血浆置换治疗复杂区域性疼痛综合征患者的外显子microRNA特征

摘要

背景

治疗性血浆置换（PE）或血浆置换是一种用于治疗免疫性疾病的体外程序。外泌体是内体起源的纳米大小的囊泡，通过转运蛋白质和核酸介导细胞间通讯，并调节许多病理生理过程。外显体miRNAs是一种潜在的生物标记物，因为它们在包括复杂区域疼痛综合征（CRPS）在内的疾病中具有稳定性和调节异常，CRPS是一种慢性疼痛障碍，伴有持续炎症。之前的一项研究表明，一部分CRPS患者对PE有反应。

方法

作为证据，我们调查了6例CRPS患者中PE诱导的外体miRNA变化。用HPLC测定血浆细胞因子水平并与miRNA表达相关。HEK293细胞与靶3′UTR构建物和miRNA模拟物共转染后的荧光素酶检测用于评估miRNA介导的靶mRNA基因调控。THP-1细胞与miRNA模拟体瞬时转染，然后评估靶基因和蛋白表达，以验证发现。

结果

对三名应答者和三名应答较差者血清外显子中的miRNAs进行比较，发现治疗前后17个miRNAss存在显著差异。其中，应答不良者的外体hsa-miR-338-5p较低。我们发现，miR-338-5p可以与白细胞介素6（IL-6）3′非翻译区结合，并在体外调节IL-6 mRNA和蛋白水平。PE导致CRPS患者IL-6显著降低。

结论

我们认为，低应答者预处理miR-338-5p水平的降低与IL-6水平和CRPS炎症有关。我们的数据表明，探索外体miRNAs作为患者分层策略以最大化PE治疗结果的可行性。

背景

治疗性血浆置换或血浆交换（PE）是一种体外血液净化技术，旨在清除大分子物质[1]. PE作为血液净化技术的合理选择，至少应满足以下条件之一。待去除的物质足够大（≥15 kDa），半衰期相对较长，因此其去除可提供降低血清浓度的治疗有益期，或临床表明可快速去除对常规治疗有抵抗力的剧毒物质[1]. PE是一种在许多免疫性肾脏和神经疾病中广泛使用的治疗程序，能够清除致病性抗体和循环免疫复合物，从而导致炎症。PE通常与免疫抑制疗法结合使用，在过去40年中，PE导致这些疾病的生存率稳步提高，且未经治疗预后不良[2].

复杂区域疼痛综合征（CRPS）是一种慢性神经病理性疼痛障碍，患者群体具有不同的症状，包括感觉、运动和自主神经功能障碍。这种致残性疾病的特征是痛觉超敏（非伤害性刺激引起的疼痛）、痛觉过敏（对疼痛的敏感性增强）、皮肤颜色、温度、水肿、头发、皮肤或指甲的改变、肌张力障碍和震颤[三，4]. CRPS的病理生理机制尚不完全清楚，尽管已观察到与抗肾上腺素受体自身抗体的中度关联[5]. PE可以清除促炎细胞因子、免疫复合物和肾上腺素受体自身抗体，从而缓解局部和全身症状[6，7，8，9]. 最近的一项研究报告称，PE对一部分表皮神经纤维密度降低的CRPS患者有效，与小纤维神经病一致，33名患者中有30名（91%）报告疼痛缓解[10].

除了高分子量实体外，血浆还包含细胞外囊泡，包括30–150 nm外泌体。这些循环外泌体由多种细胞类型分泌，并运输各种货物分子，包括miRNA、长非编码RNA、mRNA、脂质、DNA和蛋白质。外泌体的释放和摄取在细胞间通讯中起着重要作用[11]. 外泌体的含量是在体内平衡状态下调节的，通常在病理之前或之后出现调节障碍[12，13]. 循环miRNAs的不同表达模式与许多疾病相关[14]. miRNAs作为基因表达的微调器而被广泛认可，它们介导转录后调控，几乎影响细胞过程的所有方面，并且也通过外显体运输[11，15，16]. 这些小的非编码RNA通过6到8碱基对种子序列互补性主要与mRNA的3′非翻译区（3′UTR）结合来调节基因表达。结合后，miRNAs可以诱导mRNA降解或翻译抑制，从而负调控靶基因的表达[15，16].

