1.简介

大分子晶体学（MX）数据采集过程中产生的辐射损伤限制了从单晶中获得的信息。它发生在任何温度下，并导致衍射强度的分辨率依赖性降低，单位细胞参数和晶体镶嵌性的变化，以及晶格中大分子的轻微旋转和平移。它还诱导特定的化学变化(例如二硫键断裂，酸性残基脱羧氧化状态金属离子），这可能会阻止结构解决方案或误导生物解释。Garman&Owen（2006）对这些主题进行了全面回顾)拉维利和加曼（2006）)和Garman（2010年).

考虑辐射损伤效应对于优化数据收集规划至关重要。在过去十年中，在对辐射损伤现象的认识和理解方面取得了重大进展。其大多数表现与吸收剂量成正比，如果已知吸收剂量，则可以很好地预测。X射线束的常规测量通量因此，梁的尺寸非常重要。整体各向同性B类-该因子被发现是全球辐射损伤的稳健度量，为100 K.它与吸收剂量呈线性关系，可以写为B类(D类)=，其中B类(0)是B类-零剂量的因子值，D类是吸收剂量和是一个恒定的比例因子，表示B类-因子衰减率（Kmetko等。, 2006; Bourenkov和Popov，2006年; 博雷克等。, 2007, 2010).

一般来说，相同的衰减率（～1 ŲMGy公司⁻¹)在几个独立的研究中观察到所有蛋白质晶体（Kmetko等。, 2006; Bourenkov&Popov，2010年; 欧文等。, 2006; 霍尔顿，2009). 然而，人们仍然普遍认为，一些样品比其他样品更敏感或更耐辐射(例如佩奇科娃等。, 2009). 实际上，辐射灵敏度的明显偏差通常不是由晶体结构但由于光束尺寸不匹配，通量校准错误或其他技术问题。当样品灵敏度或光束校准不确定时，需要通过初步实验，牺牲样品的全部或部分，采用可靠的标准化程序来校准线性损伤模型。因此，我们建立了一种新的自动程序来确定晶体对辐射损伤的敏感性，包括测量样品或其部分的损伤程度。

为了可靠性和可转移性，我们选择在EDNA公司在线数据分析平台（Incardona等。, 2009).EDNA公司是一个开发基于插件的应用程序的框架，专门为X射线实验设计。它现在正进入成熟阶段，有一组定义良好的插件来调用通用数据处理任务(例如数据索引和集成，以及数据收集策略）和一组测试用例，以确保软件的可靠性。EDNA公司最近已集成在ESRF波束线控制接口中Mx立方体软件（Gabadinho等。, 2011)，允许“一键式”样本特征。这一特征充分表征了晶体样品的特征，并产生了一种考虑辐射损伤的数据收集策略。在这里，我们介绍了一种自动程序的开发和测试，该程序用于确定辐射损伤率，提供线性校准和验证B类-因子衰减模型。从该程序中提取的信息可直接用于数据采集的优化规划，同时考虑数据采集规划软件中的辐射损伤，例如最佳（布伦科夫和波波夫，2010年). 使用具有已知辐射灵敏度的测试晶体，该程序也可用于光束线验证和校准通量和梁尺寸。

2.方法

3.测试

选择了六个晶体系统来测试该方法：来自热蛋白分解芽孢杆菌（米勒-迪克曼等。, 2007); 牛胰胰蛋白酶（巴通尼克等。, 1989); 10碱基对寡核苷酸d（AGGGGCCCCT）₂A-DNA（Leal等。, 2009); 含Se-Met的FAE，木聚糖酶10B的阿魏酸酯酶模块热梭菌（普拉茨等。, 2001); RecR来自耐辐射球菌（李等。, 2004); 和β₁-肾上腺素能G蛋白偶联受体（GPCR）梅利格里斯·加洛帕沃（警告等。, 2008).

测量在ESRF光束线ID23-1（Nurizzo）进行等。, 2006)，其中安装了ADSC Q315探测器。样品位置的光束尺寸名义上为35 µm垂直和45 µm水平（半最大全宽）。在此光束线处，入射光束通量持续监测并将测量值近似校准至绝对刻度（光子⁻¹)可在整个能量范围内使用。光束能量和记录值光子通量表1给出了测试的不同晶体在这些实验中，储存环以特殊的填充模式运行，最大电流为90 mA或45 mA（用于GPCR），使用寿命短。操作模式的变化可能会影响光束大小和监视器校准；没有采取特殊措施来纠正这种影响。

为了测试本工作中所述程序的再现性，对于嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶、A-DNA和FAE的大型细长晶体，在同一样品上进行三到六次该程序，同时将晶体的未暴露部分转化为光束。同样，在一个大尼龙环中探测了四个非常小的RecR晶体。这些晶体是由J.Radzimanowski博士在以前用于结晶半径念珠菌RecO综合体（Timmins等。, 2007)属于一种新的体心正交晶型。由M.Bowler博士善意提供的十种GPCR晶体中只有一种显示出可解释的衍射图案。正如Warne之前发表的那样，这些不能在三斜晶格或中心单斜晶格中进行索引等。(2008)，但在原始单斜晶格中，如表1所示精确对称性的知识对于该方法来说不是必需的，对于GPCR晶体来说也不是确定的。

