2.1. 测试集选择

病例选自GREMLIN数据库（Ovchinnikov等人。, 2017)，其中包含614个蛋白质中每个蛋白质的30个结构预测，每个蛋白质代表一个Pfam家族（El-Gebali等人。, 2018)结构上没有特征(即Pfam数据库在建模时没有记录到家庭条目中的实验确定结构）。在数据库发布时，已确定了六个家庭的结构。通过挖掘Pfam数据库中与614个家庭相关的结构，确定了2017年1月至2018年12月期间结构特征化后建模的30个家庭。总共36个(补充表S1). 其中，有九个被排除，因为只有衍射数据的分辨率大于3A（一个案例），或者模型的质量太差（九个案例）。建模不良被定义为导致模型（以每个蛋白质沉积的30个结构中的第一个结构表示）产生TM-核（Zhang&Skolnick，2004一)，标准化为目标结构或模型，均<0.5：这些值表明未正确建模整体褶皱（Xu&Zhang，2010). 我们询问剩下的27例患者（表1)可以使用数据库中保存的模型结果进行求解。

表1 年试验的27个测试案例的结果充足的使用GREMLIN模型

PconsFam数据库（Lamb等人。, 2019)包含13 617个蛋白质的单结构预测，同样每个都代表一个Pfam家族。除了处理新的褶皱外，它还包含了结构特征明确的家族模型。上述27例中的22例可从PconsFam数据库中获得。然而，22人中只有6人通过了TM-score>0.5标准，其中一人（PDB条目4xb6型)没有尝试，因为模型相当差（TM评分为0.55）非对称单元。由于合适的PconsFam模型的数量相当少，因此也对选定的其他家族进行了实验，已知PconsFam数据库中有高质量的模型。这些是Ras系列（PF00071），在该系列中，模型用于尝试解决PDB中作为入口沉积的结构1yzq（伊兹克）（分辨率1.78º）和DUF305系列（PF03713；PDB条目5ffa公司; 1.50Ω分辨率）。

2.2. 搜索模型生成

对于27个GREMLIN测试案例，为每个案例存储的30个结构预测被用作直接输入充足的v.1.4.6英寸中央对手方清算所4 v.7.0.68（优胜者等人。, 2011). 当前的默认处理选项用于搜索模型合成：即前十个选项中的每一个防喷器（Zhang&Skolnick，2004）b条)集群，分20步逐步截断，从100%（未截断）降至剩余的5%左右，子集群（Bibby等人。, 2012)使用1或3°半径并移除所有侧链以离开多胺搜索模型。模型被截断成尽可能接近所需百分比间隔的容器，但由于蛋白质序列是可变长度的离散实体，因此它们并不总是可以均匀地划分成所需容器。当报告截断仓的实际大小时，仓的大小可能与理想的百分比值有一点不同。

为了进行比较，还进行了两次尝试：所有30个结构预测都直接呈现给相位器作为一个整体，单个“最终模型”的单独数据库中的条目在充足的单结构模式（里格登等人。, 2018)使用VoroMQA公司（Olechnović&Venclovas，2017年)提供超过20个阈值的连续质量分数。指定保留侧链或编辑聚丙氨酸，以便为每种情况导出40个搜索模型。

由于PconsFam数据库仅包含每个Pfam家族的单个模型，因此尝试了三种方法。首先，在充足的使用上面的单结构模式执行，使用VoroMQA公司蛋白质结构质量预测。其次，罗塞塔以PconsFam模型为基础进行改造。这种方法以前用于核磁共振谱系综，并被证明可以提高性能。使用-nmr重塑标记原因充足的为了将输入结构理想化，这里使用PconsFam模型，然后使用提供的目标序列将结果重新建模为许多新结构，以片段相关的方式对构象空间进行采样。片段库是从罗贝塔服务器（Kim等人。, 2004)选择了“排除同系物”选项，以便重塑不受目标结构或同系物的任何知识的影响。这里，从每个PconsFam模型导出了100个结构，并给出了充足的用于如上所述的聚类和截断。第三，对于选定的目标，使用康科德（德格罗等人。, 1997)如前所述（Rigden等人。, 2018). 简而言之，CONCOORD公司从给定结构中提取约束，然后使用距离几何方法构建一组不同于原始结构但遵守导出约束的变体结构。使用此过程，填充不太好的区域（如循环）在生成的导数结构中显示出结构差异，因此，通过充足的算法会被截断。

