泼尼松龙和间充质干细胞预加载保护去细胞大鼠移植肝的肝细胞迁移并减轻细胞外基质修饰

摘要

介绍

再生医学为治疗慢性肝病提供了很有前途的方法。先前的研究表明，脱细胞的肝脏结构被侵入的非肝炎症细胞所破坏。本研究旨在利用骨髓源性间充质干细胞（BM-MSC）和泼尼松龙的抗炎和再生能力，减少纤维化，平衡炎性细胞向去细胞化肝支架的迁移。

材料和方法

通过灌注月桂醚硫酸钠（SLES）使肝脏脱细胞，通过DNA定量、组织化学和免疫组织化学评估确认细胞核耗竭和细胞外基质（ECM）保留。支架上植入BM-MSC、泼尼松龙或两者的组合，植入大鼠部分肝切除的解剖部位，并随访2周和4周。

结果

在移植支架中追踪标记的MS；然而，它们并没有迁移到完整的肝脏中。免疫组化显示肝母细胞、胆管细胞、星形细胞和卵圆形细胞侵入所有支架。胆管在支架和完整肝脏的边缘更丰富。体视学评估显示，泼尼松龙负载支架中的淋巴细胞和中性粒细胞数量显著减少。细胞/泼尼松龙负载生物支架治疗组的再生过程和血管生成显著高于对照组。与对照组相比，用细胞/泼尼松龙、泼尼松隆或骨髓基质干细胞预处理的支架中的胶原纤维显著减少。

结论

将泼尼松龙加载到支架中可能是限制移植后炎症的一种有价值的方法。虽然细胞/泼尼松龙联合预载支架不能减轻炎症，但它在再生和血管生成中发挥了重要作用。

介绍

肝脏对慢性病变的创伤愈合反应导致纤维化和肝硬化[1]. 作为主要的肝脏再生反应，常驻细胞和迁移细胞都参与了纤维化的形成。肝星状细胞在肝损伤反应中起着关键作用。在肝脏再生过程中，它们通过一个称为“激活”的过程发生形态和功能变化，并导致肝纤维化[2]. 肝星状细胞与受损肝细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞之间的相互作用可诱导纤维化。另一方面，与自然杀伤细胞的相互作用导致肝星状细胞死亡和纤维蛋白生成减少[三]. 在纤维形成过程中，ECM引起的体内平衡被破坏，产生大量ECM，包括I型和III型胶原。另一方面，基质金属蛋白酶（MMPs）降解ECM，并沉积副产物。还观察到胶原纤维的交联[4].

其他在慢性肝损伤发病机制中起作用的细胞是来源于肝脏本身（库普弗细胞）或循环单核细胞的肝巨噬细胞。巨噬细胞可以促进或逆转炎症和纤维形成，这取决于巨噬细胞的类型。库普弗细胞释放一些化学介质，导致中性粒细胞侵入肝脏。中性粒细胞参与肝脏修复，但其长期存在会导致蛋白酶和活性氧（ROS）的产生。受损的肝细胞产生细胞因子，如TGF-β、IL-1、CXCL10[5]. 这些细胞因子参与白细胞的募集并诱导纤维化[6,7]. 肝脏中存在多种类型的巨噬细胞，包括促炎性（M1）和组织愈合（M2）。M1巨噬细胞释放TNF-α、IL-6和IL-1并诱导炎症，而M2巨噬细胞产生IL-10、TGF-β、PDGF和EGF并具有抗炎活性[5]. 巨噬细胞在肝纤维化中具有双重作用。它们诱导肝星状细胞存活、活化和迁移，并产生参与纤维蛋白生成的细胞因子[三]. 另一方面，巨噬细胞的一个子集产生基质金属蛋白酶-9和-12，降解纤维化[8]. 此外，树突状细胞在纤维化的降解中起作用[三]. 另一种参与肝脏修复和纤维化的免疫细胞是自然杀伤细胞。它们释放致炎细胞因子，杀死肝细胞并减缓肝脏修复[9]. 同时，它们还通过诱导肝星状细胞凋亡来减少纤维蛋白生成[三]. 自然杀伤细胞产生干扰素-γ并杀死星状细胞以抑制肝纤维化[10]. 因此，炎症细胞在维持肝脏ECM止血方面具有双重功能。

尽管异基因移植是终末期肝病患者的标准治疗方法，但供体器官短缺、移植排斥的可能性、高成本和手术并发症等因素限制了这种方法的使用[11]. 生物人工肝支持系统和肝细胞移植是其他治疗选择，但它们也有局限性。人工肝可以作为等待肝移植患者的临时治疗[12]. 虽然肝细胞治疗可以替代全肝移植，但其成功与否取决于肝病的类型[13]以及抑制患者免疫系统的需要[14]. 在代谢性肝病和尿素循环缺陷等情况下，大多数接受肝细胞治疗的患者后来都接受了全肝器官移植。肝细胞治疗可以被视为找到合适的肝脏进行移植的桥梁。此外，70%的门脉内灌注的肝细胞由于血液介导的炎症反应和血栓形成而丢失。移植的肝细胞也被炎症细胞包围。已建议进行抗炎干预以减少肝细胞丢失[15]. 另一种候选药物，作为治疗肝病的药物，是啮齿动物中称为卵圆细胞的祖细胞。在严重肝损伤的情况下，卵圆细胞被生长因子、细胞因子和酶控制的协调信息网络激活。然而，这些细胞的异常活性与病理性溃疡和肝癌的进展有关[16]. 血小板输注等其他治疗也不能减少肝纤维化[17].

