结核分枝杆菌(Mtb)的脯氨酸利用途径最近被确定为体内Mtb持续存在的一个重要因素,这表明该途径可能是一个有价值的抗结核治疗靶点。在Mtb中,两种不同的酶将脯氨酸转化为谷氨酸;第一步是通过黄烷酶脯氨酸脱氢酶(PruB)将脯氨酸氧化为Δ1-吡咯烷-5-羧酸(P5C),第二步是利用依赖NAD+的Δ1-脯氨酸-5-羧基脱氢酶(PurA)将互变异构形式的P5C(谷氨酸-γ-半醛)转化为谷氨酸。在这里,我们描述了Mtb-PruA的三维结构,通过X射线晶体学分别在其apo状态和与NAD+的络合物中以2.5和2.1º的分辨率测定。该结构揭示了其他相关酶常见的保守NAD+结合模式。然而,活性位点的构象差异与二聚体界面的变化有关,表明尽管与其他PruA酶的序列同源性相当高,但选择性抑制Mtb-PruA的可能性。利用重组PruA和PruB,体外重建了结核分枝杆菌的脯氨酸利用途径。使用新型核磁共振方法进行的功能验证表明,PruA和PruB酶的结合足以将脯氨酸转化为谷氨酸,这是单功能脯氨酸利用酶的首次证明。