监测使用达拉图单抗治疗的多发性骨髓瘤患者：挑出单克隆抗体干扰

血清样本采集

来自MM患者或健康捐赠者的人类血清样本来自商业来源（美国纽约州韦斯特伯里Biocrevision）或来自daratumumab治疗的患者（n=33）。在正在进行的研究（GEN503；ClinicalTrials.gov Identifier:NCT01615029）中，从达鲁图单抗（GEN501和SIRIUS）或与来那度胺联合治疗的临床试验中采集的血清样本，收集在2.5或8.5 mL血清分离管中（美国新泽西州富兰克林湖区Becton Dickinson），并在1300-2000×克在室温下保持10–15分钟，30分钟后，使血液完全凝结/冷却。收集血清样本并运送（冷冻）至中央实验室（比利时根特BARC）进行SPE和IFE或随后的DIRA测试。低水平（<5 g/L）或SPE阴性但IgGκIFE重复阳性的患者被标记为具有潜在的daratumumab干扰，并用于验证和DIRA测试。样本基于疑似干扰而非预定义的时间点。临床试验由独立机构审查委员会根据赫尔辛基宣言和良好临床实践在研究地点批准。所有患者都提供了书面知情同意书。

抗花生四烯酸抗体

从杂交瘤细胞系（荷兰乌得勒支Genmab）中制备了鼠抗daratumumab抗体克隆（5–3–9–4）（Johnson&Johnson，New Brunswick，NJ，USA）。使用切向流过滤（Millipore，Billerica，MA，USA）浓缩培养细胞的上清液，用MabSelectSure（GE Healthcare，Marlborough，MA，US）纯化，并透析到Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水中，pH 7.2（美国纽约州格兰德岛生命科技公司）。

IFE和SPE

使用Maxikit Hydragel 4IF或9IF对半自动Hydrasys或Hydrasis 2进行免疫固定（Sebia，Norcross，GA，USA）。使用毛细管蛋白6试剂盒（均来自塞尔维亚）对毛细管进行SPE。IFE和SPE均按照制造商的规范进行。

DIRA公司

对于DIRA，将抗daratumumab或生理盐水加入基线或Daratumamab处理的患者血清中，在室温下孵育15分钟，并根据前面描述的标准IFE方法通过电泳分离。将每个基线和达拉图单抗治疗的患者血清的一条通道固定为参考，并应用抗人、抗IgG或κ（Sebia）抗血清检测重链和轻链。电泳和染色完成后，对凝胶进行评估，以确定（1）对照组达鲁图单抗与抗达鲁图单抗的迁移情况，（2）基线M蛋白与抗达罗图单抗的结合缺乏迁移，（3）daratumumab处理的血清样本中假定的daratumumab-带相对于daratumamab对照的迁移模式发生了变化，以及（4）是否存在非daratummuab M-蛋白带。缺乏剩余疾病M蛋白被定义为DIRA阴性结果。剩余疾病M蛋白的存在符合DIRA阳性结果。

灵敏度极限

用0.25、0.5和1.0 g/L daratumumab（含和不含抗Daratumamab）以1:1的比例添加10份商业MM样品，以确定抗Daratomumab的有效性和再现性，以转移Daratummuab谱带。另外10份MM血清样品和10份正常人血清（NHS）样品以1:1的比例添加了更广泛的临床相关浓度的达鲁图单抗（0、0.1、0.2、0.25和0.5 g/L），其中含有或不含有抗达鲁图单抗。两名独立评审员对结果进行了评估。

灵敏度极限被定义为在所有测试样品中通过至少一个参数（IFE检测到的daratumumab IgG、daratumamab+抗daratummuab复合物IgG，daratumomabκ或daratumab+抗-daratumumabκ；SPE检测到的Daratumumba或daratomumab+anti-daratummab）检测到的最低水平。

