MicroRNA-503-3p通过调节Wnt2和Wnt7b在周期性应变下影响人脂肪干细胞的成骨分化

摘要

背景

微小RNA（miRNA）通过抑制mRNA在循环应变下的翻译，在调节间充质干细胞的成骨分化（OD）中发挥作用。在我们之前的研究中，miR-503-3p在周期性应变下体内人脂肪源性干细胞（hASCs）OD中下调，而它可能针对Wnt/β-连环蛋白（W-β）途径。在本研究中，我们探讨了miR-503-3p在循环应变下hASCs OD中的作用。

方法

循环应变诱导hASCs OD。生物信息学和双荧光素酶分析用于确认Wnt2/Wnt7b和miR-503-3p之间的关系。在用miR-503-3p模拟物和抑制剂转染的hASCs中，使用免疫荧光检测miR-503-3p对Wnt2/Wnt7b和β-catenin的影响。转染hASCs中的模拟、抑制剂和小干扰RNA（siRNA）可对抗Wnt2和Wnt7b。定量实时PCR（RT-PCR）和western blot分别在mRNA和蛋白质水平检测OD和W-β途径。免疫荧光法定位β-catenin。比色法检测ALP活性和钙。

结果

流式细胞仪免疫表型和多谱系电位结果证实培养细胞为hASC。荧光素酶报告子分析结果表明，miR-503-3p可以通过靶向Wnt2和Wnt7b各自的3′-非翻译区（UTR）来调节其表达水平。在周期性应变下，miR-503-3p通过模拟物和抑制剂进行的功能增强或丧失研究表明，miR-50.3-3p表达的减少可以显著促进hASCs的OD，而miR-503-3p表达增加则抑制OD。此外，miR-503-3p的高表达降低了W-β途径的活性，这表明miR-503-3p处理的hASC中Wnt2和Wnt7b的表达降低，β-catenin失活。相反，miR-503-3p抑制激活了W-β途径。

结论

总之，我们的研究结果表明，miR-503-3p是Wnt2和Wnt7b调节W-β途径的一个负因子，在循环应变下抑制hASC的OD。

介绍

2001年，首次通过消化人体脂肪组织提取hASC[1]. hASC具有广泛的增殖潜能，并且能够分化成成脂、成骨、成软骨和成肌谱系[2,三]. 与骨组织工程中通常用作种子细胞的骨髓间充质干细胞相比，hASCs的优点包括细胞来源多、易获得、增殖快[4]. 更重要的是，ASC的成骨分化（OD）活性不会随着供体年龄的增加而降低[5]. 目前的研究表明，hASC可能是骨组织工程种子细胞的一个重要新来源。骨再生的一个需要进一步研究的重要方面是确定如何有效促进hASC的体外OD[6,7,8]. 此外，研究表明，拉伸应变可以在体外有效促进hASCs的OD[6,9]; 这些结果被用于促进骨再生中的OD[6,7,8].

Wnt信号通路在调节许多重要的生物过程中发挥着重要作用，如胚胎的形成和发育、干细胞的分化和维持[10,11]. W-β信号通路在干细胞OD中起重要作用。激活的W-β途径可以上调OD的特定基因，如runt-related transcription factor 2（RUNX2）、distress homeobox 5，从而促进OD[12]. 同时，W-β途径的激活也在抑制干细胞的成脂分化中起作用[13,14]. 我们之前的实验证实，在周期性拉伸应变诱导hASCs OD的过程中，W-β信号通路可能被激活[6].

miRNAs是非编码小RNA，能够通过抑制目标mRNA的翻译或降解来抑制目标基因的表达。它们在人类生理和病理过程中发挥着重要作用，包括细胞凋亡、细胞分裂、分化和器官发育[15,16,17]. 先前的报告表明，miRNAs通过W-β途径调节OD的过程[17]. 由于miRNAs的种类及其靶点的多样性，需要在这一领域进行进一步的研究。

在我们实验室先前进行的研究中，miR-503-3p在hASCs中的表达在拉伸应变下的体外OD过程中下调。我们的数据还表明，W-β途径也被激活[6,18]. 根据生物信息的结果，Wnt2和Wnt7b可能是miR-503-3p的靶点，它们是W-β途径的激活剂。因此，我们假设Wnt2和Wnt7b通过下调miR-503-3p激活的W-β途径参与了体外循环菌株诱导的hASCs OD。在本研究中，我们通过一系列实验验证了这一假设，整个过程如图所示1本文的结果为机械因素在骨再生中的应用提供了促进循环应变下hASCs OD的理论和实验依据。

图1

实验流程图

材料和方法

hASCs的获取方法及表征

在我们之前的研究中说明了hASCs的获取方法和表征[18].

循环应变在hASC中的应用

hASCs第4代以1.0×10的密度进行电镀⁵细胞/ml加入BioFlex™平板（Flexcell，美国）。在37°C和5%CO的条件下，使用Alpha改良的Eagle培养基（α-MEM）（美国Gibco）和10%胎牛血清（FBS）（美国Gibco）在BioFlex™平板中培养细胞24小时₂将细胞粘附到BioFlex™板中的硅橡胶上后，在37°C和5%CO的条件下，通过Flexcell®FX-5000™压缩系统（美国Flexcelll）在含有10%FBS的α-MEM中对细胞进行单轴循环应变（5%，0.5 Hz，2 h/day）加载6天₂对照组保持在相同的培养条件下，只是没有张力刺激。循环加载6天后，用免疫荧光、RT-PCR和western blot分析检测细胞。

生物信息学分析

使用以下数据库分析了物种间miR-503-3p的序列及其与Wnt2和Wnt7b的3′-UTR的预测结合位点：miRecords(http://mirecords.biolead.org/)，目标扫描(http://www.targetscan.org)，miRGator(http://genome.ewha.ac.kr/miRGator/miRGator.html)，米尔沃克(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)和miRBase(http://www.mirbase.org).