2.3. 分子替换

在充足的管道，BUMP先生（基冈等人。, 2018)使用测试搜索模型相位器v.2.8.2（麦考伊等人。, 2007; Read&McCoy，2016年). 默认值充足的-使用了0.1°的估计r.m.s.d.误差，但该值由内部调整相位器与整体的内部结构可变性不一致。成功被认为是一个产生地图的位置相关系数（CC）为0.25或更高，使用phenix.get_map_cc_mtz_pdb（亚当斯等人。, 2010). 所有这些病例在使用SHELXE公司（Thorn&Sheldrick，2013）)，只有PDB条目例外5uw2型其衍射数据仅为2.9º分辨率，得分略低，为24.8分。所有这些解决方案都可以细化为R（右）_自由的小于0.45，只使用海盗（Cowtan，2006年)加REFMAC公司（穆尔舒多夫等人。, 2011)默认操作中内置的协议充足的或者，必要时（对于PDB条目5个月和5uw2型)，通过直接精炼相位器放置REFMAC公司（穆尔舒多夫等人。, 2011)或手动建模。为了进行比较，我们尝试使用理想螺旋模式来解决所有27个问题充足的带有相位器每个搜索模型的时间限制为24小时。

2.4.辛巴德

辛巴德是一种MR管道，使用旋转功能筛选大型结构数据库（Simpkin等人。, 2018).辛巴德最近已修改为在中运行类似增强的快速旋转功能相位器（辛普金等人。, 2019). 这增加了管道的灵敏度，也允许用集合代替单个搜索模型。这个MoRDa公司（Vagin&Lebedev，2015年)集成数据库辛巴德通常针对的被修改为包括充足的-从GREMLIN数据库中的模型导出的信号群。初步实验表明，旋转函数不够敏感，无法识别这些不良模型，因此辛巴德已修改为在中运行类似增强的快速翻译搜索相位器（麦考伊等人。, 2005)但只能在旋转函数中确定最佳方向。在这项工作中，针对MR和精细化，与之前出版的作品中按轮换得分排名前200的解决方案相反。

3.1. 使用GREMLIN数据库中的模型

研究的27个案例包括许多具有挑战性的案例，因为模型和目标之间的结构偏差相对较高，和/或不对称装置：只有八个箱子里有一条链子非对称单元。当GREMLIN结构预测提供给充足的对于其默认的聚类和截断方法，27个案例中的9个得到了解决(补充表S1). 这九种情况包括四种跨膜螺旋蛋白、一种球形螺旋蛋白和四种混合折叠蛋白。因此，成功跨越了所有折叠类，但数字太小，无法表明某些类型的蛋白质是否特别（不）有利。总体上，最终成功的结构预测可视为中等质量，在C上的均方根误差为1.5–2.8º^α原子（TM-核0.63–0.84）与目标。解决的情况包括112–355个残基的长度范围和1.35–2.85º的分辨率范围。

在大多数情况下，给定Pfam家族的建模成员与最终结构特征的成员密切相关（>90%共享序列身份）。然而，有三个例外。第一个是PDB条目5立方英尺，的晶体结构属于沼泽红假单胞菌PduL，用磷酸丙酰基转移酶模型求解巨大芽孢杆菌（Pfam PF06130，UniProt D5DKA5），与之仅共享49%的序列同源性。第二个是PDB条目5月5日，结构超嗜热菌甘油-3-磷酸酰基转移酶，其中模型来自枯草杆菌（Pfam PF02660，UniProt Q45064）与靶基因的序列同源性仅为36%。最引人注目的是PDB的加入5毫升，磷酸二氢甘露糖合成酶的结构，其中未表征的GtrA家族蛋白的模型来自枯草杆菌（Pfam PF04138，UniProt O31821）与靶基因的序列同源性仅为20%。当考虑到这些相对遥远的同源物的成功时，值得记住的是，对于整个超家族中共享的特征，强烈影响建模的协方差信号将最强。这很可能有助于生成用于解决超家族目标的模型。然而，GREMLIN结构预测也确实来源于全原子、完全序列感知的方案，该方案有望对同源蛋白做出真正不同的预测。因此，令人鼓舞的是，结构预测可以解决相当遥远的同源目标。在这里提到的三个案例中，GREMLIN预测的二级结构与目标的二级架构非常匹配(补充图S1–S3).