最近的一项研究调查了血浆置换去除或减少循环中的miRNA是否能改善miRNA引起的病理改变[17]. 该研究评估了三名接受血浆置换术的系统性红斑狼疮患者的miRNAs，结果表明血浆中大量循环miRNA通过血浆置换分离出来[17]. 我们以前的研究表明，与对照组外显体相比，CRPS患者的外显体中有更多的循环miRNAs差异表达（或包装）[18]. 据我们所知，迄今为止还没有研究调查PE前后血清中的外显子组成。因此，我们试图确定将PE前后CRPS患者血清样本中外显子内转运的循环miRNAs作为潜在分子标志或生物标记物的可行性，通过对三名有反应的患者和三名对PE无反应的患者进行一项概念验证研究。

方法

标准方案批准、注册和患者同意

这是一项关于在德雷塞尔大学医学院疼痛诊所就诊的CRPS患者的回顾性病例系列研究，该诊所符合布达佩斯CRPS共识标准，并在2012年9月至2014年6月期间接受PE治疗。所有参与者在获得机构审查委员会批准的知情同意后，同意为本研究提供血样。

血浆置换和患者评估

要求患者在PE前后提供血样。排除自身免疫或免疫缺陷患者。对患者记录进行审查，从中获得有关人口统计学、CRPS症状和体征、病程和PE反应的数据。费城哈内曼大学医院对难治性CRPS患者进行了为期2周的PE检查。所有患者在PE前都进行了完全的心脏和神经心理清除。要求患者在术前、术中和术后使用11点数字评分量表（NRS）对其总体疼痛进行评分，评分范围为0（无痛）到10（可想象的最严重疼痛）。

外泌体的纳米颗粒追踪分析、电子显微镜和western blot分析表征

将来自CRPS患者的1毫升血清用等量PBS稀释，并在2000×克在4°C下保持30分钟。上清液在1×PBS中稀释至最终体积24 ml，并在12000×PBS下离心克在4°C下保持45分钟。上清液通过0.22µ过滤器过滤，并在110000×克在4°C下保持70分钟。获得的外泌体颗粒在25 ml 1×PBS中洗涤，无离子，并在110000×克在4°C下保持70分钟。将外泌体颗粒重悬于100µl PBS中，用于纳米颗粒跟踪分析、电子显微镜和蛋白质估计。

纳米粒子跟踪分析

根据制造商的协议（美国马萨诸塞州马尔文仪器公司），使用NanoSight NS300分析PBS中的外显子的大小和浓度。样品稀释至约10⁷–10⁹颗粒/ml，用注射泵连续注射，并拍摄三段视频（每段30秒）进行颗粒分析。使用NTA 3.2软件进行纳米粒子跟踪分析。

电子显微镜

将10微升PBS再悬浮外泌体涂敷在Ni-formvar格栅上，并在室温下培养20分钟。将格栅在50微升0.1 M Sorensen磷酸盐缓冲液（pH 7.2）滴上洗涤5秒，每次洗涤共五次。网格在whatman#1滤纸上垂直吸干。通过在4°C下将格栅在0.5%醋酸铀酰（在0.2%甲基纤维素溶液中）上培养10分钟，进行阴性染色和包埋。多余的溶液被吸干在沃特曼纸上，风干后在JEOL透射电子显微镜（JEM 1230）上成像。或者，对外显体标记CD81进行免疫标记，并用1%戊二醛交联，用6 nm金二级抗体进行探测，然后进行阴性染色和包埋。