特异性

为了证明抗daratumumab抗体不会改变内源性M蛋白迁移，从51例MM患者的市售血清样本中加入Daratumamab、抗daratumamb或daratumumab+anti-daratummab（0.5 g/L和1 g/L；1:1比例），并通过IFE进行分析。此外，一个子集（n=35）评估了1 g/L抗达鲁图单抗和0.5 g/L达鲁图单抗的固定浓度。评估凝胶时，要确定daratumumab是否发生了变化，而仅抗Daratumamab的M蛋白没有相应的变化。此外，在每一次DIRA分析中，使用达鲁图单抗治疗前患者的对照血清样本中加入抗达鲁图单抗，并评估IFE中内源性M蛋白的变化。

再现性

使用DIRA对10份添加0.25、0.5和1 g/L daratumumab的商业样品和10份来自Daratumamab治疗的M蛋白≤5 g/L患者的样品进行了三次独立运行。两名独立评审员对结果的再现性进行了评估。评审员的评估使用预定义的评估标准进行了标准化。这些标准以及评审员对单个样本的回应如所示表1两名操作员在三天内分别使用三份商业MM样品评估了日间和操作间再现性，并由两名独立评审员进行了解释。

Daratumumab可以与anti-daratumumba一起移动

为了确定是否可以通过SPE和IFE检测到daratumumab的变化，进行了加标实验，在骨髓瘤血清或NHS中添加不同浓度的Daratumamab（添加或不添加抗Daratummuab），并通过SPE或IFE进行分析。Daratumumab被有效检测到，并在所有测试样本中与抗Daratumamab一起转移。(图1A和数据未显示）。为了评估在IFE和SPE上完全转移达鲁图单抗所需的抗达鲁图单抗数量，将不同比例的抗达罗图单抗加入到含有1 g/L达鲁图双抗的血清中，即每周给药后患者血清中的最大预测浓度[15]. daratumumab与抗Daratumamab或过量抗daratumumab1:1的比例在IFE上完全转移了daratumamb(图1B). 人类抗血清未检测到过量的小鼠抗达拉图单抗。SPE车道密度测定显示，daratumumab的比例为1:1：要完全转移daratumamab，必须使用抗daratumomab；由于SPE无法从人类或小鼠抗体中识别总蛋白，因此过量的达鲁图单抗或抗达鲁图单抗也被视为蛋白质峰(图1C). 由于其对人抗体的特异性和更高的敏感性，IFE被用于开发DIRA。

图1：

Daratumumab可在IFE/SPE上识别，并可与anti-Daratumumab.一起移动。

Daratumumab可以被IFE检测到（A），抗Daratumumab抗体可以结合并改变Daratumumab在IFE上的迁移模式（B）；daratumumab与anti-daratumumab1:1的比例足以完全转移IFE上的daratumamab。同样，在SPE上，daratumumab与anti-daratumumab1:1的比例能够完全改变daratumamab（C）。Daratumumab和Daratumumab:反daratumomab复合物分别由蓝色和绿色箭头表示。IFE、免疫固定电泳；SPE，血清蛋白电泳；Dara，daratumumab。

DIRA区分daratumumab和内源性M蛋白

在参与daratumumab临床研究的患者中，IFE上经常观察到残留的IgGκ带或随着时间的推移出现的微弱的IgG-κ带。Daratumumab干扰被怀疑，有可能掩盖CR。DIRA用于通过SPE（≤5 g/L）和IFE的IgGκ带区分daratumumab和内源性M蛋白。探索性分析利用具有更高SPE范围的样品来帮助完善分析实施和验证的标准。图2显示了概述典型DIRA中的样本、控件和加载的示意图。

