相关膜蛋白（LAMP）的蛋白质，其成员为LAMP1、LAMP2和CD63/LAMP3。LAMP是存在于质膜中的跨膜蛋白，三者都直接与AP-3复合物相互作用，启动受体介导的内吞作用。在酵母中，AP-3相关的内吞作用不依赖于氯氰菊酯，而在高等生物中，对氯氰菊酯的需求尚不清楚。AP-3是一种蛋白质复合物，含有四个亚基，分别称为β、δ、μ和σ。另外三个衔接蛋白复合物（AP-1、AP-2和AP-4）也与内吞有关，分别具有四个相似但独特的亚基，是氯菊酯依赖型（AP-1和AP-2）或氯菊酯非依赖型（AP-4）。只有AP-3与血浆膜结合的LAMP直接相互作用。降解EMP的内吞作用可能在釉质成熟中起着重要作用，如果是这样，AP-3功能障碍可能导致釉质异常。我们启动了体内研究，以更好地确定AP-3β亚单位（由AP3B1基因编码）缺失的小鼠菌株的牙齿表型，这导致AP-3功能丧失。未来研究的驱动假设是：“在釉质成熟过程中，正常成釉细胞对降解EMP的内吞作用失败，导致功能低下的釉质更容易发生牙科疾病”。我们希望从这些小鼠研究中回答的问题是，受体介导的AP-3内吞途径是否是釉发生的一个显著特征。本章讨论了AP-3介导的内吞作用在成釉过程中的潜在作用，并描述了可用于检验这种关系的动物实验模型。

几十年来，已知釉原蛋白（amelogenin）仅在外胚层釉质中表达，在其结构组织和生物矿化中起着重要作用，它占发育中细胞外釉质基质蛋白的90%。近年来，还发现了釉原蛋白的其他作用。本文重点研究釉原蛋白在牙齿支持组织再生、正常长骨和胚胎颅面复合体发育过程中的可能作用；一种单一的重组人釉原蛋白（rHAM+），在实验性牙周炎形成后诱导所有牙齿支持（牙周）组织的体内再生。牙周再生期间，釉原蛋白（直接或间接）招募间充质干细胞。Amelogenin珠应用于发育中的胚胎间充质和牙胚募集的间充质细胞。釉原蛋白在正常和再生牙槽骨细胞（骨细胞、成骨细胞和破骨细胞）、牙周膜、牙骨质和骨髓基质细胞中表达。Amelogenin在长骨、骨膜、关节软骨中也有表达，在表皮生长板细胞中也有差异表达。Amelogenin在正常和再生组织中高骨转换和重塑区域的表达最高。胚胎颅面发育期间釉原蛋白的时空表达是动态的。这些结果和不断积累的报告表明，釉原蛋白参与一些发育过程的调节，充当影响正常组织和再生组织的信号分子，并参与维持骨形成和吸收之间的平衡。釉原蛋白的表达模式和牙周再生的诱导可能为一些广泛存在的牙周、骨、韧带和关节疾病提供未来的治疗，这些疾病具有重大的临床、科学和财政挑战。

釉原蛋白基因（AMELX）是第一个被发现的细胞外釉基质编码基因。AMELX突变导致釉原蛋白发生各种变化，导致异常釉质形成。由此产生的临床表型多样，被称为成釉不全症（AI）。迄今为止，已有14个等位基因AMELX突变被描述，据称这些突变导致了釉原蛋白的显著不同表达和类型。有趣的是，不同的蛋白结构域受不同的AMELX基因突变的影响，导致独特的、功能改变的釉原蛋白，这些釉原蛋白与几个截然不同的AI表型相关。AMELX突变和相关表型通常分为三类。导致釉原蛋白全部丢失的突变（例如信号肽突变）与主要发育不良表型相关（尽管也可能发生矿化缺陷）。影响N末端区域的错义突变，尤其是那些引起假定凝集素结合域和富含酪氨酸的Amelogenin蛋白区域变化的错义变异，该区域包含几个关键蛋白酶裂解位点，导致以低矿化/低成熟AI表型为主的釉质变色，并保留了釉原蛋白。引起釉原蛋白C末端缺失的突变导致以发育不全为特征的表型。表型-基因型相关性表明釉原蛋白分子有重要的功能域，对正常釉质结构、成分和厚度的发育至关重要，这些不同域的扰动可能导致不同的临床表型。

