Vemurafenib耐药性使黑色素瘤细胞重新编程为谷氨酰胺依赖性细胞

摘要

背景

^V600型 BRAF公司突变驱动大约50%的转移性黑色素瘤，其可以被BRAF抑制剂（BRAFi）和基于耐药性机制的BRAF和MEK抑制剂的组合（BRAFi+MEKi）靶向治疗。尽管联合治疗已被证明具有优越的临床效益，但获得性耐药性仍然普遍存在，并限制了总体生存效益。最近的研究表明，致癌变化可以导致肿瘤细胞代谢的改变，使细胞对营养物质（如谷氨酰胺氨基酸）产生依赖性。在这里，我们评估了获得性耐药的黑色素瘤细胞是否表现出谷氨酰胺依赖性，以及谷氨酰胺代谢是否可以成为治疗耐药细胞的潜在分子靶点。

方法

同基因BRAFi敏感父母^V600版本 BRAF公司使用突变黑色素瘤细胞系和耐药（通过vemurafenib慢性治疗获得）亚系评估谷氨酰胺摄取和谷氨酰胺剥夺敏感性的差异。为了评估更广泛的抗性机制，还研究了亚系对BRAFi+MEKi具有抗性的等基因对。由于耐药细胞对谷氨酰胺缺乏症的敏感性增加，我们使用了谷氨酰胺酶抑制剂BPTES[双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚]和L-左旋-DON（6-Diazo-5-oxo-我-去甲亮氨酸）治疗体内外MAPK途径抑制剂（MAPKi）耐药细胞群。

结果

我们证明，与MAPKi敏感细胞相比，MAPKi获得的耐药细胞摄取更多的谷氨酰胺，并且对谷氨酰胺缺乏的敏感性增加。此外，发现BPTES和L-DON在降低MAPKi耐药亚系细胞存活率方面比亲本细胞群更有效。我们还展示了突变体美国国家科学院对突变株谷氨酰胺成瘾至关重要美国国家科学院驱动阻力。当在体内测试时，我们发现来源于耐药细胞的异种移植物比来源于亲代细胞的异种移植物对BPTES或L-DON治疗更敏感。

结论

我们的研究证明了靶向谷氨酰胺代谢作为抑制黑色素瘤获得性MAPKi耐药性的替代策略的潜力。

背景

黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌之一，每年约有76100人受到影响，2014年约有9710人死亡[1,2]. 据美国癌症协会称，过去30年来，黑色素瘤的发病率一直在稳步上升[2]. 肿瘤基因突变BRAF公司在大约50-70%的转移性黑色素瘤中发现了编码丝氨酸-苏氨酸激酶的基因，该激酶是RAS–RAF–MEK–ERK信号级联的重要组成部分[1,三]. 中的突变BRAF公司通常在缬氨酸转化为谷氨酸的残渣600中发现(^V600E型 BRAF公司)导致BRAF激酶过度激活，导致细胞增殖失控和癌基因成瘾[1,4,5].

用小分子抑制剂如vemurafenib（PLX4032）和dabrafenib对BRAF激酶进行单药抑制，或将BRAF抑制剂与MEK1/2抑制剂如cobimetinib和trametinib进行双药联合，已相继证明可提高患者生存率[6–11]. 然而，即使双药合用具有卓越的疗效，疾病控制也常常因获得性耐药性的发展而中断。遗传抗性机制最常见的结果是通过以下途径重新激活MAPK途径美国国家科学院或KRAS公司突变，^V600E/K型 BRAF公司放大或替代拼接[5,12,13]. 相比之下，非遗传耐药机制通常导致MAPK路径冗余生存，受体酪氨酸激酶（如PDGFRβ）表达上调[5,12–14].