如预期，在非对称单元解决的频率较低，但充足的PDB条目成功5节（两条链条）和PDB入口5uw2型（三条链条）。由于一些目标包含多个域，因此搜索模型有时仅表示目标的一部分。PDB条目就是这样5毫升，其中可用模型为123个残基长，但求解了352个残基的结构。

这九个案例的解决难易程度，以成功的搜索模型集成的比例表示，差异很大。用于PDB条目第5版170个搜索模型中有132个（78%）成功，而PDB条目成功5节成功率为6／132（4.5%）。PDB条目第5版使用包含11–100%起始模型残留物的搜索模型进行求解，而其他模型的求解范围较窄：PDB条目为27–41%5毫升例如。最短的成功搜索模型包含模型（PDB条目）起始结构（19个残基）的7%5兹比). 该目标是大肠杆菌脂蛋白二酰基甘油转移酶是一种长度为300个残基的完整膜酶，测定分辨率为1.6℃。7%的成功搜索模型包含一对反平行螺旋线。给定目标的成功搜索模型往往来自不同的集群，但包含最多输入30个模型的集群1并不总是成功的：PDB条目5立方英尺例如，仅使用从集群2和集群3派生的搜索模型进行求解。总的来说，结果表明，聚类和截断方法在充足的对从沉积模型导出的系综的许多非平凡编辑进行集中采样，是处理这些结构的合适策略。

需要在充足的两种简单的基线方法的较差性能说明了最佳性能。当使用分别提供给GREMLIN数据库中集合的每个蛋白质的顶层模型时，使用VoroMQA公司质量测量产生一系列截断导数，只有两种情况得到解决，PDB条目5毫升和第5版其次，当30个结构作为一个整体呈现给相位器直接解决了一个案件。成功的案例是PDB进入第5版其中，整体中的模型与真实结构相比的r.m.s.d.介于1.59到2.30Ω之间（TM核为0.4到0.87）。

毫无疑问，所展示的成功涵盖了使用基于碎片的方法可能替代解决的目标（罗德里格斯等人。, 2009; Jenkins，2018年). 虽然简单的理想螺旋模式充足的表现相对较差，只解决三个目标，更复杂的方法可能表现得更好，特别是在衍射数据分辨率较高、富含螺旋成分和/或较小的情况下非对称单元内容。因此，需要解决的更具挑战性的案例包括PDB条目5立方英尺，很大程度上β-包含两个～200-残留链的结构，PDB入口5瓦2，衍射分辨率仅为2.9º，PDB入口5节，其中衍射数据的分辨率为1.65º，但非对称单元含有510个残留物。图2举例说明，在这三种情况下，最成功的搜索模型只被适度截断到起始结构的54%、70%或80%，这表明正确的总体折叠预测很重要（另请参见补充图S4–S6). 相比之下，PDB条目的最佳搜索模型5azb公司（图2)只包含初始结构的12%，成功需要将其截断到33%以下(补充图S7). 这一观察结果证明了抽样的重要性充足的在很大范围内截断。

图2 (一)从GREMLIN数据库中获得的PF01790（品红色）的30个模型与结晶结构、PDB条目一致5azb公司（彩虹从N端的蓝色到C端的红色）。(b条)表现最好的充足的-衍生系综（品红色），通过将簇1截短至12%（33个残基）而衍生，与结晶结构对齐，PDB条目5兹比（彩虹）。(c)从GREMLIN数据库中获得的PF02470（品红色）的30个模型与结晶结构、PDB条目对齐5uw2型（彩虹）。(d日)表现最好的充足的-导出系综（洋红），通过将簇2截断到80%（96个残基）导出，与晶体结构，PDB条目5uw2型（彩虹）。(e（电子）)从GREMLIN数据库中获得的PF03883（品红色）的30个模型与结晶结构、PDB条目对齐5节（彩虹）。(（f）)表现最好的充足的-衍生系综（洋红），通过将簇1截断至54%（137个残基）而衍生，与结晶结构、PDB入口对齐5节（彩虹）。(克)从GREMLIN数据库中获得的PF06130（品红色）的30个模型与结晶结构、PDB条目一致5立方英尺（彩虹）。(小时)表现最好的充足的-衍生系综（品红色），通过将簇3截断至70%（138个残基）而衍生，与结晶结构、PDB入口对齐5立方英尺（彩虹）。