核酸表达工具的转染

将Wnt2表达质粒（EX-Wnt2）、Wnt2 siRNA（siWnt2，miR-503-3p抑制剂、Lipofectamine®2000（Invitrogen，USA）的miR-503-3p抑制剂阴性对照（miR-Ctrl抑制剂）、Wnt2 3′UTR野生型（wt-Wnt2）、Wnt2 3′UTR突变体（mu-Wnt2）、Wnt7b 3′UTR野生型（wt-Wnt7b）和Wnt7b 3′UTR突变体（mu-Wnt7b）。表中列出了本节中的所有转染序列1miR-503-3p模拟物、抑制剂siWnt2、siWnt7b、siR-Ctrl和miR-Ctrl抑制剂和模拟物均来自GenePharma Corporation（中国上海）。本段中提到的其余核酸表达工具来自GeneCopoeia Corporation（中国广州）。

表1本研究中使用的构建序列

将含有shRNA对照或shRNA靶向β-连环蛋白的慢病毒颗粒（来自Sigma-Aldrich，USA的Mission慢病毒转导颗粒）转导到SKOV3细胞中以控制β-连环蛋白的表达。转染后，用嘌呤霉素（1.5μM/mL）筛选SKOV3细胞。单个siRNA序列（#1:GCGUUGGCUGAAACCAUCA和#2:UAAUGAGGACCUACUUA，Dharmacon）或靶向β-catenin的4个短干扰RNA池（siβ-catentin，Dharmcon，美国；siGenome SMART池）用于通过Dream FECT转染试剂（法国Oz Biosciences）进行转染。对照组，加扰siRNA池（Dharmacon）被维持。

双荧光素酶报告分析

在本试验中，在psiCHECK-2载体（美国普罗米加）下游的Not I和Xho I裂解位点之间插入wt-Wnt2或相应的mu-Wnt2合成片段，其中包含预测的miR-503-3p种子匹配位点雷尼利亚荧光素酶报告基因。HEK-293 T细胞以70%的融合率接种到白色不透明的96-well板中，与每个报告构建物（pmirGLO-wt-Wnt2、pmirGLO-mu-Wnt2，pmirGLO-wt-Wnt7b或pmirGLO-mu-Wnt7b）和Lv-miR-503-3p、Lv-miR-NC、Lv-ASO-503-3p或LvASO-NC共同转染。根据制造商的协议，Firefly和雷尼利亚转染双荧光素酶报告基因检测试剂盒（中国Beyotime）48小时后检测荧光素素酶活性。这是通过归一化萤火虫值实现的雷尼利亚荧光素酶。

免疫荧光法检测hASCs中的β-连环蛋白

在转染核酸表达工具中提到的转染过程后，通过免疫荧光检测miR-503-3p、Wnt2和Wnt7b对β-catenin蛋白表达及其位置的影响。加载循环应变后，用4%多聚甲醛将样品固定在BioFlex™板孔中，然后用PBS冲洗3次。在室温下，添加0.5%Triton X-100（Sigma-Aldrich，美国）使其蒸发20分钟。用山羊血清（Beyotime，中国）封闭hASC 2分钟h，然后与β-catenin特异性初级抗体（1:1000，Abcam，USA）在4°C下孵育过夜。用PBS和吐温-20冲洗三次后，将细胞与荧光Cy3二级抗体（1:50，Proteintech，USA）在37°C的黑暗中孵育1小时。用荧光显微镜（蔡司，德国）拍摄样品照片。

RT-PCR检测基因表达

通过Trizol试剂（Invitrogen，USA）从细胞中分离的总RNA。PrimeScript RT Master Mix Perfect Real-Time（日本TaKaRa）用于从RNA合成cDNA。ABI 7300 Real-Time PCR系统用于进行RT-PCR反应（英国Applied Biosystems）。使用SYBR Premix ExTaq试剂盒（日本TaKaRa）检测RUNX2、碱性磷酸酶（ALP）、酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白（SPARC）、Wnt2、Wnt7b、β-catenin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。引物的设计和合成由RiboBio Corporation（中国广州）完成，引物序列如表所示2RT-PCR分析结果采用−ΔΔCt法计算。

表2本研究中用于RT-PCR的引物序列

蛋白质表达检测的Western blot分析

使用Western和IP Kit（中国Beyotime）的细胞裂解缓冲液提取总蛋白；核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒用于分离核蛋白和胞质蛋白（Beyotime，中国）。在4°C（12000×克，15 min），使用双钦尼克酸试剂盒量化蛋白质浓度（Beyotime，中国）。蛋白质样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到膜上（GE Healthcare Life Sciences，USA）。使用含有5%非脂肪乳的新鲜制备的Tris-buffer生理盐水（TBS）在室温下封闭膜2小时。在4°C下过夜，以1:1000的稀释比用一级抗体探测斑点。western blot中使用的主要抗体如下：RUNX2（美国Abcam）、ALP（美国Abcam）、SPARC（美国Abcam）、Wnt7b（美国R&D Systems）、Wnt 2（美国R＆D Systems，美国）、GAPDH（美国Cell Signaling Technology，美国）和β-catenin（美国Abcas），然后在TBS-0.05%吐温20中清洗三次膜，然后在室温下与相应的二级抗体孵育1小时。然后用ECL（德国赛默飞世尔科学公司）在黑暗中孵育印迹，并通过暴露于增强化学发光试剂（美国GE Healthcare）进行可视化。“ImageJ软件1.4.3.67”（美国国立卫生研究院）用于分析印迹的灰度。

比色法检测碱性磷酸酶活性和钙

按照制造商的手册，使用西方试剂盒和IP试剂盒（中国Beyotime）的细胞裂解缓冲液对细胞进行裂解。碱性磷酸酶检测试剂盒（Beyotime，中国）用于检测细胞裂解液中的碱性磷酸酶活性。样品和标准品分别添加到96块钢板中。然后，将对硝基苯基磷酸盐溶液和ALP酶溶液分别加入样品和标准孔中，并在37°C下孵育10分钟。停止用于终止反应的溶液。使用微孔板分光光度计（SpectraMax M2e，Molecular Devices，USA）在405 nm下对96个微孔板进行分析。

