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组蛋白H3是核小体的核心成分。
DNA包裹并压缩成染色质,限制了DNA接近细胞内其它细胞器,它们的功能需要DNA工作
组蛋白在转录调控、DNA回复、DNA复制和染色体稳定性中发挥核心作用。
DNA可访问性是通过组蛋白的一系列复杂的翻译后修饰(也称为组蛋白编码)和核小体重构来调控的。
组蛋白H3是核小体的核心成分,超声处理的样品有助于富集更多的靶标蛋白,特别是核蛋白。
组蛋白通过不同的方式进行翻译后修饰,因此观察到的组蛋白H3的条带大小可能与预测的条带大小不一样。
组蛋白H3是一个分子量较小的蛋白,其预测分子量大小约为15千Da
【S】期表达,在分化过程中,随着细胞分裂减慢,表达量急剧下降。
细胞核
图二:组蛋白H3 ICC,抗-Histone H3(ab176842年)。绿色:组蛋白H3,:管蛋白,DAPI
p(P68431):15 kDa(预测值)
鼠(P84228):15 kDa(预测值)
(P84245):15 kDa(预测)
甲基化(三甲基化、二甲基化和单甲基化)
乙酰化,磷酸化,泛素化,瓜氨酸化
观察到的条带大小可能与预测大小不符。
超声破碎样品有助于富集更多靶标蛋白,从而解决无信号或弱信号现象。
组蛋白H3:HeLa(人宫颈腺癌上皮细胞)(约150035)。
更多阳性对照请参考我们的产品说明书推荐。
关键控制点
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:
样本制备
添加足够量的复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。
使用复合磷酸酶抑制剂,防止靶标蛋白被去磷酸化。
超声破碎样本,以获得更多的靶标蛋白。
整个样本制备过程尽量在冰浴进行,以防止蛋白降解。
布拉德福德(Bradford)回报分析、劳里(Lowry)回报分析(BCA)分析测定样本总蛋白浓度。
电泳
使用15%的分离胶
20微克总蛋白进行电泳。
转膜
0.22μm聚偏氟乙烯
建议转膜缓冲液中含20%甲醇。
强烈建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。