蛋白质印迹

使用DC蛋白质分析法估算蛋白质浓度（美国加利福尼亚州Bio-Rad实验室）；从CRPS血清中分离的5µg外泌体在还原性12%SDS-PAGE上溶解，转移到PVDF膜上，并在Odyssey封闭缓冲液（927-51000，LI-COR Biosciences）中封闭2小时。将膜在兔抗CD63抗体（ab68418，Abcam）中于4°C孵育过夜，在TBST中洗涤三次，每次10分钟，并在山羊抗兔680RD IgG（925-68071，LI-COR Biosciences）中RT孵育45分钟，在TBSC中洗涤三遍，每次10 min，并在Odyssey Fc成像系统上成像。

外显子miRNA分析

按照制造商的方案，使用miRvana miRNA分离试剂盒（生命技术）从外显子中分离RNA。如前所述，使用Taqman低密度阵列微流体卡A和B版（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）对100 ng总RNA中的miRNAs进行分析[19]. CT值大于等于35的miRNA物种被视为未被检测。根据原始CT值使用2计算折叠变化^-ΔΔCT方法[20]. 所有样本中标准偏差最低的10个miRNAs的平均CT值被用作计算ΔCT的内源性对照。通过双尾配对t检验计算ΔCT值差异的统计显著性，以比较PE前后样本，并通过双尾独立t检验计算其他实验组的比较。使用0.05的p值阈值和2的折叠变化来选择实验组之间显著差异表达的miRNAs。

细胞培养

将从美国型培养物收集（ATCC）中获得的HEK293细胞保存在Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中，DMEM补充了37°C、5%CO中的10%胎牛血清₂人单核细胞THP-1细胞（TIB-202，ATCC）保存在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中。

荧光素酶报告试验

IL-6的3′UTR荧光素酶报告子构建物（NM_000600.2）购自GeneCopoeia。人类miR-338-5p（MC12825）、抗miR-338（MH12825）和干扰阴性对照（4464058）的miRNA模拟物购自Life technologies。使用Lipofectamine LTX（加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）将mir-338-5p、抗mir-338或miRNA加扰对照和荧光素酶报告质粒与HEK293细胞共转染48小时。根据制造商的说明，使用Luc-Pair miR荧光素酶检测试剂盒（GeneCopoeia）测量萤火虫和Renilla荧光素素酶活性。萤火虫荧光素酶测量值标准化为Renilla荧光素酶，用作转染对照。以控制百分比表示的数据是三个独立实验的平均值。

miR-338-5p在THP-1细胞中的过度表达

按照制造商的RNAiMax转染试剂方案进行转染，使用miR-338-5p或具有以下修饰的阴性对照。对于6孔板的每个孔，将7.5µl RNAiMax试剂稀释在150µl无血清培养基中，并将30 pmol miR-338-5p或对照模拟物分别稀释在150μl无血清介质中。合并稀释液并在室温下培养15分钟。将该转染复合物（300µl）添加到0.5×10⁶细胞/孔置于含有1.7 ml血清的培养基中，置于6孔板中，并在37°C下培养6小时，然后更换培养基。24 h后，在完整培养基中用1µg/ml脂多糖（LPS）处理细胞6 h。在所有实验中都使用了外显子耗尽培养基。通过135倍离心收集细胞克在4°C下保存5分钟，并将调节好的培养基保存在4°C。用1×PBS清洗细胞颗粒，并将其重新悬浮在含有0.5 U/µl RNAsin Plus（Promega；Madison，WI）的RNA裂解缓冲液（mirVana试剂盒；Life Technologies）中，用于RNA分离，或将其悬浮在含有蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific；Waltham，MA）的1×放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中，用于蛋白质分析。

mRNA的cDNA合成和qPCR

使用miRVana试剂盒（Life technologies）分离mRNA。使用Maxima cDNA合成试剂盒（Thermo Scientific）生成cDNA，使用2µl cDNA进行基于Taqman的定量实时mRNA分析，包括10µl Taqman Fast Universal聚合酶链反应（PCR）主混合液（2×）no AmpErase UNG（Life Technologies）、1µl塔克曼引物-探针（20×）、，在高达20µl的无核水中。采用GAPDH作为标准化因子，采用单因素方差分析进行统计分析。检测ID如下：Hs00985639_m1[IL-6]，4325792（GAPDH）（加利福尼亚州卡尔斯巴德应用生物系统公司）。