3.2. 使用PconsFam数据库中的模型

应用相同的TM核心阈值0.5，表明预测褶皱大致正确（Xu&Zhang，2010)，在上述27个家庭中，只有5个家庭的PconsFam结构预测足以进行MR试验。PconsFam仅包含Pfam结构域代表性蛋白质的单结构预测。因此采用了三种不同的策略：根据局部模型质量预测从VoroMQA公司服务器，使用距离几何方法生成信号群CONCOORD公司和罗塞塔以PconsFam沉积为起点进行重塑。

最简单的方法是根据预期质量分数编辑单个模型，但未能解决五个目标中的任何一个。罗塞塔在五个PDB条目中，有两个条目的重塑是成功的5×j5和5azb公司它们都是跨膜螺旋蛋白。PDB条目5×j5用49个搜索模型中的两个进行求解，这两个搜索模型是从包含23或41个残基的第一个簇中截短的集合。这个SHELXE公司跟踪使用自动重建海盗在充足的管道到最终R（右）_自由的值为28–29%。更大的搜索模型c1_23_r3_polyAla（其中c1表示从簇1导出，23表示保留了23%的初始模型，r3表示3º子簇半径，polyAla表示侧链处理）包含目标结构的大多数C端三螺旋子域，预测更准确（图3). PDB条目5azb公司通过生成的200个搜索模型进行求解。它来源于第七个簇并被截断，直到包含57个残基，主要由四个跨膜螺旋的部分组成。同样，自动化重建产生了R（右）_自由的占29%。这两种情况都没有通过更简单、耗时更少的集成生成方法来解决CONCOORD公司.

图3 (一)PF02660（品红色）的PconsFam模型与结晶结构、PDB入口对齐5jx5码（彩虹）。(b条)未经授权的充足的合奏（洋红丝带），如下罗塞塔重塑，与结晶结构对齐，PDB入口5jx5码（彩虹）。(c)被截断的充足的从罗塞塔-PF02660（品红色）的PconsFam模型的改型版本与结晶结构、PDB入口对齐5jx5码（彩虹）。

为了进一步探索将PconsFam模型转换为成功搜索模型的方法，对Ras蛋白进行了一些试验（Pfam加入PF00071；PDB条目1yzq（伊兹克）)和DUF305（PF03713；PDB条目5ffa公司). 对于这些，高质量的结构预测可用TM-scores分别为0.85和0.76，并使用罗塞塔重塑。Ras结构通过生成的175个搜索模型集合中的29个进行了求解，这些集合源自簇1、2、3或7，包含53–170个残基（170个残余物是模型的完整大小），并对其进行跟踪和精炼R（右）_自由的值低至33%充足的管道。DUF305结构用175个搜索模型集合中的18个解算。这些来源于簇2、簇3、簇6或簇7，包含79到143个残基，并自动追踪和精炼至R（右）_自由的值低至33%（表2）。

表2 试验的七个测试用例的结果充足的通过Rosetta重塑PconsFam模型

有趣的是，CONCOORD公司-导出的系综可以解决Ras结构，但不能解决DUF305情况。在成功运行的过程中，在总共生成的400个搜索模型集合中，有7个是成功的，它们来自集群5、7、8或9，包含原始模型的50–75%，对应79–119个残基。虽然来自不同的集群，但成功的搜索模型在丢弃建模不太准确的回路，但保留捕获良好的二级结构元素的核心褶皱方面相似（图4).