考虑到该方法在束线的常规使用，在没有指定样品的确切化学成分的情况下应用了剂量计算程序，即假设平均蛋白质晶体的默认成分（见图1). 产生的衰减率参数β然后根据放射性核素使用已知样品化学成分进行计算(β_已更正在表2中). 样品组成输入，包括结合的离子和溶剂成分，根据上述文献参考文献进行定义。对于RecR和GPCR，我们分别假设在非对称单元。对A-DNA晶体（Leal等。, 2010)，其占用率总计为每个非对称单元。对于A-DNA和FAE，光子能量选择为10 eV分别低于钴和硒的吸收边，从而避免了近边特征对吸收截面的任何影响。

图1 相对比例（将所有楔体的整体比例标准化为最大值）和B类-影响标称剂量的因素。线性拟合B类-因素与剂量用于计算衰减率（或灵敏度系数）β.实线表示B类-因子和虚线表示相对比例。

辐射损伤数据使用XDS公司在我们手中，对于这些特殊情况，在严重辐射损伤下收集的短楔形数据，XDS公司，与相比MOSFLM公司根据估计值中随机波动的大小判断B类-因素和比例（未显示数据）。

4.讨论和结论

总的来说，数据分析结果如表2所示以及观察到的比例尺和B类-图1所示剂量的因子依赖性对于所有实验，都清楚地证实了本文所述方法的实际适用性。观察到的线性B类-因子对剂量的依赖性强烈支持衰变率的选择β作为损伤的广义度量。标度系数的相对变化明显较小且不可复制。在所有情况下，高分辨率下的比例因子的总体变化都与B类-因素。对于所有自动生成的实验，数据收集协议产生了适合于此相关性的正确采样的实验条件，并确保了足够准确的数据集降到严重的强度衰减水平。这在B类-图1中的系数值在〈中J型〉/〈σ_J型〉表2中给出的值特别是对于衍射很弱的RecR和GPCR晶体。这里，相当高的〈J型〉/〈σ_J型〉和低分辨率（对于GPCR）是因为它们的衍射非常各向异性：选择与最强衍射对应的方向进行数据采集，而分辨率极限的选择是基于对全（球形）分辨率外壳上的数据集统计的估计。

此外，我们注意到，尽管强度有着非常相似和系统的行为与所有实验中的剂量、信噪比变化J型〉/〈σ_J型〉，如表2所示不会产生有效的损害度量。这主要归因于信号和噪声之间关系的复杂性，如Bourenkov&Popov（2010）所述). 考夫曼研究等。(2006)和诺瓦克等。(2009)，两者都使用衰变`R（右）-因子空间(R（右）_d日)（Diederichs，2006年)作为一种损伤指标，报告了辐射敏感性的显著变化，无论是作为辐射防护清除剂的功能，还是在相同制剂的单个晶体之间。这也可能归因于R（右）_d日，这本质上是一个基于信噪比的统计，作为辐射损伤的度量。此外，这些实验中使用的较宽旋转范围将不可避免地增加表观损伤率的变化。

同一晶体各部分（嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶、A-DNA、FAE）之间以及不同晶体之间（FAE 1与FAE公司 2，RecR）明确表示，在“牺牲晶体”实验的两种场景中，一次测量就足以准确确定数据收集策略。这样的实验不会严重依赖于对样品成分（以及吸光度）的准确了解，也不会依赖于精确的光束参数校准。尽管这种选项在日常数据采集实践中似乎非常有用，但我们要强调的是，该方法不应取代或降低向用户提供精确光束参数的重要性。这同样适用于通过各种光谱技术对样品化学成分进行实验表征，例如由microPIXE（Garman，1999年). 这两个组成部分是解释“绝对”剂量刻度上的衰变率的必要先决条件，即就特定系统的辐射灵敏度而言。

这里介绍的测试系统的选择范围很广，不仅在复杂性、散射能力和晶体质量方面，而且在溶剂和结合离子组成方面。中的变化β_已更正不同系统之间的差异又相当小，与长胰蛋白酶晶体两端和中心部分之间的差异相当。我们认为β_已更正系统值小于1 ŲMGy公司⁻¹不准确通量密度校准；最有可能的是，光束比标称值大几微米。由于这个因素，我们的数据不允许进一步推广。

该方法本身已被证明易于使用，并且需要最少的用户交互。实际上，衰变表征所需的时间由光子通量密度，即在现代波荡器光束线上，一个完整的程序可以在大约一两分钟内完成。该实现在计算上是高效的，并且将在收集最后一帧后几秒钟提供最终结果。

很明显，必须推进该程序，对光束大小和形状进行更准确的描述，这可能会对观测到的强度变化产生强烈影响。我们预计将进行一项新的研究，在该研究中，这些问题将得到全面解决，同时集成到EDNA公司平台。