脱细胞肝支架可能是需要肝移植患者的潜在解决方案[18]. 尽管所有的细胞和核材料都被去除了，但ECM的生物活性、血管骨架、三维结构和机械完整性在脱细胞过程中得以保留。肝脏ECM和各种生长因子为支持细胞附着、迁移、增殖和分化提供了必要的微环境[19]. 据报道，大鼠去细胞化肝移植成功地被不同类型的肝细胞（包括肝细胞、卵圆细胞、星状细胞、胆管细胞、成纤维细胞和脂肪细胞）重新细胞化；然而，移植物中也富含免疫细胞，如淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。移植支架中的免疫细胞浸润导致纤维生成过程的进展，可能是由于激活了星状细胞[20]. 这导致肝脏ECM结构的有害改变，从而损害肝细胞重组。限制免疫细胞过度浸润的方法之一是应用合成糖皮质激素，如泼尼松龙。糖皮质激素可以改善肝病的生化和组织学症状，包括自身免疫性肝炎、肝硬化和肝移植[21].

间充质干细胞（MSCs）也是组织工程的有益来源，因为它们可以抑制免疫系统，并且易于获得[22]. 据报道，它们能够分化为肝细胞[23]促进肝脏再生[24]. MSC治疗被证明可以减轻大鼠和人类的肝纤维化[25]通过产生各种生长因子、免疫调节和防止肝细胞凋亡来改善肝功能[24,26]. 此外，骨髓基质干细胞通过将巨噬细胞从原纤维化表型转换为恢复表型来减少肝纤维化。许多BM-MSC在注射到肝脏后也会因凋亡而死亡。由于基质金属蛋白酶-12的表达，这些凋亡小体的吞噬作用导致纤维去除[27]. 本研究的目的是利用泼尼松龙和骨髓间充质干细胞优化脱细胞肝支架，以平衡免疫细胞进入移植支架的入口，减少纤维化进程，改善细胞结构重组。

材料和方法

肝脏去细胞程序

根据西拉大学医学科学伦理委员会批准的指南（IR.SUMS.REC.1398.1210）完成动物处理和治疗。

对购自设拉子医科大学比较与实验医学中心200±20 g的雄性Sprague-Dawley大鼠的肝脏进行全器官去细胞处理。通过腹腔内注射10%氯胺酮（100 mg/kg，荷兰阿尔法森）和2%二甲苯嗪（10 mg/kg，德国阿尔法桑）对动物进行麻醉。最初，通过门静脉注射1 mL肝素（5000 UI/mL）；随后，结扎门静脉分支。然后，用直径为2 mm的塑料聚合物管插管门静脉，用蠕动泵（WT600-1F，Longer pump Co.，USA）以3/5 mL/min的速度向肝脏灌注400 mL去离子水（DW）。为了从肝脏中排出血液，我们切开了下腔静脉。然后，用400 mL 1%月桂基醚硫酸钠（SLES，Kimia Sanaat Ataman Co，Tehran，Iran）灌注，然后用DW冲洗。为了对去细胞的肝脏内部进行消毒，我们灌注0.1%过氧乙酸，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗。最后，将脱细胞肝脏分离并冷冻直至使用。

脱细胞肝脏的特征

DNA定量分析

根据制造商的说明，对完整的和去细胞的肝脏进行DNA含量分析(n个 = 3） 使用dsDNA检测试剂盒（德国QIAGEN）执行。DNA产量（ng/μL）通过分光光度计（光密度（OD）在γ = 260 nm），使用Nano Drop®ND-1000（Nanodrop Technologies Inc.，美国德州威明顿）。

组织学评估

石蜡包埋组织切片，厚度为5μm。用苏木精伊红（H&E）和赫斯特（10 ng/mL）对完整和去细胞切片进行染色₂O） 以确认有效的细胞去除。采用周期性酸性Schiff（PAS）、Alcian蓝、Masson三色和醛-品红染色评估ECM成分的保存情况，包括中性碳水化合物、酸性糖胺聚糖、胶原蛋白和弹性纤维。

为了评估I型和IV型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白的保留，我们制备了未固定的冷冻切片，用生物素化的抗I型胶原（1:250）、抗IV型胶原（1:500）、抗纤连蛋白（1:250）和抗层粘连蛋白（1:100）抗体在4°C下免疫染色过夜（均来自Abcam PLC，Cambridge，MA，USA）。通过用200–400μL链霉亲和素HRP（1:10000；Abcam，USA；ab7403）处理样品，然后在3,3′-二氨基联苯胺四氯化钠（Sigma-Aldrich，D5905）中培养，进行显色。最后，用苏木精对样品进行复染。

扫描电子显微镜（SEM）

将冷冻脱细胞支架冻干过夜（Christ Alpha 2–4LD-plus，Osterode am Harz，Germany），以制备SEM。使用Q150R-ES溅射镀膜机（英国Quorum Technologies公司）将样品涂上一薄层金，并使用VEGA3显微镜（捷克共和国TESCAN公司）成像。

