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SQSTM1/p62是与泛素结合的适配器蛋白,可能参与调节TNF-α、NGF和NFKB1
可能参与肌细胞肌动蛋白/TTN公司下游信号转导。
可能通过泛素化调节信号级联。
可能参与细胞分化、凋亡、免疫应答和调控钾离子通道调控。
细胞质、晚期胞内体和细胞核(不同时期和类型的细胞中,其蛋白定位可能不完全一样。)
人(问题13501):1-2:39-48 kDa(预测)
(Q64337):1-2:44-48 kDa(预测)
(O08623):1-2:45-48 kDa(预测)3:26 kDa(预测)
磷酸化
泛素化
请注意不同样本中SQSTM1/p62的表达量存在差异,检测前需要确认靶标蛋白表达量。 推荐抗体产品说明书中使用的样本作为阳性对照。
SQSTM1/p62是泛素化相关蛋白,容易降解,在工作分解结构实验中易出现无信号、拖带现象。推荐制备新鲜裂解液,当天完成样品制备和跑胶。
由于组织相对于细胞样本成分更多、更复杂,在制备SQSTM1/p62的蛋白裂解液可以尝试加入MG-132(ab141003)、Esthout HeLa especiles胞+MG-132£¨10µM 4h£©+RIPA£¬防止一定程度的蛋白降解,获得单一条带。
SQSTM1/p62可被多种翻译后修饰,因此WB公司分子量大小可能与预测不符。
人肝和肾裂解液。
U-2操作系统、HCT116、HeLa软件
人 SQSTM1(第62页)HCT116阿司匹林(ab257052)
SQSTM1(第62页)HEK-293T代码(ab263770)
图三:WB-抗SQSTM1/p62(约207305)。
泳1:HCT116型全细胞裂解液; 泳道2:SQSTM1 CRISPR/Cas9编辑的HCT116全细胞裂解液;泳道3:HepG2全细胞裂解液;泳道4:希拉全细胞裂解液。
二抗:使用山羊抗兔IgG H&L(IRDye®800CW)预吸附床(ab216773号)二抗,浓度1/10000稀释。
预测条带大小:47千Da
检测条带大小:55千帕
图四:WB-抗-SQSTM1/p62(ab109012)
一抗:使用反SQSTM1/p62(ab109012),“1/1000”
泳1:MCF7(人乳腺癌上皮细胞)全细胞裂解液; 泳道2:小鼠大脑裂解液;泳道三:大鼠大脑裂解液;泳道4:小鼠肺裂解液;泳道第5页:大鼠肺裂解液;泳道6:小鼠心脏裂解液;泳道第7页:大鼠心脏裂解液。
二抗:使用抗狂犬病IgG H&L(HRP)(ab97051)二级,1/2万
检测条带大小:62千帕
关键控制点
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:
样本制备
使用新鲜制备的裂解液。
添加足够量的复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。
超声破碎样本,以获得更多的靶标蛋白。
中国
布拉德福德(Bradford)回报分析、劳里(Lowry)回报分析(BCA)分析测定样本总蛋白浓度。
封闭
延长封闭时间,考虑更换合适的封闭剂。Abcam 5%,BSA 3%分钟。这些可包含在抗体缓冲液中。
转膜
烈膜膜膜膜膜
一种
稀释一抗至合适浓度,以更高稀释度抗体孵育更长时间(耗时长但特异性结合最好。)
4℃孵育。