最近有研究表明，可以利用肿瘤细胞代谢来治疗癌症[15]. 20世纪20年代，奥托·沃伯格（Otto Warburg）发现癌细胞在有氧的情况下消耗非常高的葡萄糖并分泌大量的乳酸，被认为是“沃伯格效应”[15]. 这种低效消耗是为了满足肿瘤细胞中常见的生物合成和能量生产需求而设计的[16]. 研究表明，除了葡萄糖外，一些癌细胞还表现出“谷氨酰胺成瘾”，以支持刺激细胞增殖的合成代谢过程[17]. 谷氨酰胺已被证明是核苷酸和蛋白质合成所必需的氮的提供者，并影响蛋白质翻译的关键调节器，即雷帕霉素复合物（mTORC）的哺乳动物靶点1[17]. 研究还指出，致癌变化可以调节癌细胞中的谷氨酰胺代谢。例如，致癌c-myc与高亲和力谷氨酰胺转运体的转录调控有关，以促进谷氨酰胺水解[17]. 胰腺导管腺癌（PDAC）细胞也被证明强烈依赖谷氨酰胺，谷氨酰胺代谢的这种重新编程被发现是由致癌介导的关键代谢酶的转录上调驱动的KRAS公司[18]. 在黑色素瘤中，已有研究表明谷氨酰胺转运体ASCT2在^V600E型 BRAF公司突变型黑色素瘤，在谷氨酰胺摄取和细胞增殖中起关键作用[19]. 因此，破坏谷氨酰胺代谢可以作为治疗肿瘤的一种方法，这是非常合理的。

癌症细胞对谷氨酰胺上瘾的发现导致了旨在损害谷氨酰胺代谢的治疗方法。谷氨酰胺酶抑制剂的最新研究，谷氨酰胺酶是一种催化我-谷氨酰胺我-谷氨酸和氨对癌症的治疗潜力巨大。例如，6-重氮-5-氧代-1-去甲亮氨酸（L-DON）将谷氨酰胺酶靶向其活性部位以抑制肿瘤生长[20–22]. 另一种谷氨酰胺酶抑制剂，双-2-[5-（苯乙酰胺基）-1,3,4-噻二唑-2-基]乙基硫醚（BPTES）及其类似物显著抑制多种肿瘤类型（包括淋巴瘤、乳腺癌和胶质瘤）体内肿瘤异种移植物的生长和体外癌细胞的增殖[23–27].

在这项研究中，我们证明黑色素瘤抵抗细胞比其对vemurafenib敏感的细胞吸收谷氨酰胺的速度更快，对谷氨酰胺饥饿更敏感。此外，我们还表明，谷氨酰胺酶抑制剂BPTES和L-DON可用于体外有效治疗耐药细胞，并可用于体内治疗肿瘤。我们建议靶向谷氨酰胺代谢可作为一种替代治疗策略，以靶向对vemurafenib耐药的肿瘤。

方法

细胞培养

如前所述生成人类黑色素瘤亲代（vemurafenib敏感）系[4]. 简单地说，直接从患者活检中建立细胞，并在RPMI 1640培养基中培养我-谷氨酰胺、10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素和两性霉素[4]. M229父母之前被描述为BRAF^V600E型纯合子和M249亲本被描述为^V600E型BRAF杂合，对vemurafenib介导的体内外生长抑制同样敏感[4]. 细胞保存在含有10%胎牛血清（Omega Scientific，Inc）和4 mM的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中我-谷氨酰胺（Omega Scientific，Inc）。

Vemurafenib（PLX 4032）单药耐药（SDR）子线M249和M229^V600E型 BRAF公司慢性接触vemurafenib在体外产生阳性突变[12]. 简言之，M229亲本系每3天用1 mM的PLX4032处理4-6周，以获得克隆克隆[12]. PDGFRβRNA上调被发现有助于M229耐药性[12]. 通过连续滴定PLX4032至10 mM得到M249抗性亚系[12]. M249抗性子线显示为美国国家科学院（Q61K）激活突变在亲代M249细胞系中不存在，该突变被证明有助于抵抗[12]. M249和M229耐药细胞用10%胎牛血清（Omega Scientific，Inc）保存在DMEM中，4 Mm我-谷氨酰胺（Omega Scientific，Inc）和1μM vemurafenib（PLX4032）（Plexxikon）。