用钙比色分析试剂盒（中国Beyotime）检测细胞中的钙。用试剂盒中的样品裂解液对细胞进行裂解。在4°C（12000×克，5min），上清液用于检测。按照制造商手册，将50微升标准溶液和样品添加到96 Well板中。将试验溶液（邻甲酚酞络合物的试验缓冲液=1:1）添加到每个孔中（每孔150μl），并在室温下黑暗培养10分钟。96个孔板在575 nm处用微孔板分光光度计（SpectraMax M2e，Molecular Devices，USA）进行分析。

统计分析

所有数据均采用SPSS 22.0（IBM-Corp.，USA）进行统计分析。使用学生的t吨对两个以上亚组的实验进行双侧检验或方差分析。统计显著性标准为第页 < 0.05. 所有可量化结果均以平均值±标准误差的模式表示。

结果

Wnt2和Wnt7b是miR-503-3p的靶点

根据生物信息学数据库的结果，许多物种中miR-503-3p的序列是保守的（图2a） ●●●●。Wnt2 3′-UTR和Wnt7b 3′-UTR可以与miR-503-3p匹配（图。2b、 c）。

图2

Wnt2和Wnt7b是miR-503-3p的靶点。(*第页 < 0.05，这两组之间存在显著差异）一miR-503-3p的序列在物种间高度保守。b条miR-503-3p可能与Wnt2 3′-UTR结合。c（c）miR-503-3p可能与Wnt7b 3′-UTR结合。d日与miR-Ctrl模拟物组和wt-Wnt2组相比，联合转染miR-503-3p模拟物和wt-wn2组hASCs的荧光素酶活性显著降低。与miR-Ctrl模拟物和mut-Wnt2组相比，miR-503-3p模拟物和mut-Wnt2联合转染hASCs的荧光素酶活性无显著性差异。e（电子）与miR-Ctrl模拟物组和wt-Wnt7b组相比，miR-503-3p模拟物和wt-wn7b联合转染hASCs的荧光素酶活性显著降低。与miR-Ctrl模拟物组和mut-Wnt7b组相比，miR-503-3p模拟物和mut-wn7b联合转染的hASCs的荧光素酶活性没有显著性差异。（f）与miR-Ctrl模拟物组相比，实时PCR显示，转染miR-503-3p模拟物的hASC中Wnt2 mRNA水平降低。克与miR-Ctrl模拟物组相比，实时PCR显示，转染miR-503-3p模拟物的hASC中Wnt7b mRNA水平降低。e（电子）蛋白质印迹列在上一栏。Western blot显示，与miR-Ctrl模拟物组相比，转染miR-503-3p模拟物的hASCs中Wnt2蛋白水平降低。（f）蛋白质印迹列在上一栏。western blot显示，与miR-Ctrl模拟物组相比，转染miR-503-3p模拟物的hASCs中Wnt7b蛋白水平降低

为了研究分子机制并确定miR-503-3p是否直接靶向hASCs中的Wnt2和Wnt7b，通过构建miR-503-3p的wt-Wnt2、mu-Wnt2、wt-Wnt7b和mu-Wnt7b结合位点突变进行萤光素酶报告基因测定。然后，将上述载体和miR-503-3p模拟物共同转染到HEK-293T细胞中。

结果表明，转染miR-503-3p模拟物和wt-Wnt2的hASCs显著降低荧光素酶活性1.63±0.39倍（F）(第页 = 0.024）与转染miR-Ctrl模拟物（MCM）和wt-Wnt2的hASC进行比较（图。2d） ●●●●。此外，与转染MCM和mu-Wnt2的hASC相比，miR-503-3p模拟物和mut-Wnt2转染hASC的荧光素酶活性没有统计学意义(第页 = 0.377）（图。2d） ，表明miR-503-3p模拟物调节的荧光素酶活性抑制被mut-Wnt2打破。

结果表明，转染含有wt-Wnt7b的miR-503-3p模拟物的hASCs显著降低荧光素酶活性1.69±0.02-F(第页 < 0.001）与转染wt-Wnt7b和MCM的hASC进行比较（图。2e） ●●●●。此外，与转染mu-Wnt7b和MCM的hASC相比，转染含有mu-Wnt 7b的miR-503-3p模拟物的hASCs的荧光素酶活性没有统计学意义(第页=1.00）（图。2e） 表明mu-Wnt7b破坏了miR-503-3p模拟物调节的荧光素酶活性抑制。

与转染MCM的hASC相比，miR-503-3p模拟物转染hASC的Wnt2和Wnt7b mRNA水平被抑制3.60±0.23-F(第页 = 0.003）和2.32±0.04-F(第页 = 0.001）（图。2f、 g）；western blot分析也表明Wnt2和Wnt7b蛋白水平也降低了1.53±0.07-F(第页 = 0.005）和1.80±0.07-F(第页 = 0.001）（图。2h、 i）。这表明Wnt2和Wnt7b是miR-503-3p在转录和翻译水平介导的靶基因。

循环应变引起的hASCs OD

与无周期性应变加载的hASC相比，与OD相关的mRNA表达（RUNX2、ALP和SPARC；R、A、S）显著增加2.22±0.01-F(第页 = 0.002），1.39±0.01-F(第页 = 0.002）和1.62±0.06-F(第页 = 0.002）；W-β途径基因（Wnt2、Wnt7b和β-catenin；W2、W7、β）增加了1.91±0.17-F(第页 = 0.028），1.72±0.05-F(第页 = 0.034）和1.47±0.11-F(第页 = 0.014）（图三a） ●●●●。

图3

周期性应变诱导hASCs成骨分化。(*第页<0.05，这两组之间存在显著差异）一与无循环应变加载的hASC相比，循环应变加载6天后，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt7b和β-catenin的mRNA表达显著增加。b条蛋白质印迹列于左栏。与无循环应变加载的hASC相比，循环应变加载6天后，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt7b和β-catenin的蛋白表达显著增加。c（c）循环应变加载6天后，ALP活性和Ca含量²⁺增加了

与无循环应变加载的hASC相比，R、A、S蛋白表达显著增加1.81±0.28-F(第页 = 0.002），1.40±0.14-F(第页 = 0.030）和1.74±0.22-F(第页 = 0.004）；W2、W7、β增加1.50±0.14-F(第页 = 0.004），1.36±0.11-F(第页 = 0.006）和1.63±0.08-F(第页 < 0.001），分别（图。三b） ●●●●。