细胞培养液中IL-6的酶联免疫吸附试验（ELISA）

根据制造商的协议（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司），使用在THP-1细胞中miR-338-5p或对照miRNA转染后收集的上清液，使用人IL-6量化因子ELISA试剂盒（D6050）对分泌的IL-6进行ELISA。

患者血浆中细胞因子的测定

为了分离血浆，将血液收集到EDTA涂层（紫色顶部）真空吸尘器中。通过离心分离血浆（3000×克在4°C下保存15分钟），分成250µl等分样品，并在−70°C下储存，直到分析。使用MILLIPLEX MAP人类高灵敏度T细胞小组HSTCMAG-28SK（Millipore，Billerica，MA）测定14种细胞因子的血浆水平。IL-6和TNF-α的最低检测浓度分别为0.11和0.16 pg/ml。根据制造商的说明，所有分析均一式两份。在Luminex-200（德克萨斯州奥斯汀市Luminex）上测定分析结果。

统计分析

数据表示为三个或更多独立实验平均值的平均值±标准误差。学生t吨-通过检验确定统计学意义。采用单因素方差分析（ANOVA）分析治疗效果。平均值之间的成对比较采用事后邓内方法进行测试。错误概率第页 < 0.05被认为具有统计学意义。使用配对t检验和Bonferroni校正多个分析来分析细胞因子组。错误概率第页 < 0.00357被认为具有统计学意义。

结果

外泌体的分离和鉴定

从6名CRPS患者的血清中分离出外显子，回顾性地将其分为PE前后的3名应答者和3名无应答者（图1，表1). 外泌体在透射电子显微镜（TEM）下显示出低于100nm的尺寸（图2a、 b）。外泌体的特征是存在或富集内泌体衍生膜蛋白，如四spanins（CD9.CD63，CD81）、flotillins、Alix和Tsg101。使用免疫金标记技术通过TEM对CD81的这种特征性外体蛋白的存在进行了评估（图2c） CD63的western印迹（图2d） ●●●●。血清外泌体的纳米粒子追踪分析表明，微粒平均直径为85.7±0.9 nm，浓度为3.94×10¹¹ ± 1.6 × 10¹⁰颗粒/ml（图2e） ●●●●。在EV轨道上提交了外显子的分离、纯度和表征指标[21]EV测量得分为44%。

图1

血浆交换（PE）协议和下游分析样品采集示意图。在PE之前和之后的两周内再进行5-7次PE，采集CRPS患者的血液。血浆用于检测细胞因子，血清用于外显子分离和下游miRNA分析

表1 CRPS患者PE前后疼痛评估

图2

CRPS患者血清中纯化的外泌体的特征。采用差速超速离心法从CRPS患者血清中分离出外显子。在东芝H8000或JEM1230显微镜下通过TEM观察外泌体。外显子被固定，并用乙酸铀酰对其进行负染以观察形态(一，b条)或免疫标记外显体标记CD81，并在阴性染色后用6 nm金二级抗体探测(c（c）). 从PE患者血清中分离出的外显子蛋白_秒)在减少12%的SDS-PAGE上进行解析，并使用western blotting确认存在外体标记蛋白CD63(d日). 血清外泌体的纳米颗粒追踪分析表明，颗粒平均直径为85.7±0.9 nm，颗粒浓度为3.94×10¹¹ ± 1.6 × 10¹⁰颗粒/ml(e（电子）)