泼尼松龙有效剂量的测定

首先将泼尼松龙溶于聚乙二醇中，然后在RPMI（Gibco）中以2、1、0.5、0.25和0 mg/mL的剂量稀释。将不同稀释度的泼尼松龙加入灭菌的脱细胞肝脏中。为了评估抑制淋巴细胞增殖的有效剂量，我们加载了5×10⁴在每个支架上添加10%胎牛血清（FBS）、10 U/mL青霉素、10μg/mL链霉素和1%谷氨酸盐（均由GIBCO提供）24和48小时后，对RPMI的Jurkat细胞系进行计数。

高效液相色谱法

采用高效液相色谱（HPLC）分析泼尼松龙的时间依赖性释放模式。脱细胞过程结束时，将0.5 mg/mL的泼尼松龙灌注到支架中。然后，我们将1mL HPLC级水（德国默克公司）添加到去细胞肝的盘状片中，并在30分钟、1、3、5、24和48小时后评估释放药物。使用C18柱和含有45%水和55%HPLC级乙腈的流动相以1mL/min的速度运行HPLC，在254nm处检测洗脱药物。使用聚乙二醇中一系列已知浓度的泼尼松龙作为标准。

细胞毒性测试

使用HepG2细胞系（伊朗巴斯德研究所）进行细胞活力测试。细胞生长在低糖Dulbecco改良的Eagle's培养基（LG-DMEM，GIBCO）中，其中含有10%的FBS，并添加1%（V/V）青霉素-链霉素和1%的L-谷氨酰胺。综上所述，1.0×10⁴细胞被加载到含有泼尼松龙的支架中。为了模拟2D条件，我们将HepG2细胞接种在含有等量泼尼松龙的海藻酸凝胶预涂层板上。1、3和7天后，用最终浓度为0.5 mg/mL的-（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT，M5655；Sigma-Aldrich）替换新鲜培养基3小时；最后，用100µL的100%二甲基亚砜洗脱结晶甲赞。然后，利用BMG光谱纳米伊丽莎白阅读器在595个波长下评估吸光度。

间充质干细胞分离

为了收集大鼠骨髓基质干细胞，我们在无菌条件下将一个23号注射器插入胫骨和股骨腔，并用补充有10 U/mL青霉素的无血清DMEM进行闪蒸。在1200 rpm离心后，将细胞颗粒重新悬浮并接种在含有10%FBS、10 U/mL青霉素、10μg/mL链霉素和1%L-谷氨酸盐（均为Gibco）的DMEM中。最后，将悬浮细胞去除7天，并使附着的细胞生长到融合状态。

用流式细胞仪对分离的细胞进行了表征。简单地说，通过培养5×10进行渗透⁵含有山羊血清的PBS细胞（美国吉布科）和吐温20（美国默克）。然后，添加1µL FITC-标记的抗CD44和-CD45、PerCP结合的CD90和PE结合的CD34抗体（均来自Abcam）。用PBS（1–2 mL）洗涤后，以1200 rpm离心样品，用1%多聚甲醛固定，并用4色FACScalibur流式细胞仪（BD FACSCaliburTM；BD Biosciences）和CellQuest Pro软件进行评估。数据通过flowjo软件进行分析。

BM-MSC也分别暴露于成骨培养基（Gibco）和成脂培养基（Gibco）四周和三周。然后，用4%多聚甲醛固定分化细胞，并用茜素红S（美国西格玛）和油红O（美国西格玛）染色，分别检测钙吸收和油滴。

附件测试

为了评估泼尼松龙负荷对细胞粘附和浸润的可能影响，我们以2×10的密度接种MSCs⁵/mL在无泼尼松龙或负载的支架上培养，如上所述。30分钟后，收集并计数培养基中未附着的细胞。通过从初始细胞计数中减去未附着细胞来计算附着细胞的数量。

间充质干细胞的追踪

为了追踪细胞，我们用PKH26红色荧光细胞连接试剂盒（Sigma）标记它们；然后，通过注射1×10将其装入支架⁶细胞/mL通过血管骨架。在移植开始时和移植后第14天，新鲜冷冻切片并用Hoechst复染支架，并用荧光显微镜观察。

实验设计与肝支架移植

为了评估支架的体内再细胞化效率，我们将40只体重约为230±10 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为四组；每个人都接受了无药物、泼尼松龙、细胞或细胞/泼尼松松脱细胞支架。每组分为两个亚组，保存2周或4周（附加文件1：图S1）。然后通过肌肉注射10 mg/kg木聚嗪和100 mg/kg氯胺酮对大鼠进行麻醉，并在剑突下方开一个小切口。我们用手术套管针在肝左外侧叶造了一个直径为1厘米的空腔。然后，将同样大小的无菌脱细胞肝脏植入空腔。这些动物在标准条件下随意饲养两周和四周。最后，移植物和周围完整的肝脏（图1a、 b）通过中线剖腹手术取出，并固定在4%甲醛中，以进行进一步分析。

图1

整个肝脏和植入物(一)以及移植的去细胞移植物的高倍放大(b条). 通过定向器方法从移植组织中获得均匀的各向同性随机切片(c（c）). 从移植组织中获得了一组各向同性均匀的随机切片(d日). 在组织学切片上用点线表示移植物与正常肝脏的边界，并对组织区域进行了表征，图中可见肝细胞（H）、胆管（BD）、血管（V）和异物（FB）(e（电子）). 采用点计数法估算移植物成分的体积(（f）). 移植组织的细胞被鉴定(克). 光学分离技术用于估计移植组织中的细胞数量。在该图中，可以看到肝细胞（H）和淋巴细胞（L）（H）。比例尺=30µm英寸(e（电子）,（f）)和20µm英寸(克,小时)

