精子介导的基因转移：概念和争议

精子介导基因转移（SMGT）的概念描述了精子在受精过程中，不仅将自己的基因组传递给胚胎，还将外源基因信息传递给胚胎他们可能会接触到。这一概念于1989年确立，当时首次表明与小鼠精子孵育的外源DNA可以在出生后代的组织中检测到这一发现促进了大量的研究，逐渐扩展到各种物种，并且仍在进行中，双重目的是一方面阐明SMGT的基本分子机制，另一方面另一方面，开发生物技术应用，以生产转基因动物。在以下方面的进展任何科学领域通常都是以非线性的方式实现的，重新审视其历史发展有助于正式确定概念进展以及任何剩余差距。在本章中，我概述了研究自首次发现以来，SMGT领域内的进展和概念演变。我专注于基础研究并特别讨论我认为是该领域独特里程碑的发现。这段历史这段旅程跨越了20多年，最早的观察表明精子细胞对外源分子具有渗透性，这与最近发现的逆转录酶（RT）依赖性有关该机制在精子细胞中是活跃的，可以被视为新遗传特征的连续来源。

几乎所有动物的精子都能自发结合外源性DNA分子并在受精时将其传递给卵母细胞，这首先表明这些细胞可以用作载体用于在动物中引入新的遗传和表型特征。这导致了一部小说的发展动物转基因方法，即精子介导的基因转移（SMGT）。这里我们回顾一下发现使用此实验方法获得。对已发表证据的批判性审查表明在精子细胞的质膜直接结合或其旁路之间的选择是至关重要的外源核酸分子命运的参数：在前一种情况下，上位结构是主要生成；在后者中，宿主基因组中的整合更为频繁。最初的协议是基于精子细胞和外源DNA之间的直接相互作用。有几种替代方案随后开发了该方法，以提高该方法的疗效。改进的协议包括SMGT具有：i）ICSI（胞质内精子注射）技术，ii）有利于DNA的限制酶整合（REMI）或iii）基于连接体（LB），其中DNA结合由抗体介导识别膜抗原。在另一种方法中，目的是生产“转基因精子”：用于例如，在睾丸介导的基因转移（TMGT）中，外源DNA被直接显微注射到睾丸中；在里面病毒介导的转基因，通过病毒载体将新基因传递到精子干细胞。这个最近发现成熟精子是非整合转录活性的来源逆转录基因也提示了SMGT在胚胎基因治疗中的潜在用途。

SMGT面临强大的天然屏障。然而，这些障碍不太可能是绝对的不可侵犯。如果精子细胞确实可以作为外源DNA的载体，那么有性繁殖的动物可能会受到精子携带的外源DNA序列的改变细胞。目前，数据不足，无法量化SMGT的发生率自然。然而，这种“自然”SMGT的含义是重大的，包括进化从头突变对哺乳动物基因组和人类病理的影响。

精子介导的基因转移（SMGT）是一种替代技术转基因动物的生产。这项技术基于精子的吸收能力感兴趣的外源基因在体外以DNA分子的形式存在，并在施肥。因此，新的遗传信息可以整合到胚胎基因组中，以改变后代和后代特定基因的表达。精子对DNA的吸收是一种非常具体且监管良好的机制。尽管SMGT已被证明是高效的，但协议因为动物转基因仍处于优化阶段。SMGT协议的最新修改，包括胞质内精子注射衍生转基因（ICSI-Tr）和睾丸介导的基因转移（TMGT），已报告。进一步了解SMGT涉及的机制将增强我们的对受精生物学的理解。虽然还不完善，但SMGT的技术水平很高生物技术和医疗潜力。利用SMGT生产转基因家畜可以提高它们的性能，还可以在农场哺乳动物的乳汁。此外，它还可以用来制造动物作为人类疾病的模型或生产用于异种移植的多转基因动物。最后，SMGT在未来人类基因治疗的背景。

精子细胞捕获外源DNA并将其转移至卵子是两个关键过程在SMGT中。在过去的二十年里，通过精子细胞已通过各种方法增加，如使用脂质体、电穿孔、Triton-X或二甲基亚砜处理的精子、病毒载体和磁性纳米粒子。睾丸介导的基因转移（TMGT）是SMGT的一种新的替代变体，用于体内生产转基因动物。本章介绍了SMGT的非病毒和病毒形式以及TMGT的背景和特征近年来发展起来的。此外，还讨论了转基因精子的受精方式。