与没有循环应变负载的hASCs相比，ALP活性显著增加，为1.95±0.05-F(第页 < 0.001); 钙含量²⁺增加了2.13±0.17-F(第页 = 0.001）（图。三c） ●●●●。

Wnt2在周期性应变诱导hASCs成骨分化中的作用

为了确定转染效果，通过免疫荧光、实时PCR和western blot检测转染EX-Wnt2、siWnt2，EX-Ctrl和siR-Ctrl的hASCs的Wnt2表达。RT-PCR分析结果表明，EX-Wnt2组Wnt2表达增加2.56±0.16-F(第页=0.013）与EX-Ctrl组比较；siWnt2组Wnt2表达显著降低2.34±0.45-F(第页=0.001）与siR-Ctrl组（图4a） ●●●●。western blot分析结果表明，EX-Wnt2组Wnt2的表达增加了1.37±0.07-F(第页 = 0.009）与EX-Ctrl组相比；siWnt2组的Wnt2表达显著降低1.28±0.03-F(第页 = 0.008）与siR-Ctrl组（图。4b） ●●●●。

图4

Wnt2对周期性应变下hASCs成骨分化的影响。(*第页 < 0.05，这两组之间存在显著差异）一实时荧光定量PCR结果显示，与EX-Ctrl组相比，EX-Wnt2b组的Wnt2b表达增加；与siR-Ctrl组相比，siWnt2组中Wnt2的表达显著降低。b条蛋白质印迹列于左列。western blot结果显示，与EX-Ctrl组相比，EX-Wnt2组Wnt2表达增加；与siR-Ctrl组相比，siWnt2组中Wnt2的表达显著降低。c（c）EX-Wnt2转染后，实时PCR结果显示，与EX-Ctrl组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt7b和β-catenin显著增强。d日siWnt2转染后，实时PCR结果显示，与siR-Ctrl组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt7b和β-catenin显著降低。e（电子）与EX-Ctrl组相比，ALP活性和Ca含量²⁺转染EX-Wnt2后显著增加。（f）与siR-Ctrl组相比，ALP活性和Ca含量²⁺转染siWnt2后显著降低

此外，使用RT-PCR分析确定Wnt2在加载循环应变6天后对hASC OD的影响。转染EX-Wnt2后，R、A、S、W2、W7、β显著增强5.39±2.14-F(第页 = 0.002），3.32±0.80-F(第页 < 0.001），3.66±1.20-F(第页 = 0.003），2.96±0.44-F(第页=0.016），2.28±0.62-F(第页 = 0.001）和3.27±0.49-F(第页 = 0.012），与EX-Ctrl组相比（图。4c） ●●●●。转染siWnt2后，R、A、S、W2、W7、β显著降低3.41±0.09-F(第页 = 0.003），2.55±0.03-F(第页 = 0.001），3.07±0.07-F(第页<0.001），3.19±0.07-F(第页=0.001），1.79±0.11-F(第页=0.011）和3.55±0.10-F(第页=0.001），与siR-Ctrl组（图。4d） ●●●●。转染EX-Wnt2后，ALP活性和Ca含量²⁺显著增加2.26±0.15-F(第页 < 0.001）和1.37±0.17-F(第页 = 0.003），分别与EX-Ctrl组进行比较（图。4e） ●●●●。转染siWnt2后，ALP活性和Ca含量²⁺显著降低1.95±0.19-F(第页 < 0.001）和1.87±0.11-F(第页 < 0.001），与siR-Ctrl组（图。4f） ●●●●。

以上结果表明Wnt2的过度表达增强了hASCs的OD，Wnt2基因敲除抑制了hASC的OD。

Wnt7b在循环应变诱导hASCs OD中的作用

为了确定转染效果，通过实时PCR、免疫荧光和western blot检测转染EX-Wnt7b、siR-Ctrl、EX-Ctrl和siWnt7bhASCs的Wnt7b-表达。RT-PCR分析结果表明，EX-Wnt7b组Wnt7b表达增加2.43±0.10-F(第页 < 0.001）与EX-Ctrl组相比；siWnt7b组Wnt7b表达显著降低2.98±0.02-F(第页 < 0.001）与siR-Ctrl组相比（图5a） ●●●●。western blot分析结果表明，EX-Wnt7b组Wnt7b表达增加1.54±0.12-F(第页 = 0.003）与EX-Ctrl组相比；siWnt7b组的Wnt7b表达显著降低1.81±0.10-F(第页 = 0.003）与siR-Ctrl组（图。5b） ●●●●。

图5

Wnt7b对周期性应变下hASCs成骨分化的影响。(*第页<0.05，这两组之间存在显著差异）一实时荧光定量PCR结果显示，与EX-Ctrl组相比，EX-Wnt7b组Wnt7b表达增加；与siR-Ctrl组相比，siWnt7b组中Wnt7b的表达显著降低。b条蛋白质印迹列于左栏。western blot结果显示，与EX-Ctrl组相比，EX-Wnt7b组Wnt7b表达增加；与siR-Ctrl组相比，siWnt7b组中Wnt7b的表达显著降低。c（c）EX-Wnt7b转染后，实时PCR结果显示，与EX-Ctrl组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt7a和β-catenin显著增强。d日siWnt7b转染后，实时PCR结果显示，与siR-Ctrl组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b和β-catenin显著降低。e（电子）与EX-Ctrl组相比，ALP活性和Ca含量²⁺EX-Wnt7b转染后显著增加。与siR-Ctrl组相比，ALP活性和Ca含量²⁺siWnt7b转染后显著降低