体视学研究

移植物组织制备

估计一些体视学变量，如微血管长度，需要各向同性均匀随机截面；因此，按照“定向器方法”切割移植物（图1c、 d）[28,29]. 然后，将石蜡包埋块分别切成5μm和25μm厚的切片，并用周期性酸希夫（PAS）、马森三色（Masson Trichrome）、H和E染色。

采用视频显微镜系统，在每一个切片中对移植物与正常肝组织的边界以及再生肝与炎症组织区域的边界进行了描述（图1e） ●●●●。

炎症组织区域被淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和异物巨细胞等炎症细胞占据；此外，再生肝组织包括肝细胞、纤维细胞、胆管、血管和纤维组织。

估算接枝组分的体积密度

使用厚度为5µm的移植物切片来估计再生肝脏和炎症组织结构的体积密度。体视学工具由尼康E-200显微镜（日本尼康）和计算机组成。在实况照片中使用最终放大倍数为780 X的体视学探头，并通过“点计数技术”评估最喜欢的结构的体积（图1f）[28,29]. 使用以下公式估算体积密度“Vv（最喜爱的结构/嫁接）”：

$${text{Vv}}=\sum{\text{P}}\left（{text{favority structure}}\right）/\sum{text{P}{\left$$

其中“∑P（P）（结构）“和”∑P（P）（移植物）”分别是击中最喜欢的结构和移植物部分的点数[28,29].

估计移植物细胞的数值密度

采用光学分离技术估计厚移植物切片中淋巴细胞和中性粒细胞的数量（图1g） ●●●●。光学分光器由不同的部分组成，包括一个具有高数值孔径（NA=1.30）×40个浸油物镜，与摄像机相连，摄像机将实时显微图像传输到计算机显示器，以及带数字读数的电子微处理机（MT12，德国特劳内特海登海默），用于测量Z方向的运动，精确度为0.5μm。通过将舞台移动到x个-和年-等距离方向，采用系统均匀随机抽样。

计数框是一个带有体视学软件系统的体视学探头（Stereolite，SUMS，Shiraz，伊朗）。无偏计数框由两条实线（左侧和下方边界及其延伸部分）和两条虚线（右侧和上方边界）组成，这些虚线覆盖在最终放大1520倍的实时图像移植上（图1h） ●●●●。保护区是移植物切片顶部和底部的区域。使用这些区域是为了避免在移植物切片的这些区域的组织处理过程中出现切割组织伪影。在上（前5μm）或下警戒区内聚焦的任何细胞事件都不计算在内。上下防护区之间的距离为“隔离区高度”，此处为15μm。

选择出现在计数框内最大焦点、完全或部分放置在计数框内且不接触禁止线的细胞核（图1h） ●●●●。数值密度（NV）由以下公式估算：

$${\text{Nv}}\左（{{text{cells}}/{text{grave}}\右）=\SigmaQ{-}/\left（{\Sigmap\times\left（}a/f}\right）\timesh}\rift）\times\leaft（{t/{text{BA}}\ right）$$

其中“∑问–“是指在离体高度最大聚焦的移植物细胞核数量，”∑P（P）“是所有微观领域的计数帧总数，”小时”是身高解剖仪。“飞机/飞机“是框架的面积，”t吨”是用微腔测量的实际切片厚度，“BA”是切片机组的块前进。从每个移植切片中均匀随机取样，在整个微观视野中测量移植切片的厚度[28,29].

植入后的组织学和免疫组织化学评价

在石蜡包埋切片中进行柠檬酸盐和Tris–EDTA缓冲液中的热诱导表位检索。然后，用预先稀释的抗c-kit、抗细胞角蛋白19（CK19）和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）一级抗体（均来自丹麦达科）对切片进行染色，然后在聚合物-HRP中培养，然后在二氨基联苯胺中培养。使用ImageJ软件，在PAS染色样本中采用Voronoi细分法评估胆管的分布(http://mac.softpedia.com/get/Graphics/ImageJ.shtml).

统计分析

数据以平均值±标准差表示，并使用双向方差分析（ANOVA）分析、Tukey和Mann-Whitney U检验进行统计分析。分析中使用了Graph Pad Prism 9。A类P（P）值小于0.05被认为是显著的。

结果

脚手架的制备和表征

大体观察表明，灌注的肝脏具有透明的外观和可见的血管结构（图2A、 B）。DNA定量测试证实DNA显著缺失(P（P） = 0.0002，图2C） H&E和Hoechst染色显示，细胞碎片和细胞核已被正确去除（图2D、 E）。SEM图像显示，去细胞过程后，三维肝脏超微结构呈现多孔状，血管结构保持良好。不同肝脏部分的框架，包括肝小叶和门静脉间隙，被确定为胶原纤维网络，呈现蜂窝状外观（图2F、 G）。

图2

年代学宏观(A类)和微观变化(B类)在基于SLES的去细胞过程中对大鼠肝脏的损伤。可以观察到脱细胞过程中肝脏颜色从红色变为透明。DNA定量(C类)脱细胞后DNA含量显著降低（数据表示为平均值±标准误差（SEM），N个 = 每组3个，*表示有显著差异(P（P） = 0.0002). 赫赫斯特(D类)苏木精和曙红(E类)脱细胞肝的染色证实细胞核耗竭。边缘切割的扫描电子显微镜(F类)和表面(克)脱细胞支架的三维超微结构保持完整

Alcian蓝、PAS、醛品红和Masson’s三色染色证实，与自然肝组织相比，脱细胞ECM中的糖胺聚糖、中性碳水化合物含量、弹性纤维和胶原纤维的保留率分别可以接受。此外，免疫组化显示，与完整的肝脏相比，ECM蛋白（如I型和IV型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白）得到了适当的保护（图三).

