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ICC协议

全面的ICC协议支持您的研究。
上次编辑时间2022年2月24日星期四

第1阶段-样品制备和固定

在ICC实验和储存期间，样品的固定是保持细胞形态的重要步骤。

在这个过程中，细胞在固定前直接在盖玻片上培养。

所需材料

  • 标准盖玻片或多孔板
  • 无菌PBS
  • 涂层用蛋白质（例如聚赖氨酸）
  • 无菌水

步骤

1

制备涂层溶液并过滤-必要时进行消毒

2

用涂层溶液涂敷盖玻片或板

  • 在室温下，孵化时间通常在1小时到24小时之间。   
三

用无菌PBS冲洗盖玻片三次

4

让盖玻片完全干燥。如果需要，在紫外线下消毒至少4小时

5

在涂有涂层的盖玻片或平板上培养细胞

6

测定细胞总数，检查细胞活力

  • 一般来说，生存能力应为90-95%。
7

制备固定剂，用选定的固定剂培养细胞

固定的条件
PBS中4%多聚甲醛（PFA）在室温下培养10-20分钟
甲醇（95-100%）在-20°C下培养5–10分钟
乙醇（95-100%）在-20°C下培养5–10分钟
丙酮在-20°C下培养5–10分钟
8

用清洗缓冲液清洗细胞三次

第2阶段-渗透（可选）

渗透将部分溶解细胞膜，使抗体到达细胞内表位。如果PFA用作固定剂，则尤其需要这样做。甲醇等有机溶剂通常同时渗透和固定细胞，因此当使用有机溶剂作为固定剂时，不严格要求渗透。

所需材料

  • 经过相关固定步骤的样品
  • 美国公共广播电视公司
  • 洗涤剂（见表1）
  • 疏水屏障笔（可选，示例ab2601）

步骤

1

通过在PBS中稀释洗涤剂，按以下方法制备渗透溶液：

表1：渗透洗涤剂
洗涤剂建议浓度方向
强力洗涤剂：Triton X-100、NP-40PBS中0.1–0.2%培养2-5分钟
温和清洁剂：吐温20、皂苷、洋地黄素、白介素PBS中0.2–0.5%培养2-5分钟
2

用渗透溶液覆盖细胞，并在室温下培养2-5分钟。

三

用PBS清洗细胞3次。

第3阶段-封锁

阻止步骤在ICC中特别重要，以防止图像中出现高背景染色。典型的阻断剂是与二级抗体（BSA）宿主物种相对应的2–10%血清蛋白溶液，BSA对物种依赖性较小，但阻断效率可能较低。封闭溶液不应含有初级抗体宿主动物的血清，因为这可能会导致高背景。

所需材料

  • 您的样品经过了相关固定和渗透步骤
  • 蛋白质阻滞剂
    • 二级抗体宿主物种的正常血清（例如：山羊ab7481；驴ab7475）
    • 英国标准协会
  • PBS（示例ab270748）
  • 甘氨酸

步骤

1

准备阻塞缓冲器

  • 将所选蛋白阻滞剂溶解在PBS中至2–10%w/v。
  • 加入浓度为0.1 M的甘氨酸（可选）。
阻隔剂何时使用
山羊血清ab7481如果用于检测的二级抗体在山羊体内产生
驴血清ab7475如果检测用的二级抗体是在驴身上培养的
英国标准协会通常与多种抗体相容
2

通过在阻断缓冲液中孵育细胞来阻断细胞

  • 在室温下培养1-2小时
三

继续进行抗体培养。

第4阶段-抗体培养

完成必要的阻断步骤后，您现在可以用抗体染色您的细胞了。这通常有两个原则：（i）直接ICC，一级抗体直接与荧光团结合；（ii）间接ICC，使用合适的荧光标记二级抗体检测一级抗体。这两种方法都有优点和缺点，这里将进行更详细的讨论。间接ICC是最常用的协议。

多色ICC涉及用两组或多组抗体对细胞进行染色，以揭示两种或多种感兴趣的蛋白质的分布或共定位。下面给出的间接和直接协议均可适用于多色ICC。如果间接ICC用于多色，强烈建议使用预先吸附的二级抗体。这些抗体被其他物种预先吸附，从而将使用的二级抗体与不同物种的一级抗体交叉反应的可能性降至最低。

所需材料

  • 经过相关渗透/阻塞步骤的细胞
  • 抗体稀释缓冲液PBS（示例ab270748）或PBS-T（具有0.1%吐温-20的PBS，示例ab128987）
  • 洗涤缓冲液PBS（实施例ab270748）或PBS-T（含有0.1%吐温-20的PBS，实施例ab128987）
  • 一级抗体
  • 共轭二级抗体
  • 憎水性阻隔笔（例如ab2601）-适用于载玻片或盖玻片上的小试管容量

步骤

1

确定要使用的最佳抗体稀释液。然后在抗体稀释缓冲液中稀释抗体。

  • 抗体数据表上通常会建议最佳稀释度。
2

在预先稀释的一级抗体中培养样本。

  • 在室温下培养2小时，或在4°C下过夜
三

用PBS或PBS-T清洗载玻片三次。

4

在抗体稀释缓冲液中制备二级抗体，并将样品浸入预先稀释的二级抗体中。

  • 在室温下培养1小时。
5

用PBS或PBS-T清洗样品三次

6

继续进行埋头染色、安装和成像

第5阶段-反染色和检测

ICC过程的最后一步是安装样本并检测信号。这包括将盖玻片添加到载玻片中（用于盖玻片上的细胞培养），或将盖玻板添加到载玻片上已有的样本中，到启用成像。

细胞核的典型反染色是DAPI（ab228549）、HOECHST 33342（ab225551）或DRAQ7（ab109202）。也有一些细胞器或细胞骨架的反染色可用（ab112124）。

所需材料

  • 荧光结合抗体染色的细胞
  • 荧光复染（可选，例如：DAPI ab228549）
  • 适合荧光检测的安装介质（用于盖玻片或载玻片上的电池）
  • 密封剂（用于盖玻片或玻片上的细胞-例如：指甲油或Limonene ab104141）
  • PBS（用于井中的细胞，例如ab270748）
  • 荧光显微镜

步骤

1

如果需要，将样品浸入复染溶液中。

  • 根据制造商的指导在室温下培养，或直到观察到所需的颜色。
2

安装样品。

示例格式程序
盖玻片或显微镜载玻片上的细胞
  • 在载玻片上滴几滴安装介质，并在室温下放置
  • 使用镊子将盖片放在滑块上。如果使用含水安装介质，请使用柠檬烯或指甲油密封。 
  • 密封后，将载玻片放在荧光显微镜上
井内生长的细胞
  • 用PBS或存储缓冲液覆盖样品（PBS中0.1%叠氮化钠）
  • 将样品直接置于倒置显微镜下。
三

使用适当的激发/发射滤波器组和/或激光器对样品进行成像。