小鼠精子介导的基因转移（SMGT）在过去经历了快速发展二十年来，由于操作上的明显优势：它既便宜又方便，而且需要最少的专业培训和设备。SMGT技术的典型方法是使用成熟的精子作为DNA体外传递载体。然而，与此方法相关的低效率导致了许多负面结果，并由此引发了对其生物学基础的争议。相比之下，在通过将外源DNA直接导入男性生殖道的体内基因转移正在发展迅速地。小鼠作为主要的模型动物，对SMGT的进展做出了重要贡献。

转基因研究已经发展到几个目的，包括遗传改良水产养殖物种和生物医学研究实验模型的制作。微量注射DNA进入受精卵的原核/细胞核是最常用和应用的技术在转基因动物生产中取得了成功。然而，这项技术费时费力受某些物种的卵特性限制。在水生动物中，如海洋鳍鱼和贝类障碍甚至更大，因为这些生物体一般都有小而脆弱的卵子发育第一阶段的死亡率。因此，整体转基因方法，如精子介导的基因转移（SMGT）或睾丸介导的基因转移（TMGT）可能对转基因水生物种的生产。尽管SMTG已被证明是一种良好的作为大规模转基因的替代方案，该技术只有在以下情况下才能在不久的将来常规应用进一步的研究集中在影响精子与精子相互作用的因素上外源DNA以及调节转基因整合和表达的过程。

转基因农场动物的重要性在于它们对非常不同的用途目的：例如在人类医学中（获得药品、异种器官移植、，或作为基因治疗研究的模型）或用于农业应用，如改良胴体或牛奶产量和成分的产量，增长速度的提高，饲料利用率的提高，提高繁殖性能，增加繁殖力，以及增强抗病性或减少环境影响。微注射原核DNA一直是最可靠的生产方法转基因动物。然而，尽管使用这种方法已经产生了转基因动物，但它已经许多限制。精子介导的基因转移（SMGT）基于精子结合的能力，在受精过程中内化并将外源DNA运输到卵母细胞中。在本章中，我们回顾了SMGT在家畜中的应用现状，特别是猪和牛与其他反刍动物和马有关的其他信息。我们评估了转基因猪和牛，并综述了与SGMT在这些物种中成功相关的因素基于对猪和牛SMGT的主要因素进行分析的研究，我们自己的经验。

目前用于家畜的微操作方法的结果不到1%转基因动物。这使得生产转基因奶牛极为困难，而且对于生产转基因鸡。这项工作的目的是找到一种更有效的生产方法结合脂质体感染和限制性内切酶两种技术的转基因小牛和小鸡介导插入（REMI）。以前的研究人员无法使用仅脂肪感染。另一方面，注射用限制性内切酶孵育的分离精子核只有青蛙的卵母细胞被证明是有效的。在这项研究中，我们首次证明，DNA和限制性内切酶的脂质体感染可以成功地将DNA整合到精子基因组DNA，然后用于常规人工授精，以生产转基因小牛和小鸡。首先是利用基因组DNA的针刺和southern印迹分析证明限制性内切酶打开精子基因组DNA中的“热点”。这会产生粘性末端，通过这些末端，外源DNA可以插入并整合到精子基因组DNA中。由此产生的“转基因精子”用于体外受精和人工授精产生表达外源DNA EGFP（增强型绿色荧光蛋白）的胚胎。使用非I型和线性化pEGFP脂质体感染精子用于AI导致两头小牛表达通过（a）PCR和RT-PCR测定淋巴细胞中的外源DNA；（b） 比排放量EGFP蛋白的绿色荧光；（c） EGFP DNA与PCR产物的同源性分析DNA序列和（d）Southern blot分析。同样在鸡体内，线性化质粒EGFP将带有相应限制性内切酶（REMI）的序列脂转染到精子中。这个然后将转染的精子用于母鸡的人工授精，90%（17/19）的结果鸡表达通过以下方法测定淋巴细胞中的外源DNA：（a）PCR和RT-PCR；（b） 比排放量EGFP的绿色荧光；和（c）Southern印迹分析。发现两者之间存在完全同源性水母EGFP DNA和鸡血细胞DNA的313 bp PCR产物。程序是然后用额外的结构hFSH进行测试。hFSH的结构由α和β两个亚单位组成PCR产物使用了α和β亚单位的引物，PCR产物为584 bp是转基因鸡特有的。然后使用该程序对hFSH（人类卵泡刺激激素）注入鸡精子并用于人工授精通过以下方法确定至少三代转基因：（1）鸡hFSH蛋白的测定使用酶免疫测定和RIA的血液；（2） RT-PCR和PCR；和（3）副本号。