MMP20（基质金属蛋白酶-20；珐琅质蛋白酶）和KLK4（激肽释放酶-4）是发育中牙釉质中存在的两种主要蛋白酶，也许是唯一的蛋白酶。MMP20在釉质厚度增加的早期发育阶段切割釉质驻留蛋白，KLK4在釉质蛋白质被位于全层釉质顶部的成釉细胞吸收之前切割釉质蛋白质。KLK4在牙釉质开始硬化到最终成熟时表达。人类中MMP20或KLK3功能缺失的突变会导致非综合征性牙釉质畸形，称为成釉发育不全。小鼠基因组中任何一种蛋白酶的纯合缺失也会导致牙釉质严重畸形。除了畸形釉质外，当这些蛋白酶中的任何一种在人类或小鼠中失去功能时，尚未发现其他表型。因此，MMP20和KLK4对牙釉质形成至关重要。本章将对这些蛋白酶的发现提供历史性的见解，并将深入了解这些蛋白酶如何作用于釉质发育的机制。

釉原蛋白除了在釉质生物矿化过程中的关键结构功能外，在多种体内外实验系统中也表现出不同的信号活性。我们提供了计算和生物物理数据来证明釉原蛋白属于本质无序蛋白质（IDP）类。IDPs在自然条件下缺乏明确的3D结构，通常具有灵活性、扩展性，并且在缺乏伴侣的情况下，体外几乎没有二级结构。本章考虑了釉原蛋白的构象、二级结构和紊乱程度的细节。我们认为，釉原蛋白中“构象可塑性”的出现解释了其多功能性，有助于其强烈的自组装倾向，以及与不同靶点特异性相互作用的潜力。

釉原蛋白和其他基质蛋白在釉质形成调节中的作用已经取得了重大进展，尽管这一过程的机制尚未完全了解。然而，尽管釉质矿物形成的机制在几个不同的方面与其他矿化组织不同，但显然有几个与矿化组织形成相关的指导原则。本综述简要描述了釉质、骨和牙本质形成之间的一些相似性和差异，并重点介绍了我们实验室最近的体外和体内研究，这些研究表明釉原蛋白通过一种似乎普遍用于矿化组织发育的策略来调节釉质矿物形成。更具体地说，所提出的研究表明，全长釉原蛋白有能力稳定无定形磷酸钙（ACP）的形成，并引导其组织成线性针状结构，随后在体外融合并组织成平行排列的磷灰石晶体。重要的是，这些体外研究结果与最近提出的体内数据一致，这些体内数据表明，釉质中的矿物形态和组织是在其结晶之前由有机基质建立的。这些新发现应有助于开发矿化组织再生和修复的新方法。

釉原蛋白（amelogenin，AMEL）基因的内含子-外显子结构、序列和核苷酸序列在进化过程中得到了很好的保存。核前体mRNA剪接产生mRNA和随后翻译的蛋白质的变化取决于内含子和外显子的序列长度、大外显子中可能存在的隐性剪接位点、内在“强度”剪接边界序列与剪接体成分的相互作用以及各种组织和物种特异性辅助因子的干预。确实发现了大量剪接亚型；据报道，小鼠釉原蛋白中存在16种不同的蛋白质亚型，但不同动物的实际剪接模式不同。主要的高质量亚型用于构建釉原蛋白ECM，并指导釉质的组织和矿化。这里提出的问题是较小亚型的作用？它们的作用似乎主要是作为釉质器官发育和牙齿发育过程中的调节过程的参与者。然而，越来越清楚的是，釉原蛋白的表达并不局限于釉质器官。在胚胎发育过程中，在大脑、眼睛、软骨和骨骼等多种器官中发现了釉原蛋白肽。釉原蛋白基因的敲除不是致命的，这些非牙源性组织确实形成并似乎功能正常，这表明较小剪接亚型的正常体内效应可能是微妙的，可以改变发育速度，但很明显，单个小釉原蛋白亚型，体内和培养中外源性添加可以显著改变非牙源性组织的表型表达，并诱导牙齿的各种形式的组织修复。因此，AMEL基因小亚型及其作用机制的研究是值得深入研究的领域。