图3

肝脏细胞外基质的成分保存。Alcian blue、Aldehyde-fuchsin、Masson Trichrome和PAS分别用于检测酸性糖胺聚糖和弹性纤维、胶原纤维和中性碳水化合物含量，显示出与完整肝脏相比，脱细胞肝脏的ECM保存程度有所不同。免疫组织化学检测I型胶原、IV型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白保留在肝脏支架中，在完整组织中具有类似的分布模式。比例尺为100µm

剂量选择

为了选择泼尼松龙的有效剂量，我们在不同浓度的泼尼松隆存在的情况下，追踪T细胞增殖至48小时。泼尼松龙的低溶解度导致药物在高浓度（2 mg/mL）下沉淀。尽管药物治疗后T淋巴细胞增殖没有显著降低，但在0.5和1 mg/mL的治疗组中，细胞计数没有显著降低。因此，我们最终选择0.5 mg/mL的药物进行进一步测试，因为细胞增殖率降低，溶解度适当（图4A） ●●●●。

图4

通过将T细胞暴露在一组剂量下48小时来选择泼尼松龙的有效剂量(A类). 细胞粘附评估表明，泼尼松龙负荷对支架的粘附和渗透性能没有显著影响(B类). 培养HepG2细胞株，评价载泼尼松龙支架的细胞毒性。在常规2D条件下培养的细胞增殖率显著高于所有其他组。第7天，所有组的细胞存活率均增加。泼尼松龙对HepG2细胞有一定的细胞毒性(C类). 药物释放模式通过评估介质中释放的泼尼松龙浓度来评估。2个代表性样本(D类)和5小时(E类). 泼尼松龙在支架上48小时的释放曲线(F类). PKH26标记MSC的追踪(克). 注射细胞在0天时均匀分布在支架上。2周后，大多数标记细胞形成大聚集体；然而，其中一些分散在植入的支架上。在标记的细胞聚集物之间，也可以观察到未标记的细胞。标记的细胞不存在于肝脏的完整部分（*）。PD，泼尼松龙；DC，去细胞*与2D藻酸盐有显著差异(P（P） = 0.0002），并且3D PD负载脱细胞(P（P） = 0.0001）第1天；α与2D PD加载的显著差异(P（P） = 0.0001）和3D去细胞(P（P） = 0.0029）第1天；和，β在第3天和第7天与所有其他组之间存在显著差异(P（P） = 0.0001)

细胞毒性、细胞浸润和附着评估

在第一天，MTT评估显示，两种3D泼尼松龙负载的活细胞数量显著降低(P（P） < 0.0001）或无泼尼松龙条件(P（P） = 0.0083）。此外，在无涂层培养皿上培养的HepG2的细胞增殖明显高于在无泼尼松龙藻酸盐上培养的细胞(P（P） = 0.0002). 在三维泼尼松龙支架上发现存活率明显最低的细胞。由于常规培养条件下的细胞持续增殖至第3天和第7天，其他组的细胞活力保持不变，在所有其他条件下统计上保持不变。与第7天相比，第3天也观察到细胞活力降低，这是因为前24小时释放了所有的泼尼松龙含量。然而，在第7天，所有组均观察到细胞增殖（图4B） ●●●●。

统计分析表明，泼尼松龙负荷对支架的粘附和渗透性能没有显著影响（图4C） ●●●●。

药物释放评估

药物释放模式显示，在培养基中2至4分钟内出现泼尼松龙，这意味着在载药支架培养开始时释放出高水平的药物。药物的释放速率随着时间的推移而降低，这可能是由于支架中残留药物的水平较低所致。5小时后，其达到零，表明泼尼松龙完全释放（图4D） ●●●●。

间充质干细胞的追踪

骨髓基质干细胞以其成纤维细胞样表型、CD90（100%）和CD44（99.8%）标记物的表达以及造血标记物CD34（0.329%）和CD45（2.95%）的阴性反应为特征。通过将MSCs分化为脂肪细胞和成骨细胞也证实了多能性（附加文件2：图S2）。

对PKH26标记的MSC的追踪显示，注射细胞在注射0天时均匀分布在整个支架上。2周后，植入支架中仍能观察到标记细胞的大聚集体；然而，也可以观察到一些分散的标记细胞。植入的支架中也存在未标记细胞，表明宿主细胞侵入移植物。没有标记的细胞迁移到邻近的完整肝组织中（图4E） ●●●●。

体内评估

大体检查表明，移植的支架对肝脏完整部分的完整性和外观没有不利影响。移植部位、腹膜和腹部器官未发现感染或粘连。此外，未观察到移植物排斥反应和动物死亡率。

显微镜研究显示，细胞广泛迁移，在这两个时间点，类肝细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞侵入所有支架。无论支架的类型如何，都会发生血管生成，包括窦性血管在内的各种血管都会发生。在两种细胞负载支架中，尤其是接受细胞/泼尼松龙的支架中，迁移的肝细胞以肝索的形式组织（图5A、 B），并且正弦曲线在它们之间穿透（图5C） ●●●●。肝细胞用PAS弱染色，表明它们还不成熟（图5C） ●●●●。