PE应答者和应答不良者表达的miRNAs差异

在PE前后，从6名CRPS患者中分离出的外显体miRNAs被用于分析总共754个miRNAs。在计算ΔCT时，将所有样本中具有最低标准偏差的10个miRNA的平均CT值用作内源性对照，不包括任何样本中CT值>35的miRNA。通过双尾配对t检验计算ΔCT值差异的统计显著性，以比较PE前和PE后样本，并通过双尾非配对t检验来比较其他实验组。使用0.05的p值阈值和2的折叠变化来选择实验组之间显著差异表达的miRNAs（表2，图三，其他文件1：表S1）。两组之间的比较用对数倍变化值表示。nb/rb的折叠变化为正数，这意味着nb高于rb。nb/rb比较的负折叠变化数意味着nb更低。为了研究PE前应答者和非应答者之间miRNA的差异表达，我们分析了预处理组的miRNA（表2第2列2，图三). 在治疗前应答者和无应答者之间存在显著差异的9种miRNA中，相对于应答者，有2种在无应答者中上调，7种在无应答者中下调。这表明，即使在PE之前，外泌体的分子特征也有所不同，可以进一步探索预测治疗反应的生物标志物潜力。为了确定治疗后应答者中哪些miRNA发生了变化，对治疗前后的miRNA谱进行了比较（表2，第3列）。两个miRNAs上调和两个下调治疗后，应答者中的四个miRNAs发生了显著变化（图三). 无应答者PE后两种miRNAs发生改变；然而，这些与应答者中观察到的miRNA变化不同。为了通过PE确定应答者和非应答者之间miRNA改变的差异，我们比较了每个患者miRNA水平的变化。本荟萃分析的结果（表2，第5列）显示了9种miRNAs，它们在应答者和低应答者中具有不同程度的变化。例如，hsa-let-7a在应答者和非应答者中均下调，但应答者的变化程度是非应答者的4.5倍。

表2接受血浆置换（PE）的CRPS患者外体miRNAs的相对表达

图3

接受血浆置换的CRPS患者外泌体miRNA的表达。文氏图显示了PE前和PE后2周从6名CRPS患者的血清外泌体中评估的各种miRNA的相对表达。比较了PE前（b）和PE后应答者（R）和应答不良者（N）的miRNA水平。上调的miRNA以绿色显示，下调的miRNAs以红色显示，而比较组间常见但方向性不同的miRNAs为深红色。显著性通过学生t检验确定（p<0.05）

为了确定这些miRNA的潜在功能，我们采用了生物信息学算法Targetscan和miRDB的组合，根据miRNA序列在mRNA靶区的假定3′UTR内进行特定碱基配对的能力预测miRNA靶区[22，23]. 在促炎靶点中，IL-6是miR-19a/b和miR-338-5p的首选靶点[22，24]. miR-19对IL-6的调节作用已被证实，并被证明是通过miR-19a和miR-19b与Toll样受体2的结合间接介导的[25]. 然而，miR-338-5p在炎症或CRPS中的作用尚未探索。这使我们研究了miR-338-5p在调节炎症反应中的生物学作用。

miR-338-5p与预测靶点的3′UTR结合的确认

预测miR-338-5p和IL-6 mRNA的相互作用（图4a） 采用荧光素酶报告试验进行研究。利用荧光素酶开放阅读框下游克隆的携带miR-338-5p结合位点的人IL-6的3′UTR来评估miRNA-mRNA结合。用编码报告基因3′UTR构建体和miR-338-5p模拟物、抗miR-338或miRNA对照的质粒瞬时转染HEK293细胞。萤火虫萤光素酶测量值被标准化为雷尼拉萤光素酶作为转染对照。转染miR-338-5p 48 h后，荧光素酶活性显著降低（p<0.05），证实miR-335-5p与IL-6 mRNA的3′UTR结合（图4b） ●●●●。抗miR是对靶miRNA的补充，用于研究特定miRNA的功能丧失效应。单独或与对照miRNA联合转染抗miR-338抗体不会改变相对发光，但当与miR-338-5p结合时，可显著逆转表明miRNA活性下调的抑制作用。