如前所述，产生了双BRAF抑制剂（vemurafenib）和MEK抑制剂（selumetinib）耐药细胞系[28]. 简言之，M249 DDR5双耐药细胞系（DDR）是通过用vemurafenib和selumetinib增量处理M249亲本细胞系而产生的，并且含有这两种突变^V600E型 BRAF公司放大和^129层 MEK1型突变[28]. M249双耐药细胞在上述含有1μM vemurafenib（Plexxikon）和1μM selumetinib（Selleck化学品）的培养基中培养。

营养素摄入

父母和单个耐药细胞以2×10接种⁵和1×10⁵细胞/孔，分别置于6孔板中，一式三份，并允许培养过夜。只将培养基作为亲代细胞和耐药细胞的对照。在细胞达到60%汇合后的24和48小时，收集细胞培养基并转移到微离心管中，然后放置在Nova Bioprofiler 100plus分析仪（Nova生物医学）中，以测量营养吸收。此外，使用Biorad TC20自动细胞计数器对细胞进行计数。测量后，从读数中减去纯培养基对照值，并计算值/细胞。

DIMSCAN细胞体外细胞毒性试验

将M249和M229亲本、单药耐药（SDR）细胞和M249 DDR5双药耐药细胞（DDR）分别接种在3000个细胞/孔和2000个细胞/井的96孔板中。在处理之前，允许细胞沉淀过夜。过夜培养后，用1×PBS清洗细胞，以去除培养基的痕迹。亲代细胞用有或无培养基处理我-谷氨酰胺或d日-葡萄糖，10μM BPTES[双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚]（LT Pharma，Inc.）或10μM L-DON（6-二唑-5-氧代-我-去甲亮氨酸）（Sigma-Aldrich）单独使用。单一耐药细胞与1μM vemurafenib联合治疗。联合1μM vemurafenib和1μM selumetinib处理双耐药细胞。将BPTES储备溶液溶解在DMSO中，使其最终工作浓度为10 mM，并储存在−20°C下。将L-DON溶解在水中，最终浓度为100 mM，并储存在−20°C下。每口井都添加了二甲基亚砜和纯水控制。细胞也用不含谷氨酰胺或含葡萄糖的透析胎牛血清的培养基处理（Gemini Scientific）。将处理过的细胞培养24、48和72小时。为了准备DIMSCAN分析，将0.5%曙红Y添加到96孔板上孔之间的空间。将10 mg/ml的荧光素二乙酸酯（FDA）溶液加入0.5%曙红Y溶液中，使其达到40μg/ml的工作浓度，加入细胞中。培养20分钟后，使用基于荧光的数字图像显微镜系统DIMSCAN对细胞进行荧光扫描[29]. DTT（洛杉矶儿童医院）使用DIMSCAN数据分析仪对结果进行分析，以获得存活率。

蛋白质斑点

将M249和M229亲本和单个耐药细胞接种在6 cm的培养皿中过夜，第二天获得60%的融合。用1×PBS洗涤细胞。向细胞中添加含有或不含谷氨酰胺的培养基。24小时后，用RIPA缓冲液对细胞进行裂解，蛋白酶抑制剂和裂解产物在SDS凝胶上运行。将凝胶转移到硝化纤维素膜上，并用抗切割PARP（细胞信号技术）检测以评估细胞凋亡。

AnnexinV/DAPI染色

M249和M229电池以5×10的速度电镀⁴（父母）和4×10⁴12孔板中的细胞（抗性）。在4×10的条件下对双抗药性线进行电镀⁴12孔板中的细胞。在过夜培养并达到60%融合后，使用电子生物科学试剂和Annexin V染色方案，用荧光染色结合的AnnexinV和碘化丙啶对细胞进行染色。细胞采集是使用来自Beckman Coulter（美国佛罗里达州迈阿密）的9色CyAn ADP完成的。本出版物中报告的研究包括在国家卫生研究院国家癌症研究所支持的分析细胞测定核心中进行的工作，编号为P30CA33572。使用FlowJo数据分析软件（美国俄勒冈州阿什兰）对细胞进行分析。

shRNA敲除

shRNA慢病毒颗粒（Sigma）被用于感染M249单药耐药细胞，感染率为50%，使用聚溴化六甲菊酯（Sigma-）。48小时后选择细胞进行嘌呤霉素耐药性（Sigma）检测。大量细胞群用于实验。使用定量PCR和测定美国国家科学院.