图5

装载BM-MSC移植的代表性样本的PAS染色显示肝索形式的肝细胞样细胞重组(A类). * 表示肝脏的完整部分。图中的正方形A类用高倍镜检查，显示重组的肝索(B类). 此部分的放大倍数越高(C类)显示具有肝细胞表型（arrow）的细胞呈肝索状排列，其间可见猪苓苷。箭头显示内皮细胞的细胞核。比较肝脏完整部分肝细胞的PAS反应(D类)以及在支架中迁移的肝细胞样细胞(C类)发现他们还没有储存糖原；因此，它们不起作用。胆道分布的镶嵌法(E类)

在所有移植的支架中，一些区域类似于包含多个胆管的门静脉间隙，并且移植物中也形成了血管。然而，扫描植入物的镶嵌显示胆管分布不均匀，大多数胆管形成于移植物和完整肝脏的边界（图5D） ●●●●。

植入后的免疫组织化学评价

免疫组织化学评价显示，肝母细胞、胆管细胞、卵圆细胞和肝星状细胞在移植移植物中迁移或分化。CK19阳性的成肝细胞和胆管细胞散布在对照和泼尼松龙负载的支架中。在这两种细胞处理的支架中，CK19的免疫反应证实存在以肝索和分散细胞形式存在的未成熟肝细胞的大聚集体（图6). 一些胆管也与CK19抗体发生反应。

图6

CK19阳性细胞代表2周后移植移植物内迁移的未成熟肝母细胞和胆管细胞。在细胞和细胞/泼尼松龙组中，存在CK19-阳性细胞的大聚集体。高倍镜（小正方形）显示它们具有肝细胞表型。2周后，免疫组织化学检测所有移植物中广泛的C-kit标记的卵圆细胞迁移。在小正方形中观察到较高的放大倍数。Con:控制

GFAP抗体标记分散在再生区和炎症区的肝星状细胞（图6). C-kit阳性的卵圆细胞也迁移到所有移植物中，并分布在整个移植物中（图7).

图7

GFAP抗体检测星形胶质细胞迁移。显微镜检查显示，较少的星状细胞迁移到载泼尼松龙的支架上。肝脏完整部分（箭头）和移植物中的星形细胞（箭头）。*表示肝脏的完整部分

巨细胞

在所有支架中，均检测到含有多个细胞核的异物巨细胞，定量数据表明，支架状况对巨细胞总体积没有统计影响。少数肝巨细胞被CK19、肝细胞特异性抗原（HSA）和PAS染色，这些可能是肝巨细胞，细胞质中不含糖原的更丰富的HSA和CK19阴性巨细胞被认为是多核巨噬细胞（图8).

图8

异物巨细胞。肝巨细胞与CK19和HSA抗体以及PAS染色反应。多核巨噬细胞HAS和CK19阴性，细胞质中没有糖原。图表显示，所有组中这些细胞的体积在统计学上是相同的。比例尺为50µm

体视学估计

分离法显示，随着时间的推移，对照组中性粒细胞计数显著减少(P（P） < 0.0001). 两周时，与对照组相比，所有经处理的支架均显著降低了中性粒细胞计数(P（P） < 0.0001). 然而，在4周时，泼尼松龙治疗组的中性粒细胞数量最低，与细胞/泼尼松龙负荷组相比，这一数字是显著的(P（P） = 0.035，图9A） ●●●●。随着时间的推移，对照组的淋巴细胞数量也显著减少(P（P） = 0.003). 两周时，所有处理过的支架中的淋巴细胞数量均低于对照组(P（P） < 0.0001). 然而，与细胞/泼尼松龙植入物相比，在四周时，用泼尼松隆或MSCs加载支架会降低淋巴细胞计数(P（P） = 0.002,P（P） = 分别为0.004）。随着时间的推移，侵入泼尼松龙和细胞负载植入物的淋巴细胞数量在统计学上保持不变。这表明泼尼松龙和细胞减轻了炎症和免疫细胞迁移（图9B） ●●●●。

图9

中性粒细胞的数量(A类)，淋巴细胞(B类)和炎症组织的体积密度(C类)，船只(D类)和胆管(E类). 早在2周前，泼尼松龙和MSCs就加速了中性粒细胞向淋巴细胞群的置换。泼尼松龙和细胞可减轻炎症和免疫细胞迁移。细胞/泼尼松龙负荷组的血管生成明显高于对照组(P（P） = 0.0086），载药(P（P） = 0.0004）和电池加载(P（P） < 0.0001）组。与对照组和泼尼松龙负荷组相比，两种细胞负荷支架的胆道迁移和形成速度均无明显加快

还估计了炎症区域的总体积。在对照组中，数据显示随着时间的推移，炎症组织的体积显著下降(P（P） = 0.002). 在2岁时，泼尼松龙治疗组的炎症组织体积显著低于对照组(P（P） = 0.004）和四周(P（P） = 0.019). 这表明，工程肝脏中的泼尼松龙负荷对炎症有缓解作用（图9C） ●●●●。

2周时，泼尼松龙和MSC负荷对新生血管的体积密度没有负面影响，所有组的血管生成在统计学上是相同的。随着时间的推移，细胞/泼尼松龙诱导的血管生成水平显著高于对照组(P（P） = 0.0086），载药(P（P） = 0.0004），并且细胞负载(P（P） < 0.0001）组（图9D） ●●●●。

