生物物理、生物化学和细胞生物学的前沿技术：从原理到应用

如今，动物细胞培养技术已经成为生物医学研究领域不可或缺的工具。它为研究提供了基础与疾病发病机制相关的分子和生化变化。它显式地为研究基因表达、调控、增殖和分化提供了一个范围在正常和病理条件下。动物细胞的培养需要成功进行细胞培养的无菌条件和关键技术实验。它为研究细胞和分子生物学提供了一个合适的模型，细胞的生化变化、药物筛选和疗效等。本章描述动物细胞培养的基本技术及其应用。

本章重点介绍了各种更新和高级的实时定量PCR检测化学及其在生物医学中的应用研究和分子诊断。本章还总结了最先进的基于qPCR技术的改进以及下一代方法在生物医学和分子科学领域具有巨大的变革潜力诊断。

流式细胞仪是一种复杂的分析工具，可以分析细胞在更短时间内的表型和功能特征。它测量光散射特性，主要是电池的前向散射和侧向散射特性。光学、流体学和电子学是流式细胞仪的主要组成部分。流体动力学鞘室中鞘液的聚焦使流线运动成为可能个单元格。这使得每个细胞可以分别与激光相遇。光电二极管，光电倍增管、滤光片和分束器收集并发射光或信号形式的荧光。电子设备对信号进行进一步处理并借助软件对数据进行了分析。对于要发射的电池荧光，一些荧光色素（FITC、Alexa Fluor 488、Alexa-Fluor 647等）和染料（碘化丙啶、赫斯特、溴化乙锭等）可用。这些荧光色素可与抗体结合，并在激发时发出荧光通过激光。使用流式细胞仪可以进行多种应用细胞凋亡测定、细胞周期分析、自由基生成测定、细胞因子估计，免疫表型、吞噬试验等。高级应用程序流式细胞仪受到关注的是细胞分选。单个单元格或单元格类型可以是利用细胞的物理荧光发射特征从混合细胞中分类命名为荧光辅助细胞分选机。

在X射线晶体学中，相位问题是一个主要的瓶颈只有当我们获得合适的模板或可以确定阶段时，才能成功实验性地。然而，分子置换计算是最有用的该技术在已知同源结构时可以应用。收件人获得相位信息，最广泛使用的方法是重原子衍生化对于蛋白质晶体，尽管现在通常不使用。虽然它是获取未知结构物相位的有价值技术与使用分子替换（MR）的同源，以及即使在同步加速器上也无法衍射，现在，SAD和MAD方法已经开发了实验阶段。更先进的技术还已开发出Cryo-EM和SFX与XFEL，具有巨大的潜力确定不允许产生晶体的新蛋白质的结构无法衍射。

随着对重要商业蛋白质需求的增加对于开发更完善、更有效的异种方法至关重要蛋白质生产满足社会需求。尽管目前有可用于异源生产蛋白质的不同宿主系统，仍然是如果目标是获得完整的主机系统，那么选择一个完美的主机系统将成为一项乏味的任务适量的功能蛋白。不同类型的主机通常用于异源蛋白生产包括大肠杆菌、酿酒酵母、，昆虫细胞表达系统和各种哺乳动物系统。不同的主机系统用于异源蛋白表达的基因有其自身的优势缺点是细菌系统会产生大量蛋白质但蛋白质的质量可能不合适。同样，真核生物宿主也遭受特定的优缺点。不同的启动子系统用于在原核和真核宿主。选择适当的主机取决于蛋白质、蛋白质在功能活性方面的质量及其应用。在这个第二章，我们将讨论异源基因表达的原理、不同类型可用于异源蛋白生产的宿主生物。我们还将介绍目前各主机正在进行的开发和修改改进蛋白质生产过程的系统。我们将详细说明用于重组蛋白生产的不同类型载体载体、重要性或与蛋白质生产有关的启动子。除此之外，我们还将详细说明关于重组蛋白过表达和纯化的不同方面异源蛋白及其标签类型和色谱技术不同类型蛋白质的纯化。