体内异种移植模型

所有动物研究都是根据希望城癌症中心批准的IACUC方案进行的。Nod Scid Gamma（NSG）小鼠注射5×10⁵在右侧皮下注射M249亲代或单一耐药细胞。当肿瘤大小达到平均100 mm时^三肿瘤细胞体积，小鼠每隔一天腹腔注射15 mg/kg BPTES或载体对照（DMSO）。测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积（mm^三)计算方法为（长×宽×宽）/2。NCr裸鼠（Taconic）注射2×10⁶右侧皮下接种M249单药耐药细胞。当肿瘤大小达到平均100 mm时^三，用20 mg/kg的L-DON或溶媒对照（水）每周治疗一次。

统计分析

所有体外实验一式三份进行，并至少重复三次。图中显示了具有代表性的实验。使用Graphpad软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行配对t检验，以计算代表性实验的p值。p<0.05以下的值被认为是显著的。

结果

韦姆拉非尼耐药细胞对谷氨酰胺的吸收和使用率高于韦姆拉非尼敏感细胞

我们首先旨在评估同基因BRAFi敏感亲本之间的营养吸收是否存在差异^V600型 BRAF公司突变黑色素瘤细胞系和单药耐药（通过vemurafenib慢性治疗获得）亚系。我们发现M249和M229单药耐药（SDR）细胞对谷氨酰胺的摄取量均高于其亲代细胞（图1a） ●●●●。众所周知，谷氨酰胺酶的活性会产生游离氨，因此，我们还测试了NH4⁺生产[15]. 我们发现M249和M229单药耐药细胞的氨生成量均高于亲代细胞，这表明谷氨酰胺的使用量较高（图1a） ●●●●。为了排除耐药细胞代谢普遍增加的可能性，我们还测量了M249和M229亲本和单药耐药细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成（图1b） ●●●●。与谷氨酰胺摄取相比，亲代和单个耐药细胞之间的葡萄糖摄取和乳酸生成没有显著差异（图1b） ●●●●。这些数据表明，与vemurafenib-sensitive（亲代）细胞群相比，单个耐药细胞的生长和增殖可能更依赖谷氨酰胺。

图1

维穆拉非尼耐药细胞对谷氨酰胺的吸收和使用率高于维穆拉芬尼敏感细胞。将黑色素瘤M249和M229 vemurafenib敏感（亲本）和单药耐药（SDR）细胞系镀成60%的融合细胞，隔夜培养后改变培养基。仅将Medium用作控件。然后培养细胞24小时。然后从生长细胞中取出培养基，测量谷氨酰胺摄取量、NH₄ ⁺如材料和方法所述，使用Nova Bioprofiler 100plus进行生产、葡萄糖摄取和乳酸生产。对细胞进行计数，结果表示为一每细胞谷氨酰胺摄取量（mmol/L）和NH₄ ⁺每细胞产量（mmol/L）和b条每个细胞的葡萄糖摄取量（mmol/L）和每个细胞的乳酸生成量（mmol/L）代表了三次实验的平均值（±标准偏差）。