容量分析显示，所有组在两个时间点的胆管形成在统计学上是相同的（图9E） ●●●●。

另一方面，与对照组相比，在2周和4周时，所有治疗均导致胶原组织体积显著减少。这表明细胞和泼尼松龙负荷对保持天然3D ECM结构有积极影响。三色Masson染色也证实了容量分析（图10). 骨髓间充质干细胞治疗植入物在减少纤维化方面比泼尼松更有效。

图10

三色Masson染色以及纤维化区域所占体积的量化显示，在同时装载细胞和泼尼松龙的移植物中，纤维生成显著降低。细胞/泼尼松龙治疗组再生肝组织的体积密度也显著高于对照组。PD，泼尼松龙*同一周和所有其他组的显著差异(P（P） < 0.05);^#与同一周细胞和细胞治疗组的PD有显著差异(P（P） < 0.05)

与对照组相比，植入细胞/泼尼松龙后再生肝组织的体积密度显著增加(P（P） < 0.0001），MSC(P（P） < 0.0001）和泼尼松龙负荷组(P（P） = 0.0001）（图10).

讨论

脱细胞肝脏的结构在化学和机械方面与原始组织中的ECM相似。广泛的免疫细胞迁移对移植的去细胞肝支架的ECM结构有不利影响，包括纤维化[20]并且通过加载BM-MSC和泼尼松龙来限制它。ECM提供化学和机械信号，促进细胞迁移和分化，调节细胞和组织表型[30]. 根据Naeem等人和Shimoda等人2019年的两项研究，脱细胞肝支架可以为吸引肝特异性细胞和支持细胞增殖提供合适的环境[20,31]. Naeem等人还发现成肝细胞和卵圆细胞迁移到移植的去细胞支架中。然而，在所有这些研究中，迁移细胞都无法正确重组以形成肝脏结构。目前的研究还证实了所有肝脏特异性细胞类型（包括肝母细胞、胆管细胞、卵圆细胞、星状细胞和肝索重组细胞）对脱细胞支架的体内再细胞化。

Naeem等人还报道了移植的脱细胞支架中存在炎症细胞[22]. 据报道，中性粒细胞、淋巴细胞和M1巨噬细胞的存在参与了肝脏再生[32,33]. 这些免疫细胞与星状细胞合作，诱导间质纤维化组织的形成[34]导致ECM大幅修改。尽管肝脏特异性细胞广泛迁移和胆管形成，但ECM修饰和纤维化可能阻止肝脏重组。这一证据表明，平衡免疫细胞迁移可能抑制脱细胞支架移植后的广泛纤维化[35]. 在本研究中，将泼尼松龙、MSCs或两者的组合加载到肝脏支架上，以减轻炎症细胞的进入并减少纤维组织的形成。

为了平衡免疫细胞浸润，我们用泼尼松龙负载去细胞支架；数据显示，与对照组相比，中性粒细胞和淋巴细胞计数以及胶原纤维形成显著减少。虽然中性粒细胞有助于肝脏修复，但它们可以通过产生蛋白酶和活性氧物种造成细胞损伤[36]. 在这些情况下，包括糖皮质激素在内的免疫抑制药物被用来限制炎症。系统应用泼尼松龙可以改善肝脏疾病引起的生物力学和组织学异常[37]. 然而，糖皮质激素本身并没有毒性；长期或高剂量摄入会导致肝衰竭并增加肝酶[38]. 为了限制这些副作用，我们在去细胞的肝脏局部注入泼尼松龙，发现它可以减轻炎症和纤维化。

虽然泼尼松龙和BM-MSC负荷对肝细胞迁移和分化都没有有利或不利的影响，但两者的结合导致再生肝组织的体积显著增加。关于合成糖皮质激素如泼尼松对肝脏结构和功能的影响，有相互矛盾的数据。虽然一项人类回顾性队列研究表明泼尼松龙是安全的[39]，动物研究表明一些不利影响，如糖原消耗[40]. 证据表明正常大鼠肝脏中肝细胞大小和糖原含量之间存在相关性[41]. 糖皮质激素如泼尼松龙对肝细胞有双重作用。例如，口服糖皮质激素通过自噬或抑制糖原合成酶导致糖原耗竭。另一方面，据报道，在服用地塞米松后，家畜中存在糖异生途径和糖原合成相关基因的过度表达[42]. 此外，糖皮质激素给药后肝细胞增大，肝细胞增殖减少[43,44]. 因此，泼尼松龙负荷不会改变肝组织的总体积，因为肝细胞分裂的减少可能会被细胞大小的增加所补偿。然而，这些糖皮质激素的作用是剂量依赖性的，并且有记录表明其治疗剂量是安全的[45]. MSC输注对肝脏再生的影响也是矛盾的。而关于部分肝切除大鼠的报告显示，在全身注射MSCs后，肝细胞增殖和增大[46]猪门静脉输注MSC对肝细胞大小和增殖无明显影响[47]; 这与我们的数据一致。然而，MSC治疗可以加速肝脏再生[47]. 我们还发现两种MSC处理支架中的肝细胞组织均有改善。这些争议可能归因于不同的物种和引入MSCs的方式。