此外，使用RT-PCR分析确定Wnt7b在加载循环应变6天后对hASC OD的影响。转染EX-Wnt7b后，R、A、S、W2、W7、β显著增强3.03±0.01-F(第页 < 0.001），2.29±0.22-F(第页 = 0.007），1.61±0.10-F(第页 = 0.027），2.20±0.38-F(第页=0.034），2.62±0.12-F(第页<0.001）和1.79±0.17-F(第页=0.013），分别与EX-Ctrl组（图。5c） ●●●●。转染siWnt7b后，R、A、S、W2、W7、β显著降低5.33±0.01-F(第页 < 0.001），3.53±0.02-F(第页 = 0.001），2.12±0.03-F(第页 = 0.018），2.00±0.54-F(第页=0.023），4.24±0.40-F(第页<0.000）和2.55±0.27-F(第页<0.001），分别与siR-Ctrl组（图。5d） ●●●●。EX-Wnt7b转染后，ALP活性和Ca含量²⁺显著增加1.38±0.08-F(第页 = 0.008）和1.59±0.04-F(第页 < 0.001），分别与EX-Ctrl组（图。5e） ●●●●。siWnt7b转染后，ALP活性和Ca2+含量显著降低1.65±0.16-F(第页 = 0.001）和1.80±0.15-F(第页 = 0.001），分别与siR-Ctrl组（图。5f） ●●●●。

上述结果表明，Wnt7b的过度表达增强了hASC的OD，Wnt7 b的敲除抑制了hASCs的OD。

β-catenin在循环应变诱导hASCs OD中的作用

为了确定转染效果，通过RT-PCR、western blotting和免疫荧光检测转染了EX-β-catenin、siβ-catentin、EX-Ctrl和siR-Ctrl的hASCs的β-caterin表达。RT-PCR分析结果表明，EX-β-catenin组β-catentin表达增加2.51±0.69-F(第页 = 0.001）与EX-Ctrl组相比；siβ-catenin组β-catentin表达显著降低3.15±0.89-F(第页 = 0.002）与siR-Ctrl组（图6a） ●●●●。western blot分析结果表明，EX-β-catenin组的细胞质和细胞核β-catentin表达增加1.40±0.07-F(第页 = 0.004）和1.42±0.04-F(第页 = 0.002）与EX-Ctrl组相比；siβ-catenin组胞质β-catentin和核β-catetin表达显著降低1.38±0.12-F(第页 = 0.002）和1.38±0.09-F(第页 = 0.032）与siR-Ctrl组（图。6b） ●●●●。

图6

β-catenin对周期性应变下hASCs成骨分化的影响。(*第页 < 0.05，这两组之间有显著差异）一实时荧光定量PCR结果显示，与EX-Ctrl组相比，EX-β-catenin组的β-catentin表达增加；与siR-Ctrl组相比，siβ-catenin组的β-catentin表达显著降低。b条蛋白质印迹列于左列。western blot结果显示，与EX-Ctrl组相比，EX-β-catenin组的细胞质β-catentin和核β-caterin表达增加；与siR-Ctrl组相比，siβ-catenin组的细胞质β-catenin和细胞核β-catenin表达显著降低。c（c）在EX-β-catenin转染后，实时PCR结果显示，与EX-Ctrl组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b和β-catentin显著增强。d日在siβ-catenin转染后，实时PCR结果显示，与siR-Ctrl组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b和β-catentin显著降低。e（电子）与EX-Ctrl组相比，ALP活性和Ca含量²⁺转染EX-β-catenin后显著增加。与siR-Ctrl组相比，ALP活性和Ca含量²⁺siβ-catenin转染后显著降低

此外，使用RT-PCR分析确定β-catenin在加载循环应变6天后对hASCs OD的影响。转染EX-β-catenin后，结果显示R、A、S、W2、W7、β显著增强3.60±1.07-F(第页 = 0.022），3.21±0.49-F(第页 = 0.002），2.45±0.29-F(第页 = 0.004），4.30±1.12-F(第页 = 0.001），4.63±1.88-F(第页 = 0.006）和5.17±1.04-F(第页 = 0.002），分别与EX-Ctrl组（图。6c） ●●●●。转染siβ-catenin后，R、A、S、W2、W7、β显著降低4.92±1.46-F(第页 = 0.001），3.41±0.38-F(第页 < 0.001），2.66±1.27-F(第页 = 0.010），2.23±0.33-F(第页 = 0.004），3.17±1.27-F(第页 = 0.005）和3.38±0.10-F(第页 = 0.003），与siR-Ctrl组（图。6d） ●●●●。EX-β-catenin转染后ALP活性和Ca含量²⁺显著增加1.60±0.16-F(第页 < 0.001）和1.37±0.12-F(第页 = 0.003），分别与EX-Ctrl组（图。6e） ●●●●。转染siβ-catenin后，ALP活性和Ca2+含量显著降低1.50±0.19-F(第页 = 0.021）和1.67±0.06-F(第页 < 0.001），分别与siR-Ctrl组（图。6f） ●●●●。

以上结果表明，β-catenin的过度表达增强了hASC的OD，而β-catentin的敲除抑制了hASCs的OD。

miR-503-3p过度表达和抑制循环菌株诱导的hASCs OD的作用

为了确定miR-503-3p模拟物和抑制剂的转染效率，通过RT-PCR和western blot检测hASCs中miR-503-3p的表达。在hASCs中转染miR-503-3p模拟物后，miR-503-4p显著增加411.49±82.72-F(第页 < 0.001）比MCM组（图7a） ●●●●。在hASCs中转染miR-503-3p抑制剂后，miR-503-3p的表达降低了2.43±0.02-F(第页 = 0.006）比miR-Ctrl抑制剂组（图。7b） ●●●●。

图7

miR-503-3p过度表达和抑制对周期性应变下hASCs成骨分化的影响。(*第页 < 0.05，这两组之间存在显著差异）一与miR-Ctrl模拟组相比，用miR-503-3p模拟物转染的hASCs中miR-503-3p的表达显著增加。b条与miR-Ctrl抑制剂组相比，转染miR-503-3p抑制剂的hASC中miR-503-3p的表达降低。c（c）miR-503-3p模拟转染后，实时PCR结果显示，与miR-Ctrl模拟组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b和β-catenin减少。d日蛋白质印迹列于左栏。miR-503-3p模拟转染后，western blot结果显示RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b、细胞质β-连环蛋白和核β-连环素降低。e（电子）碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺miR-503-3p模拟物转染后显著降低。（f）miR-503-3p模拟转染后，hASC细胞核中β-catenin的免疫荧光强度降低。克miR-503-3p抑制剂转染后，实时PCR结果显示，与miR-Ctrl抑制剂组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b和β-catenin增加。小时蛋白质印迹列于左栏。miR-503-3p抑制剂转染后，western blot结果显示，与miR-Ctrl抑制剂组相比，RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b、细胞质β-连环蛋白和核β-连环素降低。我碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺miR-503-3p抑制剂转染后显著增加。j个miR-503-3p抑制剂转染后，hASC细胞核中β-catenin的免疫荧光强度增加