图2：

Daratumumab特异性IFE反射分析。

基线（治疗前）血清样本与疑似达鲁图单抗干扰的治疗后时间点的血清样本相邻，取±抗达鲁图单抗，以确定剩余的M蛋白带是否与抗达鲁图单抗完全移位。IgG和κ抗血清均用于染色和固定（A）。DIRA阳性，类似于IFE阳性，表明内源性M蛋白（红色，由通道1中的红色箭头指示）仍然存在。DIRA阴性，类似于IFE阴性，表示只剩下daratumumab（蓝色，由第3道的蓝色箭头指示），内源性M蛋白不再检测到（a）。DIRA模板使用daratumumab±anti-daratumamab作为治疗性抗体和daratummab-anti-dartumumab移位复合物迁移的控制物（绿色，由车道4中的绿色箭头指示）。在患者样本中，比较基线和治疗后血清±抗达鲁图单抗，以确定转移达鲁图单抗（B）后是否仍存在M蛋白。DIRA阳性结果显示M蛋白，而DIRA阴性结果仅显示daratumumab发生变化，但没有剩余的M蛋白（通道8和12）。IFE、免疫固定电泳；M蛋白、单克隆免疫球蛋白；DIRA，daratumumab特异性免疫固定电泳反射分析；达拉，达拉图穆马布；PBS，磷酸盐缓冲液；SP，血清总蛋白固定；G、 IgG抗血清；κ、 kappa抗血清。

DIRA评估患者样本在治疗前（基线）和治疗后（怀疑达拉图单抗干扰）。DIRA需要12个样本通道，使用一种蛋白固定剂和2种抗血清（IgG和κ；图2A). 通道1和通道2包括带有总蛋白固定剂的基线和治疗后样品，并显示基线和治疗前后所有血清蛋白的迁移模式。通道3和通道4分别是盐水中含有daratumumab和daratumumab+抗daratumamab的对照品。第5道和第6道（含抗IgG抗血清）分别包括基线样品和抗daratumumab，以表征内源性M蛋白迁移，并证明抗Daratomumab单独对内源性M蛋白质没有影响。第7道和第8道（含抗IgG抗血清）分别包括治疗后样本和抗daratumumab，以表征Daratumamab并确定疾病M蛋白是否残留。如果整个剩余的条带随着抗达拉图单抗的加入而移动，表明内源性M蛋白不存在，而只剩下达拉图单抗，则结果被确定为DIRA阴性（类似于标准IFE阴性结果；图2B). 如果带仅部分移动，表明内源性M蛋白仍然存在，则结果为DIRA阳性（类似于典型的IFE阳性结果；图2B). 通道9至12包含与通道5至8相同的样本，但使用抗κ抗血清进行检测。

DIRA的验证

为了进行临床验证，对商业和达鲁单抗治疗的骨髓瘤血清样本中DIRA的敏感性、特异性和再现性进行了评估。通过SPE和IFE评估10份骨髓瘤和10份NHS样品，并加入一定范围的达鲁图单抗±抗达鲁图单抗，从而确定敏感性。由于daratumumab或daratumumab-anti-daratumumab复合物有可能与M蛋白结合IgG或κ抗血清，因此通过至少一个参数检测来确定灵敏度（IFE检测daratumamab或daratumumab+抗daratummab复合物与IgG或者κ；SPE检测daratomumab或Daratummumab+anti-daratummumb复合物）。每个样品的灵敏度由任何这些参数都能检测到的最低达拉图单抗水平确定。在骨髓瘤血清样本中，IFE测定DIRA对0.1 g/L达鲁单抗的敏感性为90%，对0.2 g/L达罗单抗的灵敏度为100%。在NHS中，IFE对DIRA的敏感性为0.1 g/L达拉图单抗为80%，0.2 g/L为100%。通过SPE，MM血清中0.1 g/L的敏感性为30%，0.2g/L的灵敏度为100%，NHS中0.2 g/L的敏感度为100%。因此，DIRA对达拉图单抗的敏感性约为0.2 g/L。通常MM患者具有免疫抑制作用，因此背景多克隆干扰迄今尚未成为问题。在加标NHS样品中，不可能始终确定低于0.2 g/L的残留达鲁图单抗。虽然IFE和DIRA不是一种定量分析，但确定较低的灵敏度范围表明达鲁图单抗可以检测到，DIRA在治疗患者的预测血清浓度范围内起作用。