维穆拉芬尼耐药细胞对谷氨酰胺缺乏更敏感

为了验证这一点，我们旨在剥夺M249和M229单药耐药细胞的谷氨酰胺和葡萄糖，以观察其对细胞存活的影响。我们发现M249和M229单药耐药（SDR）人群对谷氨酰胺缺乏比葡萄糖缺乏更敏感（图2a、 b）。此外，亲代和单个耐药细胞均被剥夺谷氨酰胺，并通过Western blot分析测量PARP裂解来检测细胞凋亡。与亲代细胞相比，M249和M229单药耐药细胞在谷氨酰胺缺乏时PARP裂解水平较高，表明凋亡水平增加（图2c、 d）。与Western blot结果相关，通过Annexin V染色测量，M249单药耐药株在谷氨酰胺剥夺后的凋亡细胞比亲本株多（图2e） ●●●●。为了进一步评估更广泛的耐药机制，还使用了具有获得性vemurafenib和MEK抑制剂双重耐药（DDR）的黑色素瘤等基因亚系。我们测试了含有这两种药物的双耐药（DDR）M249细胞系BRAF公司放大和MEK1型谷氨酰胺敏感性突变。与单一耐药株类似，M249双耐药株对谷氨酰胺缺乏比葡萄糖缺乏更敏感（图2f） 。此外，我们通过Annexin V染色检测谷氨酰胺剥夺后的细胞凋亡，发现M249双耐药细胞对谷氨酰胺剥夺也比亲代细胞更敏感（图2g） ●●●●。这些结果高度表明，耐药细胞的生存更依赖谷氨酰胺，并且用旨在阻断谷氨酰胺使用的抑制剂靶向谷氨酰胺代谢可能是特异性杀死vemurafenib耐药细胞的一种方法。

图2

Vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺缺乏更敏感。一黑色素瘤M249和b条M229单药耐药（SDR）细胞在含有或不含谷氨酰胺（Gln）或葡萄糖（Gluc）的培养基中培养。24小时后，使用微机荧光细胞毒性试验DIMSCAN（n=6，**p<0.01）显示代表性图像和与完全培养基中对照细胞相比的存活分数（存活率%）。Western blot分析也用于评估PARP裂解水平，作为两者凋亡的指标c（c）M249和d日M229亲本和SDR细胞系。e（电子）用AnnexinV和DAPI染色的M249亲代和耐药细胞流式细胞术检测细胞凋亡。M249亲本和SDR细胞在含有和不含谷氨酰胺的培养基中培养24小时。代表于斑点印迹以及AnnexinV阳性细胞的百分比。（f）黑色素瘤双药耐药（DDR）细胞株M249 DDR5在含有和不含谷氨酰胺（Gln）或葡萄糖（Gluc）的培养基中培养。24小时后，使用DIMSCAN（一种基于微机荧光的细胞毒性试验，n=6，***p<0.001）显示与完全培养基中的对照细胞相比的代表性图像和存活率（存活率%）。克用AnnexinV和DAPI染色的M249亲代细胞和DDR细胞流式细胞术检测细胞凋亡。M249亲本和DDR细胞在含有和不含谷氨酰胺的培养基中培养24小时。代表于斑点印迹以及AnnexinV阳性细胞的百分比。

Vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺酶抑制剂更敏感

为了测试我们是否可以以谷氨酰胺代谢为靶点治疗耐药细胞，我们使用谷氨酰胺酶抑制剂、BPTES和L-DON治疗父母和耐药细胞群。然后，我们评估了治疗后的细胞存活率，并观察了耐药细胞群是否对谷氨酰胺摄取更敏感。我们发现，尽管亲代和单药耐药群体对谷氨酰胺酶抑制剂BPTES和L-DON都敏感，但单药耐药细胞与vemurafenib联合使用更敏感，细胞存活率降低（图三a、 b）。为了进一步研究双耐药细胞系是否对谷氨酰胺酶抑制剂敏感，我们测试了M249双耐药细胞株在使用BPTES治疗后的存活率。我们发现双耐药株（类似于单耐药株）对BPTES的敏感性高于双亲（图三c） ●●●●。为了解决这种效应是否需要BRAF抑制或BRAF/MEK1抑制，我们在有或无BRAF/MEK抑制剂的情况下，分别用BPTES和无谷氨酰胺处理M249单药和双药耐药细胞系。我们发现，单药或双药耐药细胞系的治疗不需要抑制剂的存在就可以对谷氨酰胺缺乏或BPTES治疗敏感（图三d） ●●●●。这些结果表明，谷氨酰胺酶抑制剂可能被用作靶向耐药细胞群的策略。