图4

荧光素酶分析以确定miR-338-5p与预测mRNA靶点的3′UTR的结合。一人IL6 mRNA 3′-非翻译区的miR-338-5p靶向序列。b条将荧光素酶开放阅读框下游克隆的IL-6 3′UTR质粒与miR-338-5p、抗miR-338或对照miRNA模拟物共同转染HEK293细胞。转染48小时后测量荧光素酶活性，数据以发光百分比表示。萤火虫荧光素酶测量值按Renilla标准化，并显示了三个独立实验的平均值。使用Student t检验计算与对照组的统计显著性差异，*p<0.05

miR-338-5p对IL-6 mRNA的转录和翻译调控

接下来，我们评估了miR-338-5p在体外调节促炎IL-6 mRNA水平的能力。正常/非刺激免疫细胞中的IL-6 mRNA和蛋白水平通常很低。因此，为了评估miR-338-5p对IL-6 mRNA的显著影响，我们用细菌脂多糖（LPS）刺激人类单核细胞白血病（THP-1）细胞。用miR-338-5p模拟物或对照miRNA转染THP-1细胞18 h，然后用LPS（1µg/ml）刺激6 h，然后通过qPCR测定靶mRNA的内源性水平。与对照miRNA转染相比，miR-338-5p转染后IL-6 mRNA显著减少，表明miR-335-5p通过mRNA降解调节IL-6（图5a） ●●●●。用ELISA法分析转染miR-338-5p或对照的THP-1细胞经LPS刺激后的条件培养液中IL-6蛋白水平。miR-338-5p的过度表达显著降低了分泌到培养基中的IL-6蛋白水平（图5b） ●●●●。因此，miR-338-5p的过度表达导致IL-6的mRNA和蛋白水平下调。

图5

转染miR-338-5p的THP-1细胞中IL-6 mRNA和蛋白的表达水平，然后用LPS刺激6小时。一LPS诱导后IL-6内源性水平的Taqman分析表明，与对照miRNA（miR-ctrl）相比，miR-338-5p转染降低了IL-6转录物。b条miR-338-5p的过度表达降低了分泌的IL-6含量。使用经LPS刺激的THP-1细胞培养上清液的ELISA显示，与对照miRNA转染细胞相比，miR-338-5p转染细胞分泌的促炎介质水平较低。通过Dunnet事后检验的单因素方差分析确定显著性，***p<0.001

CRPS患者血浆细胞因子水平

持续炎症是CRPS的一个特征，多种生物液（包括血浆、血清、水疱液和脑脊液）中的促炎细胞因子上调已被证明[26]. 我们调查了14种细胞因子（附加文件2：表S2），其中只有IL-6在PE后有显著差异。由于miR-19和miR-338-5p都可以靶向IL-6，我们在18名患者的血浆样本库中调查了IL-6。PE后血浆IL-6水平显著降低（n=18），而TNFα水平没有变化（图6).

图6

血浆置换（PE）后CRPS患者血浆IL-6和TNF-α水平的变化。在PE前和PE后2周评估18例CRPS患者血浆中IL6和TNFα的水平。PE后IL-6显著降低，但TNFα没有降低。通过学生配对t检验确定显著性（***p<0.001）

讨论

来自内吞途径的外显子含有生物分子物质，可以反映分泌这些物质的细胞的生理状态[27]. 因此，外泌体提供了指示由疾病或治疗干预引起的变化的分子特征的快照。此外，外泌体转运的miRNA调节受体细胞中的基因表达[28]. PE对免疫学、代谢性疾病和中毒的疗效归因于其清除体液因子和自身抗体[2]. 也有报道称PE中T淋巴细胞活化、B淋巴细胞和促炎性血浆细胞因子减少[29]. 众所周知，CRPS很难治疗[三，4]；然而，很少有报道表明PE可以通过清除患者的自身抗体来控制症状[6，8，10，30]. 一项评估PE对临床表现为小纤维神经病变的难治性CRPS患者的疗效的研究表明，小纤维损失最大和温度感觉缺陷的患者更有可能从PE中获益[10]. 使用免疫调节剂和IVIG的多管齐下的方法，除了每周PE方案外，在这一以前耐药的患者组中观察到91%的疗效[10]. 在这些患者中，要么通过免疫调节疗法维持疼痛减轻，要么疼痛逐渐恢复到治疗前的水平。虽然在上述研究中取得了成功，但PE的治疗益处是可变的。此外，目前还没有普遍有效的治疗CRPS的方法，CRPS疼痛演变的机制或PE等治疗方法如何减轻CRPS疼痛尚不清楚。所有这些因素都需要识别预后生物标志物或分子标志物来预测PE的治疗效果。我们研究了在PE前后研究CRPS患者血清中的外体miRNAs的可行性，以及其中一种差异表达的循环miRNA的调节作用。