DIRA的特异性依赖于抗daratumumab的特异性。因此，DIRA包括含有添加或不添加抗达鲁单抗的基线血清样本的对照通道(图2，车道5和6）。在添加0.5或1 g/L达鲁图单抗的商业样品中，抗体在所有样品中的两种浓度下都被抗达鲁图单抗转移（51/51[100%]）。在任何样品中单独添加抗达拉图单抗后，M蛋白均未发生变化。当血清中只加入抗达拉图单抗时，51份（8%）样本中的4份（含IgG抗血清）中出现弱多克隆涂片。然而，这并不影响DIRA的解释，因为与daratumumab相对应的带：抗daratummuab复合物清晰可见，并且在有daratumum ab时未观察到涂片。虽然经验丰富的审查人员始终在DIRA分析中确定微弱的残留带，但在图2B这是一个已知的问题，琼脂糖凝胶上有微弱的条带；扫描凝胶的分辨率或细节与物理版本不同[20]. 因此，抗达拉图单抗似乎对达拉图单抗具有高度特异性。抗达鲁图单抗抗体的特异性，以及DIRA的假阴性和假阳性率，将在达鲁图单抗与对照的随机第3阶段临床研究中进行进一步评估。

通过对达拉图单抗处理的患者样品进行一式三份的检测，评估DIRA的再现性。在所有经达图单抗治疗的患者样本中（10/10），三个独立实验的结果是一致的。为了确定操作员间和日间再现性，两名操作员在三个单独的日子里对添加了达鲁图单抗±反达鲁图单单抗的商业样品进行DIRA。此外，两名独立评审员对结果进行了评估。在100%的分析中证明了审查之间的一致性。在三个单独的实验中，针对单个患者样本，显示了评审员对一组预定评估标准的反应(表1).

DIRA Plus公司

为了确保1 g/L的抗达鲁鲁单抗足以在达鲁鲁莫单抗浓度数据不可用或SPE测量值高于达鲁鲁穆单抗浓度平均范围的患者血清样本中转移达鲁鲁鲁莫单抗，使用增加浓度的抗达鲁图单抗（一种称为“DIRA Plus”的改良药物）对14名达鲁图单抗治疗患者的样本进行测试；图3). 在这些分析中，使用了浓度为1–4 g/L的抗达拉图单抗。在所有病例中（14个样本中的14个），1 g/L抗达拉图单抗足以解释DIRA。抗达拉图单抗浓度≥1 g/L会导致出现弱的多克隆涂片，与标准浓度1 g/L相比，检测结果没有其他变化。因此，既不保证也不建议使用浓度>1 g/L的抗达拉图单抗。

图3：

DIRA Plus用于评估血清达鲁单抗浓度高于正常范围的患者。

每升1克的抗达拉图单抗足以使达拉图单抗在所有样品中迁移（A）。在基线血清中添加更高浓度的抗达拉图单抗（1 g/L和4 g/L）导致出现带有IgG抗血清的微弱多克隆涂片（箭头）。DIRA，daratumumab特异性免疫固定电泳反射分析；达拉，达拉图穆马布；SP，血清总蛋白固定；G、 IgG抗血清；κ、 kappa抗血清。

将DIRA纳入临床测试

为了使DIRA测试的启动自动化，特别是对于有大量daratumumab治疗患者的第三阶段临床试验，设计了一种触发DIRA的操作“算法”。该算法规定，如果IFE中仅检测到IgGκM蛋白，尿液和FLC结果正常，则应在连续2次就诊时对SPE显示M蛋白水平≤2 g/L的患者进行DIRA检测(图4). 如果DIRA结果为阴性，患者将进行额外的测试以确认CR，包括骨髓浆细胞评估。如果DIRA结果呈阳性，表明仍存在疾病M蛋白，则无需额外检测，疾病监测将继续进行(图4).

图4：

测试用于临床反应评估的DIRA实现算法。

连续两次就诊，IgGκM蛋白≤2 g/L的患者的尿液和FLC正常，没有额外的M蛋白，是DIRA的良好候选样本。对于DIRA阴性样本的患者，有必要进行额外测试以确认假定的CR。DIRA，daratumumab特异性免疫固定电泳反射分析；M蛋白，单克隆免疫球蛋白；FLC，自由轻链；CR，完全响应。