注射过量表达的肝生长因子BM-MSCs改善肝硬化模型大鼠肝功能[48]. MSCs暴露于合成糖皮质激素如地塞米松可以表达更高水平的肝生长因子[49]. 这一证据可能解释了泼尼松龙和BM-MSC在去细胞支架中迁移的肝特异性细胞重组中的协同作用。

间充质干细胞不仅具有多重分化潜能，而且具有调节宿主免疫系统的能力。因此，它们是用于重建医学的理想来源[50]. 我们发现，在短时间内，用BM-MSC或BM-MSC/泼尼松龙负载去细胞支架显著减少中性粒细胞和淋巴细胞的数量，但不减少炎症细胞所占的体积，可能是由于这些组中免疫细胞密度降低或其他免疫细胞类型数量增加。四周后，BM-MSCs/泼尼松龙治疗组的炎症区体积增加。据报道，体外注射合成糖皮质激素（如地塞米松）可降低MSCs的免疫调节活性[49]. 在小鼠肝纤维化模型中注射含MSCs的地塞米松可以干扰MSCs的抗炎作用并取消其抗纤维化作用[51]. 我们的数据还表明，这种组合降低了MSCs的抗炎特性，但没有降低其抗纤维化作用。

泼尼松龙、BM-MSC及其联合用药可减轻肝纤维化。然而，两种含有细胞的支架在减少胶原纤维沉积方面都优于泼尼松龙处理的支架。据报道，泼尼松龙可以抑制肝细胞合成胶原蛋白[52]. 据报道，门静脉输注或直接将MSCs注射到肝脏部位是逆转肝纤维化的一种治疗策略[53]，这与我们的数据一致。我们可以在支架中追踪PKH标记的MSCs长达两周。因此，他们可以活着产生对逆转纤维化至关重要的细胞因子[53]. 另一方面，研究表明糖皮质激素限制肝星状细胞的迁移[54]. 虽然我们没有量化迁移的星状细胞的数量，但显微镜检查显示，与对照支架相比，迁移到由泼尼松龙加载的支架中的星形细胞数量较少。这些细胞的活性延长会导致纤维组织的形成[55]. 此外，动物模型体内注射糖皮质激素可减少肝纤维化和纤维化相关基因的表达[56].

在慢性炎症阶段，异物巨细胞侵入生物支架，如植入的去细胞组织[57]. 我们的观察结果表明，所有移植物中都存在两种类型的巨细胞。一小部分巨细胞亚群与PAS、CK19和HSA反应，而其中大多数巨细胞标记物为阴性。在一些病理病例中，如自身免疫性疾病、病毒感染、药物反应和先天性代谢性疾病，多核肝细胞是由于肝细胞核的多次分裂而形成的，而细胞质没有分裂[58]. 与肝细胞标记物反应的巨细胞可能是肝巨细胞。PAS染色显示它们也有功能。HAS-和CK19-阴性巨细胞可能代表参与对外来支架免疫反应的融合巨噬细胞。

工程移植物的血管生成是受损组织再生的关键。MSC治疗已被证明通过产生促血管生成和促动脉生成因子来改善血管生成[59]. 尽管先前的一项研究报告称，天然大鼠肝支架的再细胞化可诱导负载的MS细胞分化为内皮层，但我们的体视学分析表明，MSC和泼尼松龙负载对肝脱细胞支架的血管生成均无有利影响。然而，两者的结合在短期内显著加速了血管生成。与我们的数据一致，一项体外研究报告称，皮质类固醇增强了MSCs的血管生成特性，而这些细胞仍然减轻了免疫调节活性。此外，低剂量地塞米松导致MSCs血管内皮生长因子表达增加，建议用地塞米森预处理MSCs以增强其血管生成特性[49]. MSCs产生的血管内皮生长因子是肝脏形态发生的重要因子，其存在导致肝窦的形成[60].

尽管脱细胞支架的移植表明泼尼松龙负载对肝细胞迁移和胆管形成没有有害影响，但该药物对HepG2细胞系的体外暴露显示出一定程度的细胞毒性。细胞毒性试验的第一天，当脱细胞支架释放泼尼松龙的浓度较高时，活肝细胞的数量明显少于对照组。试验表明，该药物在孵育的前5小时内释放。我们还比较了装载在海藻酸钠薄膜中的泼尼松龙的细胞毒性，以提供2D环境。虽然在存在泼尼松龙和2D条件下的细胞存活率与对照培养相似，但在藻酸盐和脱细胞支架中，泼尼松隆的释放模式似乎不同。泼尼松龙还具有抗肿瘤作用，减少细胞增殖，并诱导肝癌细胞（如HepG2）凋亡[61].

结论

结果表明，移植物为肝脏特异性细胞和炎症细胞迁移提供了合适的微环境。移植物可以与肝母细胞、星状细胞、卵圆细胞、成纤维细胞、胆管细胞、淋巴细胞、巨细胞和中性粒细胞等细胞重新填充。胆道也可以在移植物的不同部位形成。在去细胞化的肝支架中装载泼尼松龙可以减轻炎症并防止移植物纤维化。此外，BM-MSC对生物支架的再细胞化导致肝脏重组，形成类似于门静脉空间和肝窦周围肝索的结构。由于糖皮质激素与间充质干细胞的抗炎作用相互抵消，泼尼松龙和骨髓基质干细胞在肝脏支架上的同时负载不能防止炎症，但可以在减少纤维化、增加血管生成和修复区域的体积以及肝脏重组方面表现出协同作用。