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白细胞介素1β是由许多不同类型的免疫和非免疫细胞,在迅速响应炎症信号后产生和释放的。
IL-1β家族成员的生物发生与其他细胞因子的不同之处在于,大多数白介素白介素-1是以非生物活性的酶原形式产生,然后经蛋白水解的成活性形式。髓系细胞中白介素-1贝塔(和IL-18)N端加工是由炎症小体的效应成分半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶
IL1号机组贝塔的产生分两步进行,每一步都受到不同刺激的调控。首先,炎症信号,如LPS,激pro-IL1贝塔的合成,并促进其在细胞质储存积累。然后炎症小体组装需要额外的信号,导致CASP1,pro-IL1贝塔加工,并最终以活性细胞因子形式分泌。
白介素-1贝塔通过与肿瘤坏死因子和IL6血管内皮生长因子的产生,在血管生成中发挥作用。
白介素-1贝塔在活化的单核细胞/巨噬细胞中表达(蛋白水平)。
白介素-1贝塔被脂多糖刺激表达。在巨噬细胞中的转录和翻译,白介素-1贝塔可被结核分枝杆菌和多种不同结核分枝杆菌组分刺激,其中EsxA公司是实验过最有效的激活子(在蛋白质水平)。在胰岛组织中,高糖治疗增加白介素-1贝塔的释放。在胰岛和巨噬细胞中,内源性大麻素anandamide/AEA IL-1贝塔的释放。
细胞质,溶酶体,外泌体,分泌。
前体在细胞质定位,响应炎性小体激活信号后,如NLRP3有效性ATP炎性小体的细菌鞭毛蛋白,被切割并分泌。
人(P01584):30.7 kDa(预测)
小龙虾(P10749):30.9 kDa(预测值)
鼠(Q63264):30.6 kDa(预测)
IL-1β前体的激活涉及CASP1公司催化的蛋白水解。加工和分泌是暂时相关的。
工作分解结构实验贴士
图三:WB-抗IL-1β抗体[EPR23851-127](ab254360型)
泳1:20微克RAW 264.7泳2:100纳克/毫升LPS处理7小时,然后在最后三小时加入300 ng/ml布雷费尔丁A处理的原始264.7中国 泳三:未处理的THP-1型全细胞裂解液 泳4:80纳米TPA公司过夜处理,然后100纳克/毫升LPS处理6小时,并在最后三小时加入布雷费尔丁A处理的THP-1型全细胞裂解液
一抗:使用抗IL-1β抗体[EPR23851-127],一,1/1000二抗:使用山羊抗狂犬病IgG H&L(HRP)(ab97051型)二抗,浓度1/50000稀释。
曝光时间:3分钟预测条带大小:三1 k个D类一 测试: 17.5,28, 31k个D类一 注意:白细胞介素1β的表达需要液化石油气诱导。31 千帕条带是前体形式的白细胞介素1β,28 千帕条带和17.5 千帕条带是蛋白水解的白细胞介素1β。表达模式、分子量与文献描述一致(PMID:844659419559631)。
图四:WB-Anti-IL-1β抗体[EPR21086](约216995)
泳1:20微克THP-1泳2:20 µ克 100纳克/毫升LPS处理三小时的THP-1型中国
一抗:使用抗IL-1β抗体[EPR21086]one抗,稀1/1000释二抗:使用山羊抗狂犬病IgG H&L(HRP)(ab97051型)二、1/100000稀释。
曝光时间:3分钟预测条带大小:31 k个D类一
图五:WB-抗IL-1β抗体[EPR16805-15](约234437)
泳1:10微克原264.7泳2:10 µ克100纳克/毫升LPS处理6小时,然后在最后三小时加入300 ng/ml布雷费尔丁A处理的原始264.7全细胞裂解液
一抗:使用抗IL-1β抗体[EPR16805-15]一种,β1/1000二抗:使用山羊抗狂犬病IgG H&L(HRP)(ab97051型)二抗,浓度1/100000稀释。
预测条带大小:31千Da测试:17, 28, 31 k个D类一
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:
样本制备
添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。
整个样本制备过程中,保持样本置于冰上。
布拉德福德(Bradford)回报分析、劳里(Lowry)回报分析(BCA)分析测定样本总蛋白浓度。
建议使用阳性和阴性对照。
电泳
至少上样20微克总蛋白进行电泳。
对于分子量较小的靶标蛋白(空气<25 kDa)请使用较高浓度的分离胶进行电泳。
转膜
强烈建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。
建议不要裁膜。