分离的外泌体的纯度和完整性符合国际细胞外囊泡学会提出的指南[21，31]并且所报告的EV-METRIC评分是基于所使用的实验参数。在PE应答者和非应答者的外显体中观察到几种miRNA的差异表达。由于这是一项回顾性研究，治疗结果已知，我们通过比较应答者和无应答者的预处理组，询问外显体miRNA特征在PE之前是否存在差异。我们的分析显示，在治疗前，有应答者和无应答者之间有9种miRNAs的差异表达，表明两组患者存在异质性。当比较PE前后样本时，PE诱导的miRNA变化在应答者和非应答者之间也存在差异，这进一步证实了这一点。上述两项观察结果与之前一项研究一致，该研究调查了接受氯胺酮治疗的CRPS患者全血中循环miRNAs[32].

在差异表达的miRNAs中，与应答者相比，miR-338-5p在应答不良者中表达下调。虽然疼痛发生的机制尚不清楚，但炎症在CRPS中起着至关重要的作用。与对照组相比，CRPS患者的促炎细胞因子显著增加[26]. 基于生物信息学预测，miR-338-5p可以结合伊尔6mRNA，我们试图确认它们之间的相互作用。miR-338-5p的种子序列为ACAAUAU。体外验证研究证实了miR-338-5p和IL-6之间的相互作用。PE前应答者血浆中IL-6水平较高，PE后显著降低。因此，PE引起的IL-6清除可直接促进炎症减轻。我们对应答者和低应答者的分离研究表明，应答者较高的IL-6水平（PE前）与miR-338-5p水平有关。换句话说，应答者中较高的IL-6水平可能通过外体miR-338-5p介导细胞间信号传导以解决炎症，当PE将促炎IL-6从循环中清除时，外体miR338-5p也显著降低（表2，其他文件2：表S2）。PE后，低应答者的血浆IL-6没有显著降低，因此外体miR-338-5p水平没有显著变化。综上所述，这些数据表明，结合细胞因子分析确定外显子转运的miRNAs的表达水平可能是一种可行的患者分层方法，并可能有助于预测PE的疗效。

我们研究的局限性在于患者数量少（n=6），且具有回顾性，包括非随机化。另一个需要考虑的方面是与CRPS相关的共病，它们如何促进和影响炎症和疼痛。我们之前观察到，与有反应的患者相比，对氯胺酮反应不佳的CRPS患者的体重指数（BMI）较低[33]. 在这里，我们观察到，所有三名应答者的BMI都很高，三分之二的应答不良者BMI较低。需要对更大的患者队列进行额外的研究，并对一系列免疫标记物进行分析，以进一步调查这些初步观察结果。

结论

本研究首次证明了接受PE治疗的CRPS患者外体miRNA的差异调节。我们的概念验证研究表明，在PE治疗前后研究外体miRNA是一种可行的方法，可以用于识别分子标记，以预测潜在的治疗反应。整合各种组学数据的系统生物学方法是识别与疾病相关的明确分子模式所必需的。需要对多个地点的生物银行提供的大量样本进行这些研究，以确定与疾病相关的标记，并阐明疾病状态下改变的生物途径和过程[34].