人细胞因子阵列C5

• 易于使用
• 无需专用设备
• 几乎可与任何液体样品兼容
• 成熟的技术（许多出版物）
• 高灵敏度（pg/mL）
• 夹心ELISA特异性
• 密度高于ELISA、Western blot或基于珠的多重检测

C系列阵列具有化学发光信号检测功能。抗体被发现在硝化纤维素膜固体载体上，并以与蛋白质印迹非常相似的方式处理。
所有C系列阵列均基于夹心ELISA原理，利用一对匹配的抗体：一种固定化捕获抗体和一种相应的生物素化检测抗体。

1. 阻隔膜
2. 带样品培养
3. 生物素化检测抗体鸡尾酒培养
4. 用HRP-结合链霉亲和素培养
5. 用检测缓冲液培养
6. 化学发光成像系统成像
7. 进行密度测定和分析

如果可能，使用无血清条件培养基。如果需要含血清的条件培养基，强烈建议使用完整的培养基作为对照，因为许多类型的血清都含有细胞因子。我们建议您的样品采用以下参数：50至100µl原始或稀释血清、血浆、细胞培养基或其他体液，或50至500µg/ml蛋白质用于细胞和组织裂解液。如果您遇到高背景或荧光信号强度超过检测范围，建议进一步稀释样品。

1. 将每个膜放入提供的八孔托盘中（-表示抗体印刷面）。2.添加2 ml 1X封闭缓冲液，在室温下培养30分钟，以封闭膜。注：可在4°C下培养过夜。3.在室温下用1ml样品培养膜1至2小时。如有必要，使用1X缓冲液稀释样品。注：我们建议使用1 ml条件培养基或1 ml原始或10倍稀释的血清或血浆或50-500µg蛋白质作为细胞裂解物和组织裂解物。用1倍缓冲液将裂解液稀释至少10倍。注：使用的样本量取决于细胞因子的丰度。如果信号太弱，可以使用更多的样本。如果信号太强，样品可以进一步稀释。注：可在4°C下培养过夜。4.从每个容器中倾析样品，并在室温下用2ml 1X洗涤缓冲液I洗涤3次，同时振荡。每次洗涤请留出5分钟时间。用H2 O.5稀释20X洗涤缓冲液I。在室温下用2ml 1X洗涤缓冲液II摇晃洗涤2次。每次清洗5分钟。用H2 O.6稀释20X清洗缓冲液II。制备一抗工作液。向生物素结合抗细胞因子管中添加100µl 1X阻断缓冲液。轻轻混合，将所有混合物转移到含有2 ml 1X阻塞缓冲液的试管中。注：稀释后的生物素结合抗体可在4°C下保存2-3天。7.向每个膜中添加1 ml稀释的生物素结合抗体。在室温下培养1-2小时。注：可在4°C下培养过夜。8.按照步骤4和5中的说明进行清洗。9.向每个膜中添加2 ml 1000倍稀释的HRP-结合链霉亲和素（例如，向1998µl 1X封闭缓冲液中添加2µl HRP-共轭链霉亲和物）。注：使用前将含有1000X HRP-共轭链霉亲和素的试管充分混合，因为储存期间可能会形成沉淀。10.在室温下培养2小时。注：可在4°C下培养过夜。11.按照步骤4和5中的说明进行清洗。
   在检测过程中，不要让膜变干。检测过程必须在40分钟内完成，不得停止。1.继续进行检测反应。为一个膜添加250µl的1X检测缓冲液C和250µl的1X测试缓冲液D，混合这两种溶液。用镊子垂直握住滤膜，排出多余的冲洗缓冲液。将膜蛋白面朝上（-标记位于蛋白面朝左上角）放在干净的塑料板上（套件中提供）。用移液管将混合的检测缓冲液移到膜上，并在室温下培养2分钟。确保检测混合物完全均匀地覆盖在膜上，没有任何气泡。2.用镊子垂直握住薄膜，并将边缘接触组织，以排出多余的检测试剂。轻轻地将膜，蛋白质面朝上，放在一张塑料板上（-标记位于蛋白质面朝左上角）。在阵列上用另一块塑料片覆盖。轻轻抹平所有气泡。避免对膜施加压力。3.将阵列暴露在x射线胶片上（我们建议使用柯达x-omat AR胶片），并使用胶片显影剂检测信号。或者可以使用化学发光成像系统直接从膜上检测信号。将薄膜曝光40秒，然后根据信号强度重新曝光薄膜。如果信号太强（背景太高），请缩短曝光时间（例如5-30秒）。如果信号太弱，则增加曝光时间（例如5-20分钟或过夜）。或者用1x HRP-共轭链霉亲和素将膜重新培养过夜，并在第二天重新检测。4.将膜保存在-20°C至-80°C的温度范围内，以备将来参考。

阵列图像的视觉比较可能足以看到相对蛋白质表达的差异。然而，大多数研究人员希望使用二维密度计对信号强度（或更准确地说，信号密度）进行数值比较。凝胶/印迹记录系统和其他化学发光或磷光检测系统通常与兼容的密度测定软件一起销售。任何密度测定软件都应足以从扫描图像中获得斑点信号密度。NIH网站上免费提供了一个这样的软件程序ImageJ以及一个阵列插件。