合理的药物设计包括几种理论方法涉及分子建模、对接等的电子方法，用于研究行为和分子系统的性质。具体而言，该领域采用的技术计算化学、计算生物学、纳米技术和材料科学的复杂性各不相同，理论观察取决于系统类型和正在调查的系统大小。分子建模包括量子和分子力学（QM&MM）。分子模型的基本概念通过适当的例子进行了阐述。本章还重点介绍了用于药物设计的硅内方法的顺序流，给出了一个用于此目的的软件的简要快照。先进的技术和解释了计算方法在新药开发中的应用。因此，本章提供了对计算机辅助的各种维度的深入了解药物设计；其驱动力、最新发展和未来前景。

X射线晶体学对理解物质三维结构的科学。原子能小分子的排列，如盐、无机物、有机络合物和测定了金属化合物。后来，一个接一个的分子洪水生物起源的结构是用X射线晶体学解决的。这个20世纪50年代，DNA的结构是用纤维衍射法测定的，随后，多糖、纤维蛋白和病毒粒子的结构被已确定。第一个蛋白质分子的晶体结构为溶菌酶、肌红蛋白和血红蛋白是20世纪60年代的巨大成就，用单晶衍射法求解。几十年后，原子能病毒和膜受体的结构已开始确定。目前，有超过12.5万个晶体结构以这样的速度提交给PDB数据库每年超过3000个结构。相比之下，有1.2万核磁共振波谱以每年略多于100个结构的速度求解结构，然而，PDB中只有2000个可用结构，可以使用计算方法。它显示了X射线晶体学在揭示结构生物学领域中蛋白质分子的原子细节。对于确定结构时，首先结晶分子，使其具有重复性和三维空间中阵列的规则排列。由于X射线具有波长按照物质中存在的键距离的顺序，它们是合适的用于确定详细原子位置的电磁辐射。一束X射线从晶体物质中衍射，并在某些位置收集。这个对衍射X射线的强度、振幅和相位进行卷积计算晶体中原子的电子密度。原子位置通过放置它们位于电子密度的平均位置，最终是原子坐标三维空间被揭示出来，它定义了物质或分子的形状。生物分子晶体学处理晶体结构的测定生物分子，如蛋白质、核酸、多糖、复合物等生物分子的结构和功能密切相关，揭示了为了理解或改变生物分子。这种理解导致了基于结构的药物的出现发现方法。药物靶蛋白的可用三维结构也可能用于针对病理生理状态进行基于结构的药物设计。

在过去的二十年中，大规模并行测序的发展方法使RNA测序达到前所未有的分辨率，释放出大量有关细胞状态的信息。排序具有通过识别新突变和异常剪接加速生物医学研究模式、剪接异构体、新的基因调节因子和细胞间异质性。整齐为了有效地表征完整转录组的复杂性，有一个通过改进稳定发展不同的RNA测序[RNA-seq]协议从图书馆准备到数据分析的不同步骤。此外，使用测序策略的进展，单细胞RNA测序[scRNA-seq]已经开发出能够解决细胞类型异质性的方法，以及mRNA表达分辨率高。这些方法中的大多数涉及RNA到cDNA的转换，因此容易出错、PCR和连接偏差，酶的效率低下。在这些挑战中，我们制定了战略直接在单分子水平对RNA进行测序，以克服这些偏见。本章简要概述了不同的排序RNA-seq、scRNA-seg和单分子RNA可用的技术测序以及RNA测序对生物医学领域。

抗原和免疫球蛋白是重要的生物实体。互动这些成分中的一个被认为是评估健康状况的主要标准兽医和医学。抗原-抗体反应具有高度特异性。这个抗原和抗体之间的相互作用被用作免疫电泳。该技术在基础和应用健康科学。本章描述了原理、过程、类型、，各种免疫电泳的应用、优点和局限性。这些信息对免疫学的学生和那些需要了解免疫电泳及其应用。