此外，通过RT-PCR、western blotting、比色分析和免疫荧光测定miR-503-3p对hASCs OD的作用。与MCM组相比，用RT-PCR分析检测miR-503-3p模拟物转染hASC的mRNA表达水平，结果显示R、A、S、W2、W7、β表达水平下降1.90±0.15-F(第页 = 0.028），2.20±0.02-F(第页 = 0.001），1.34±0.08-F(第页 = 0.004），3.17±1.10-F(第页 = 0.005），1.44±0.20-F(第页 = 0.018）和4.23±0.50-F(第页 = 0.001），分别（图。7c） ；western blot检测到R、A、S、W2、W7、β细胞质和核蛋白降低1.90±0.97-F(第页 = 0.030），2.37±0.38-F(第页 = 0.001），1.57±0.24-F(第页 = 0.022），1.43±0.15-F(第页 = 0.038），1.55±0.16-F(第页 = 0.007），1.45±0.25-F(第页 = 0.014）和1.71±0.26-F(第页 = 0.007）（图。7d） ；碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺显著降低1.43±0.14-F(第页 = 0.003）和1.93±0.16-F(第页 = 0.011）（图。7e） ；通过免疫荧光检测，转染miR-503-3p模拟物的hASCs胞质和细胞核中的β-catenin表达降低（图。7f） ●●●●。

与miR-Ctrl抑制剂组相比，用RT-PCR分析检测转染miR-503-3p抑制剂的hASC中以下mRNA的表达水平，结果表明R、A、S、W2、W7、β表达增加2.97±0.11-F(第页 < 0.001），4.38±1.17-F(第页 < 0.001），2.22±0.53-F(第页 = 0.001），2.10±0.44-F(第页 = 0.006），2.45±0.30-F(第页 < 0.001）和1.91±0.24-F(第页 = 0.021）（图。7g） ；western blot检测到上述标记的蛋白表达降低1.73±0.13-F(第页 = 0.023），1.69±0.04-F(第页 = 0.004），2.09±0.09-F(第页 = 0.001），1.43±0.07-F(第页 = 0.006），1.46±0.34-F(第页 = 0.009），1.35±0.06-F(第页 = 0.002）和1.70±0.29-F(第页 = 0.008）（图。7h） ；碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺显著增加2.05±0.05-F(第页 < 0.001）和1.60±0.30-F(第页 = 0.004）（图。7i） ；免疫荧光检测到转染miR-503-3p模拟物的hASCs胞质和细胞核中β-catenin表达增加（图。7j） ●●●●。

我们的研究结果表明，miR-503-3p的过度表达抑制了hASC的OD，而miR-503-3p的抑制促进了hASCs的OD。

miR-503-3p调控的Wnt2和Wnt7b在循环应变诱导hASCs OD中的作用

采用实时PCR、western blotting、比色分析和免疫荧光等方法，通过调节循环菌株诱导的hASCs中Wnt2和Wnt7b的表达，研究miR-503-3p对OD的分子机制。

将miR-503-3p模拟物与EX-Wnt2和EX-Wnt 7b共转染hASCs后，通过RT-PCR分析检测到以下mRNA表达水平，结果显示R、A、S、W2、W7、β表达增加2.67±1.28-F(第页 = 0.003），2.43±0.35-F(第页 = 0.005），1.73±0.19-F(第页 = 0.010），2.06±0.30-F(第页 = 0.006），2.15±1.33-F(第页=0.016）和2.59±0.30-F(第页 = 0.011），分别比miR-503-3p模拟物组和EX-Ctrl组（图8a） ；R、A、S、W2、W7、β细胞质和细胞核的蛋白表达也增加了1.54±0.11-F(第页=0.001），1.44±0.14-F(第页 = 0.002），1.32±0.03-F(第页 = 0.006），1.34±0.04-F(第页 = 0.036），2.96±0.35-F(第页 = 0.001），1.77±0.22-F(第页 = 0.001）和1.59±0.14-F(第页 = 0.010），分别比miR-503-3p模拟物组和EX-Ctrl组（图。8b） ；碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺显著增加1.68±0.04-F(第页 < 0.001）和2.61±0.01-F(第页 < 0.001），分别（图。8c） ；免疫荧光检测到转染EX-Wnt2和EX-Wnt 7b的hASC胞质和细胞核中β-catenin表达增加（图8d） ●●●●。上述结果表明，Wnt2和Wnt7b的过度表达可以纠正miR-503-3p模拟物对循环应变诱导的hASCs OD的抑制作用。