图3

Vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺酶抑制剂更敏感。一M249和M229亲本单药耐药（SDR）细胞在培养基对照（DMSO）或10μM BPTES存在下培养48小时。将SDR细胞系与vemurafenib（1μM）和BPTES联合培养。使用DIMSCAN技术评估与载体对照（DMSO）相比的存活细胞百分比（存活率%）（n=6，***p<0.001，*p<0.05）。b条M249和M229亲本和单个耐药细胞在载体对照（水）或10μM L-DON存在下培养48小时。SDR细胞系接受vemurafenib（1μM）和L-DON的联合治疗。使用DIMSCAN技术评估与载体对照（DMSO）相比的存活细胞百分比（存活率%）（n=6，***p<0.001，*p<0.05）。c（c）M249亲本和双耐药（DDR）细胞在培养基对照（DMSO）或10μM BPTES存在下培养48小时。DDR细胞系与vemurafenib（1μM）、selumetinib（1μM）和BPTES联合培养。使用DIMSCAN技术评估与载体对照（DMSO）相比的存活细胞百分比（存活率%）（n=6，***p<0.001）。d日M249单（SDR）和双（DDR）耐药株在有或无抑制剂（1μM vemurafenib用于SDR，1μM Vemurafeni和1μM selumentib用于DDR）的情况下培养，然后用10μM BPTES或剥夺谷氨酰胺（Gln）处理48小时。使用DIMSCAN技术评估存活细胞分数与载体对照（DMSO）的百分比（存活率%）。

拆除美国国家科学院vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺酶抑制剂的敏感性降低

确定是否获得阻力美国国家科学院突变在M249耐药细胞向谷氨酰胺依赖性转化中起作用，这些细胞具有稳定的美国国家科学院使用短发夹RNA（shRNA）制备了打乱的shRNA对照物。首先，我们评估了shRNA是否能成功降低美国国家科学院在牢房里。事实上美国国家科学院shNRAS敲除细胞中的表达量大大低于对照水平（图4a） ●●●●。随后用BPTES处理对照组和shNRAS敲除细胞，并在培养基中不存在BRAF抑制剂vemurafenib的情况下评估细胞存活率。我们发现它被撞倒了美国国家科学院与对照细胞系相比，使细胞对谷氨酰胺酶抑制剂BPTES的敏感性降低（图4b） ●●●●。这些结果表明，耐药性在美国国家科学院有助于谷氨酰胺依赖性耐药细胞的重新编程。

图4

拆除美国国家科学院vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺酶抑制剂的敏感性降低。用shNRAS或shControl慢病毒颗粒感染黑色素瘤M249耐药细胞，48小时后筛选出对嘌呤霉素耐药的细胞。一定量PCR检测shControl和shNRAS感染细胞中NRAS的相对mRNA表达。b条shNRAS或shControl细胞在10μM BPTES存在下培养48小时或与载体对照（DMSO）一起培养。与载体对照（DMSO）相比，使用DIMSCAN分析测定存活细胞百分率（存活率%）（n=6，*p<0.05）。

韦拉非尼耐药黑色素瘤对谷氨酰胺酶抑制剂的体内治疗敏感

由于体外数据证明了谷氨酰胺酶抑制剂治疗耐药细胞系的潜力，我们询问这些抑制剂在体内是否也有效。为此，对NSG小鼠进行异种移植实验，给小鼠注射M249亲本（vemurafenib敏感）和M249单药耐药细胞系，然后用谷氨酰胺酶抑制剂BPTES治疗。如图所示5a、 与注射亲本（敏感）细胞的小鼠相比，注射M249单药耐药细胞的小鼠BPTES显著抑制肿瘤生长。由于BPTES治疗对亲代细胞的肿瘤生长影响最小，我们接下来重点验证使用不同的谷氨酰胺酶抑制剂L-DON靶向谷氨酰胺代谢是否有效抑制耐药肿瘤生长。同样，我们发现L-DON有效地阻止了对vemurafenib耐药的肿瘤生长（图5b） ●●●●。

图5

对Vemurafenib耐药的黑色素瘤对体内谷氨酰胺酶抑制剂治疗敏感。一Nod Scid Gamma（NSG）小鼠注射5×10⁶右侧皮下接种M249亲本或单个耐药细胞。当肿瘤大小达到平均100 mm时^三肿瘤细胞体积，每隔一天通过腹腔注射给予15 mg/kg BPTES或载体对照（DMSO）治疗。测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积（mm^三)通过乘以（长度×宽度×宽度）/2来计算。图表表示平均肿瘤体积±SD。b条裸鼠注射2×10⁶右侧皮下接种M249耐药细胞。当肿瘤大小达到平均100 mm时^三肿瘤细胞体积，每周两次通过腹腔注射给予20 mg/kg L-DON或溶媒对照（水）治疗。图表表示平均肿瘤体积±SD。