我们得出结论：（1）DNA和限制性内切酶脂质体感染精子（牛和鸡）诱导DNA整合到精子基因组DNA中；（2） 脂肪感染的精子可以用于人工智能生产高比例的转基因小牛和小鸡；（3） 整合基因在第一个，第二代和第三代；（4）该方法不限于特定基因。脂肪感染技术因此，结合REMI的DNA是一种高效、稳定的转基因家畜生产方法动物。高效生产转基因家畜可能对基因治疗产生重大影响，改善牲畜品种和生产有价值的药物，例如hFSH从鸡蛋和牛奶中提取。

使用小鼠模型，卵胞浆内单精子注射（ICSI）介导的转基因已经被证实被证明是生产转基因动物的宝贵工具，是基础和生物科学中的应用研究。这种转基因方法包括显微注射预先孵化的精子带有外来DNA。载DNA精子细胞的ICSI已被证明能介导小鼠高效转基因，尤其是当精细胞受损时（通过冻融循环或暴露于洗涤剂）。ICSI介导的转基因的最大优点是可以引入非常大的DNA转基因（例如酵母人工染色体），以相对较高的效率进入与原核微注射相比，宿主基因组。此外，ICSI介导的转基因是与（a）胚胎嵌合体的低频率有关，这是原核细胞的主要限制之一用于生产转基因家畜的微量注射，以及（b）孟德尔种系的高频率转基因序列在创始动物之间的传递。在本章中，我们将回顾以下因素可以提高ICSI介导的转基因的效率，我们将描述一种新的活性形式利用新鲜精子与重组酶或转座酶分子结合进行转基因。

纳米颗粒被纳入许多日常使用的产品中，例如填料、奶嘴、，催化剂、药品、润滑剂、化妆品、药品、电子设备或其他家用器具。这些方法证明了纳米复合材料在细胞生物技术中的巨大潜力以及开发更有效的方法，将外源DNA引入精子细胞和从而完善转基因动物技术。本章将阐述纳米复合材料用于基因传递的方法及其在纳米精子介导中的潜在应用基因转移（Nano-SMGT）。

基本上所有物种的精子都能自发接受外源性精子的发现DNA并在受精时将其传递给卵母细胞表明，它们可以作为外源信息的载体转基因动物的产生。因此，精子介导的基因转移（SMGT）有多种方案已在许多物种中发育。外因稳定和传播的结果序列高度异质，这让人怀疑所产生的动物是否真的是转基因动物并对精子传递的DNA分子的最终命运留下了一个悬而未决的问题。两个这些发现有助于阐明SMGT的潜在分子机制：i）发现在ICSI分析中使用含DNA的去膜精子可提高真正转基因的产量小鼠，以及ii）鉴定成熟精子中的逆转录酶（RT）活性。什么时候？在卵母细胞显微注射之前，被膜破坏的精子细胞与DNA孵育序列整合在宿主基因组中，并且高比例的后代是真正的转基因。相反，在完整的精子中，外源DNA与质膜结合，因此被内化并经历两步反应，首先是RNA中的转录，然后是cDNA中的反转录副本；这些cDNA表现为转录活性逆转录基因，以非整合的形式传播染色体外结构并以非孟德尔方式传递给后代。我们已经打过电话了这种现象是由精子介导的“反向”基因转移（SMRGT）。这些结果指出了中心作用外源序列作为整合转基因或染色体外逆转录酶。后者强调了一种先前未被认可的跨代遗传，以及一种由RT依赖性机制介导的非孟德尔遗传形式。

SMGT各个领域的几位专家为此贡献了宝贵的知识电子书。本章综合了全书涵盖的关键概念评估SMGT的现状和有争议的方面。