图8

miR-503-3p调控的Wnt2和Wnt7b对周期性应变下hASCs成骨分化的影响(*第页 < 0.05，这两组之间存在显著差异）一将miR-503-3p模拟物与EX-Wnt2和EX-Wnt 7b共转染后，实时PCR显示RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b和β-catenin均比miR-503-2p模拟物和EX-Ctrl组增加。b条蛋白质印迹列于左栏。将miR-503-3p模拟物与EX-Wnt2和EX-Wnt 7b共转染后，western blot显示RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b、细胞质和核β-catenin增加，而miR-503-2p模拟物和EX-Ctrl组增加。c（c）碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺与EX-Wnt2和EX-Wnt 7b共同转染miR-503-3p模拟物时显著增加。d日将miR-503-3p模拟物与EX-Wnt2和EX-Wnt 7b共转染后，细胞核β-catenin的免疫荧光强度增强。e（电子）将miR-503-3p抑制剂与siWnt2和siWnt7b共转染后，实时PCR显示RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b和β-catenin的表达量均低于miR-503-3p抑制剂和siR-Ctrl组。（f）蛋白质印迹列于左列。将miR-503-3p抑制剂与siWnt2和siWnt7b共转染后，western blot显示RUNX2、ALP、SPARC、Wnt2、Wnt7b、细胞质和核β-catenin均低于miR-503-3p抑制剂和siR-Ctrl组。克碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺与siWnt2和siWnt7b共同转染miR-503-3p抑制剂时显著降低。小时将miR-503-3p抑制剂与siWnt2和siWnt7b共转染后，细胞核β-catenin的免疫荧光强度降低。我将miR-503-3p抑制剂与siβ-catenin共转染后，实时PCR显示RUNX2、ALP和SPARC降低；与miR-503-3p抑制剂和siR-Ctrl组相比，Wnt2、Wnt7b和β-catenin减少。j个蛋白质印迹列于左栏。将miR-503-3p抑制剂与siβ-catenin共转染后，western blot显示RUNX2、ALP和SPARC降低；与miR-503-3p抑制剂和siR-Ctrl组相比，Wnt2、Wnt7b、细胞质和核β-catenin减少。k个碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺当miR-503-3p抑制剂与siβ-catenin共转染时显著降低。我将miR-503-3p抑制剂与siβ-catenin共转染hASCs后，细胞核β-catening的免疫荧光强度降低。米用EX-β-catenin联合转染miR-503-3p模拟物后，实时PCR显示RUNX2、ALP和SPARC增加；与miR-503-3p模拟物和EX-Ctrl组相比，Wnt2、Wnt7b和β-catenin增加。n个蛋白质印迹列于左栏。在用EX-β-连环蛋白共转染miR-503-3p模拟物后，蛋白质印迹显示RUNX2、ALP和SPARC增加；与miR-503-3p模拟物和EX-Ctrl组相比，Wnt2、Wnt7b、细胞质和核β-catenin增加。o（o）碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺与EX-β-catenin共同转染miR-503-3p模拟物时显著增加。第页将miR-503-3p模拟物与EX-β-catenin共转染后，细胞核β-catentin的免疫荧光强度增加

将miR-503-3p抑制剂与siWnt2和siWnt7b共转染hASCs后，通过RT-PCR分析检测以下mRNA表达水平，结果显示R、A、S、W2、W7、β降低1.96±0.49-F(第页=0.004），4.17±1.79-F(第页 = 0.013），2.12±0.52-F(第页 = 0.003），3.20±1.22-F(第页=0.002），2.41±0.23-F(第页=0.002）和2.60±1.03-F(第页=0.008），分别比miR-503-3p抑制剂组和siR-Ctrl组（图。8e） ；R、A、S、W2、W7、β细胞质和核β-连环蛋白的蛋白质也减少了1.22±0.15-F(第页 = 0.044），2.12±0.58-F(第页=0.003），1.48±0.15-F(第页=0.005），1.31±0.05-F(第页 = 0.009），1.60±0.23-F(第页 = 0.035），1.32±0.07-F(第页 = 0.015）和1.36±0.12-F(第页 = 0.010），分别比miR-503-3p抑制剂组和siR-Ctrl组（图。8f） ；碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺显著降低1.39±0.16-F(第页 = 0.002）和2.10±0.09-F(第页 < 0.001），分别（图。8g） ；免疫荧光法检测转染siWnt2和siWnt7b的hASC胞质和细胞核中β-catenin的表达降低（图。8h） ●●●●。上述结果表明，Wnt2和Wnt7b下调可减弱miR-503-3p抑制剂对循环应变下hASCs OD的增强作用。

将miR-503-3p抑制剂与siβ-catenin共转染hASCs后，RT-PCR检测到以下mRNA表达水平，结果表明R、A、S降低1.90±0.60-F(第页 = 0.013），3.45±0.90-F(第页 = 0.001）和1.89±0.56-F(第页 = 0.021），W2、W7、β分别下降2.08±0.70-F(第页 = 0.015），1.72±0.16-F(第页 = 0.008）和3.58±0.47-F(第页 = 与miR-503-3p抑制剂组和siR-Ctrl组相比（图。8i） ；R、A、S蛋白下降1.34±0.17-F(第页 = 0.005），1.73±0.39-F(第页 = 0.003）和1.61±0.37-F(第页 = 0.014），Wnt2、Wnt7b、细胞质和核β-catenin蛋白分别下降1.81±0.31-F(第页 = 0.002），1.40±0.09-F(第页 = 0.001），1.37±0.15-F(第页 = 0.005）和2.72±0.55-F(第页 = 与miR-503-3p抑制剂组和siR-Ctrl组相比（图。8j） ；碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺显著降低1.94±0.02-F(第页 < 0.001）和1.61±0.06-F(第页 < 0.001），分别（图。8k） ；免疫荧光检测发现hASCs联合转染miR-503-3p抑制剂和siβ-catenin后，胞质和细胞核中β-catentin的表达降低（图。8l） ●●●●。

将miR-503-3p模拟物与EX-β-catenin共转染hASCs后，通过RT-PCR分析检测mRNA表达水平。结果表明，R、A、S增加了2.30±0.97-F(第页 = 0.006），2.52±0.40-F(第页 = 0.006）和1.97±0.46-F(第页 = 0.004），W2、W7、β分别增加3.00±0.21-F(第页 = 0.003），2.53±0.26-F(第页 = 0.001）和2.86±0.82-F(第页 = 0.010），分别比miR-503-3p模拟物组和EX-Ctrl组（图。8m） ；R、A、S蛋白也增加了4.10±1.05-F(第页 = 0.001），2.08±0.33-F(第页 = 0.002）和1.54±0.08-F(第页 = 0.032），Wnt2、Wnt7b、细胞质和核β-catenin蛋白分别增加1.30±0.03-F(第页 = 0.001），1.36±0.12-F(第页 = 0.022），1.52±0.12-F(第页 = 0.007）和2.49±0.20-F(第页 = 0.015），分别比miR-503-3p模拟物组和EX-Ctrl组（图。8n） ；碱性磷酸酶活性和钙含量²⁺显著增加1.47±0.04-F(第页 < 0.001）和1.68±0.02-F(第页 = 0.001），分别（图。8o） ；在与miR-503-3p模拟物和免疫荧光检测到的EX-β-catenin共同转染的hASC中，β-catentin在细胞质和细胞核中的表达增加（图。8p） ●●●●。