讨论

在此，我们证明，与对vemurafenib敏感的细胞相比，M249和M229抗vemuraffenib细胞已被重新编程，变得越来越依赖谷氨酰胺。此外，我们还发现，获得抗性增加了这些细胞对谷氨酰胺缺乏的敏感性。我们还证明，除了单药耐药株外，双药耐药株同时含有BRAF公司放大和MEK1型突变对谷氨酰胺缺乏变得敏感。我们成功地利用了这种对谷氨酰胺的敏感性，用谷氨酰胺酶抑制剂BPTES或L-DON和vemurafenib的组合杀死了这些单药和双药耐药细胞。在单药耐药和双药耐药病例中，观察到细胞存活率降低。此外，击倒美国国家科学院在M249耐药细胞中，这些细胞对这两种谷氨酰胺酶抑制剂的敏感性都降低了，这表明耐药获得性突变可能会影响对谷氨酰胺依赖性的增加。这些结果也在体内获得，因为用BPTES或L-DON注射M249单药耐药细胞治疗小鼠，导致肿瘤体积显著减少。

单药治疗BRAF抑制剂，如vemurafenib和dabrafenib，已证明改善了^V600E型 BRAF公司突变型黑色素瘤，目前已被美国食品和药物管理局批准用于治疗[13]. 此外，BRAF抑制剂与变构MEK1和MEK2抑制剂的联合治疗也在临床试验中，已批准用于治疗BRAF公司变异性黑色素瘤[7,13,28,30,31]. 然而，与单药治疗一样，BRAF和MEK抑制剂的联合治疗也通过进一步放大现有的耐药突变或激活MAPK通路，导致了耐药机制的发展[9,13,28]. 这些耐药机制导致了对替代治疗方案的需求[13]. 最近，使用针对程序性死亡1通路（PD-1）及其配体之一的拮抗抗体、程序性死亡配体1（PD-L1）和CTLA-4/B7（细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4）的阻断，阻断限制T细胞反应的免疫调节检查点与抗CTLA-4拮抗单克隆抗体（mAbs）的相互作用已证明在黑色素瘤患者中具有很高的临床益处[32,33]. 除了以免疫反应为靶点外，是否以代谢改变为靶点来治疗耐药黑色素瘤细胞尚不清楚。我们的研究表明，抑制谷氨酰胺代谢可能是治疗单抗和双抗肿瘤的一种很有前途的方法。

我们的数据表明，不同的耐药模型都可能导致“谷氨酰胺成瘾”，因此，确定这些细胞如何能够重新编程为谷氨酰胺依赖的优先代谢至关重要。未来，研究谷氨酰胺转运蛋白或参与谷氨酰胺代谢途径的代谢酶，以评估突变如何直接影响这些细胞的固有代谢，这一点非常重要。这将有助于开发更具靶向性的治疗方法，用于靶向谷氨酰胺依赖性肿瘤。

总的来说，这些数据表明，vemurafenib单药耐药株和vemuraffenib/selumetinib（MEK抑制剂）双药耐药株对谷氨酰胺和谷氨酰胺酶抑制剂都敏感。因此，靶向谷氨酰胺代谢可能是未来治疗vemurafenib耐药黑色素瘤的有用工具。

结论

目前，用于治疗对vemurafenib耐药的黑色素瘤的治疗包括结合BRAF和MEK抑制剂以靶向抑制MAPK通路。由于黑色素瘤的侵袭性及其即使在联合使用BRAF和MEK抑制剂治疗后也能产生耐药突变的独特能力，因此有必要开发替代疗法来规避耐药。我们的研究表明，靶向谷氨酰胺代谢可能是一种潜在的治疗vemurafenib耐药黑色素瘤的方法。