外显子8和9是在啮齿类动物釉原蛋白基因的几个转录本中发现的两个新的外显子。这些转录物来自选择性剪接，其中外显子7被外显子8和9取代，并且它们在釉原蛋白亚型中添加了一个独特的3'末端。因此，交替剪接的釉原蛋白要么在编码单个天冬氨酸的第7外显子结束，要么在编码14个氨基酸的第8和第9外显子终止。到目前为止，在啮齿类动物中总共发现了7个以外显子8和9结尾的交替剪接釉原mRNA。这两个外显子的形成是由于含有外显子5的DNA区域的重复，随后是外显子7的下游易位。这一事件发生在大约5000万年前，啮齿动物谱系进化的过程中，这一时期晚于松鼠谱系的分化。因此，外显子8与外显子5同源。携带外显子8和9编码区域的釉原蛋白不仅位于成釉细胞和釉质基质中，也位于成牙本质细胞和牙本质中。外显子8和9替换外显子7导致了额外的亲水性结构域，其功能尚不清楚，但可能部分与啮齿类牙釉质中与人类牙釉质相比独特的不同杆和杆间结构有关。初步研究了具有外显子8和9末端肽的釉原蛋白的功能。他们被发现可以促进间充质细胞的增殖。

两种低分子量釉原蛋白基因剪接产物（A+4和A-4）被用于大鼠第一上颌磨牙手术后的牙髓盖髓，已被证明能够诱导修复性牙本质桥的形成。A-4可诱导臼齿正畸型矿化，以均匀矿化结构完全填充牙髓管。这两个分子招募潜在的成人牙髓前体细胞形成活跃分裂的细胞，这些细胞分化为具有成骨细胞-成骨细胞表型的细胞，以产生用于修复性矿化的细胞外基质。我们的结论是，使用生物活性分子覆盖牙髓将指导生物牙科的新方法。

发育中的牙齿是上皮-间充质器官形成的公认模型。它也是生物矿化的模型，在生物矿化过程中，由于蛋白质基质对矿物习性的影响，形成了几种独特的生物陶瓷组织、牙本质、釉质和牙骨质。珐琅质是唯一一种生物矿化的外胚层衍生组织，并展示了几种信息策略，以满足在潮湿、充满细菌的环境中，在与食物摄入相关的压力下，生产出一种可以使用一生的组织的要求。釉质的形成依赖于蛋白质的自组装，以制造前体蛋白质基质来引导矿物相。细胞与基质的相互作用用于持续监测基质制造和矿物转化过程。我们展示了利用纳米回声技术创建的人工基质，其中多肽双亲分子自我组装成支持细胞增殖的纳米纤维，其表面可以被设计为提供生物信号以指导成釉细胞分化。这项受生物启发的技术可用于牙釉质组织的再生，为传统牙科材料提供仿生替代品。

Amelogenin是牙釉质有机基质中含量最高的蛋白质，也是牙釉质形成所不可或缺的结构蛋白。商业产品Emdogain主要由交替拼接和加工的釉原蛋白组成，可以在颌骨中诱导新骨、牙骨质和牙周韧带的形成。以小鼠胚胎干细胞（ES）为模型系统，我们证明了釉原蛋白剪接亚型之一的富含亮氨酸的釉原肽（LRAP）通过Wnt激动剂和拮抗剂的协同调节激活典型Wnt信号通路，诱导小鼠ES细胞成骨分化。此外，LRAP刺激大鼠股骨临界尺寸缺损模型中的骨再生。

再生牙周治疗的目标是重建丢失的牙周结构（即牙根牙骨质、牙周膜和牙槽骨的新形成）。基础研究的结果表明，釉质基质蛋白衍生物（EMD）在牙周伤口愈合中具有重要作用。急性和慢性动物模型以及人类病例报告的组织学结果提供了证据，证明EMD治疗确实可以促进牙周再生，并对骨内、II类分叉和退行性缺损的伤口愈合产生积极影响。最近的长期随机对照临床研究表明，EMD手术后取得的改善可以长期保持。本章的目的是对EMD在再生牙周治疗中的临床应用进行概述。