讨论

尽管在“介绍在组织工程的构建部分，ASC的成骨能力低于骨髓间充质干细胞（BMSCs）。Shafiee等人声称，与第7天和第14天OD期间的BMSC相比，ASC降低了ALP活性和矿化度[19]. Vishnubalaji等人也通过以下实验证明了BMSC与ASCs相比具有强大的成骨能力：钙矿化、细胞化学定性分析和骨钙素、ALP和骨桥蛋白的RT-PCR[20]. Park等人得出结论，在这些机械刺激模式下，人类间充质干细胞对机械刺激更敏感，对OD更有效[21]. 尽管如此，hASC仍然是构建组织工程骨的种子细胞之一。

所有组织都在机械环境中生存，机械环境对维持生物活动起着至关重要的作用[22,23,24]. 在干细胞中，诱导成骨的常见生物力学刺激是拉伸、压缩和流体剪切应力。在5%及以下菌株下，发现小鼠骨髓基质细胞中ALP活性和RUNX2基因表达增加，但另一方面，随着菌株的增加，ALP活性降低[25]. 这一结果表明，低张力水平促进OD，而高张力水平抑制OD。压缩在人类BMSCs的软骨生成和OD中起作用。Jagodzinski等人声称间充质干细胞通过持续灌注进行10%的循环压缩；然后，Runx2和骨钙素的表达增加[26]. Li等人报告称，加载流体24小时后，人类间充质干细胞的增殖速度增加，骨钙素和骨桥蛋白的基因表达增加[27]. 这些发现除了为体外构建组织工程骨组织提供支持外，还可以为干细胞治疗修复体内骨缺损提供理论依据。

各种研究证实Wnt2是W-β信号通路的细胞外激活剂[28]. 一些研究表明Wnt2与成骨密切相关。成骨细胞中Wnt2的mRNA水平高于其祖细胞[29]. 与邻近的非癌组织相比，人骨肉瘤组织中Wnt2蛋白的表达升高。此外，与人成骨细胞hFOB 1.19细胞系相比，MG63 OS细胞系的表达显著增加[30]. 与正常培养基中的人牙囊细胞相比，经人牙囊条件培养基诱导后，人牙囊中的Wnt2显著上调[31].

一些研究证实Wnt2受到一些microRNA的直接调控，以控制生物活性。miR-199a-5p通过靶向FZD4、JAG1和Wnt2，抑制Wnt信号因子，在平衡肌源性细胞增殖和分化中发挥作用，从而调节肌生成[32]. 在平滑肌中，靶向Wnt2的MiR-199a-5p在Wnt2介导的增殖和分化过程的调节中起着重要作用。它可能是平滑肌肥大的关键调节剂，对器官重塑至关重要[33]. 当miR-30a-3p/5p被调节时，促进食管鳞癌细胞的增殖。这是在Wnt2和Fzd2被抑制时产生的，从而激活Wnt信号通路[34]. 此外，miR-30a-3p的异位表达在体外显著抑制人肾癌细胞系的迁移、增殖和侵袭，而miR-30a-3p也可以抑制体内肿瘤生长。miR-199a/b-5p的过度表达，然后抑制Wnt2，减少自噬，并诱导细胞凋亡，导致伊马替尼对K562R细胞的疗效增强[35].

各种研究证实Wnt7b是Wβ信号通路的细胞外激活剂和激活剂[36]. Wnt7b在1个月大的小鼠中过度表达1周后显著刺激骨形成[37]. 在19个Wnt配体中，发现Wnt7b在衰老C57Bl/6JN小鼠的骨形成过程中是最具负荷反应的[38]. Wnt7b不仅通过W-β途径促进骨形成，而且部分通过mTORC1激活[39].

一些研究证实，一些微RNA以Wnt7b为靶点控制生物活性。在人主动脉平滑肌细胞中，miR-29b模拟物可以靶向Wnt7b并有效抑制Wnt7b/β-catenin蛋白的表达，而miR-29b-anti-miR能够增加其表达。这表明miR-29b对Wnt7b/β-catenin信号传导具有负调控作用[40]. miR-G-1的过度表达抑制了Wnt7b的表达，进而抑制了宫颈癌细胞的细胞增殖、细胞周期进展、迁移、侵袭和耐药性[41].

一些研究证明miR-503-3p在多种类型的口腔病变中的表达发生了变化。调节p21和CDK4的表达，从而诱导肺癌细胞凋亡[42]. 淋巴管内皮细胞miRNA表达谱和功能分析表明，miR-503-3p可能是淋巴管内皮中ELK3的下游靶点，促进乳腺癌细胞MDA-MB-231、Hs578T和BT20的体外迁移和侵袭能力[43]. miR-503-3p通过直接靶向SMAD2和E-cadherin促进乳腺癌上皮间质转化[44]. miR-503-3p通过调节肿瘤干细胞增殖和自我更新抑制肿瘤生长，并可能通过细胞间通信发挥干细胞抑制因子的作用[45]. 非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂原发耐药患者血浆中上调[46]. miR-503-3p在非肿瘤疾病中也起着关键作用。miR-503-3p在糖尿病肾病患者和1型糖尿病对照组之间的表达差异[47]. miR-503-3p在患有急性呼吸窘迫综合征和急性肺损伤的大鼠中显著下调，这些大鼠获得了骨髓源性间充质干细胞的治疗[48]. miR-503-3p在骨代谢中的作用尚不清楚。我们的研究首次验证了miR-503-3p在OD中的新作用和靶点。它有可能成为骨再生的一个新的调控靶点。我们假设，在体外构建组织工程骨的过程中，抑制miR-503-3p可以促进hASC的成骨分化，缩短时间，加速骨沉积。

结论

在本研究中，我们设计了各种实验来检测miR-503-3p在循环应变诱导hASCs OD过程中的作用。循环菌株通过下调miR-503-3p的表达和上调Wnt2和Wnt7b的表达来调节hASCs OD的体外过程。此外，通过调节miR-503-3p活性，我们得出结论，miR-503-3p通过靶向Wnt2和Wnt7b抑制W-β途径，进而抑制体外循环应变诱导的hASCs OD。