图4 (一)PF00071（品红色）的PconsFam模型与结晶结构、PDB入口对齐1年（彩虹）。(b条)一个未加密的充足的合奏（洋红丝带），如下康科德与结晶结构对齐，PDB入口1yzq（伊兹克）（彩虹）。(c)充足的从CONCOORD公司PF00071（品红色）的衍生物与结晶结构对齐，PDB条目1yzq（伊兹克）（彩虹）。

有几个因素可能有助于罗塞塔改造方法与单个PconsFam模型进行了比较。最明显的是，重塑靶标序列可以使结构更接近靶标，尤其是在靶标和PconsFam沉积之间的序列一致性较低的情况下。这将结合使用复杂的能量函数罗塞塔（阿尔福德等人。, 2017)，而不是使用更简单的函数CONFOLD公司PconsFam（Adhikari）中的结构构建算法等人。, 2015)，以可能实现更准确的建模，即PconsFam结构可以通过罗塞塔步骤。其次，基于协方差信息引导的距离几何方法的建模，如PconsFam中的建模，通常会导致局部主干几何结构较差的结果。通过在中运行基于碎片的重塑，主干几何结构可能会得到改进罗塞塔最后，正如已经确立的那样（钱等人。, 2007; 里格登等人。, 2008)通过对重构产生的多个结构进行比较，可以推断质量，从而能够截断到更精确的建模核心区域。补充表S3显示了PconsFam模型和罗塞塔源自它们的结构。

结果证实，根据Ramachandran图统计数据和总体G公司-在主干二面体上计算的因子，正值表示质量更好。然而，这些表明罗塞塔通常不会对PconsFam模型进行改进：事实上，在四种情况中，有三种情况下，模型的平均正确性（以TM-scores衡量）比PconsFam启动模型差。在起步结构质量较差的地方，似乎罗塞塔基于碎片的构象探索可以有效地展开结构。未来试图防止这种情况发生的选项可能包括施加进化协方差衍生的接触预测或更广义的约束，以将结构保持在起始模型附近。然而充足的基于聚类的协议可以容忍输入集之间的一些展开结构。

总的来说，结果表明，简单编辑单结构PconsFam模型不太可能将其转换为成功的搜索模型。然而，如果正确捕获了整个褶皱，罗塞塔用随后的聚类和截断进行重构以生成集合是有效的。这种方法明显优于CONCOORD公司用于集成生成。

3.3.辛巴德和从数据库派生的搜索模型

辛巴德是一个序列相关的MR管道，它尝试使用晶格搜索、已知污染物结构的精选数据库搜索和/或从MoRDa公司数据库。自从最近的发展辛巴德（辛普金等人。, 2019)通过使用相位器代替原件AMoRe公司通过使用集合搜索模型，我们测试了截断的搜索模型集合是否来源于成功的GREMLIN数据库充足的也可以在辛巴德.

大规模成功MoRDa公司屏幕可以通过两种方式出现辛巴德首先，如果测试的搜索模型生成相位器RFZ足够高（>7），通常表示精确的旋转，然后立即在完整MR协议中进行试验，试验成功(R（右）值低于0.45和/或LLG>120和TFZ>8）将导致终止辛巴德没有测试任何剩余的搜索模型。或者，如果没有搜索模型达到RFZ阈值，则在所有搜索模型的旋转功能屏幕的末尾，对具有最高RFZ分数的200进行全MR试验。

GREMLIN结构预测最多具有中等精度，需要大量处理才能成功。因此，我们首先评估了他们是否会对RFZ值进行打分，从而有可能全面进入前200名MoRDa公司+GREMLIN跑步。补充表S4显示了由生成的截断搜索模型范围获得的RFZ值范围充足的对于成功解决的案例。总的来说，结果有些令人失望：没有一个搜索模型集合的RFZ大于6.11。尽管已满辛巴德没有运行，经验表明这些值不太可能放置搜索模型集合，即使那些最终成功的充足的，位列前200名。因此，他们永远不会进行完整的MR步骤。

为了提高辛巴德进一步，我们尝试添加相位器在旋转搜索中，平移功能只针对排名靠前的方向。我们推断，放置搜索模型将提高良好搜索模型的信噪比。初步结果表明，这种方法效果良好：例如，PDB条目的搜索模型集合5×j5LLG和TFZ的得分分别高达90.35分和7.68分，而PDB参赛的合奏第5版LLG和TFZ得分分别高达147.32和13.05。这些值表示成功。

的一个版本辛巴德其中数据库，在本例中MoRDa公司以GREMLIN衍生系综为补充，利用旋转函数结合快速平移函数进行筛选，然后生成快速平移函数。作为原则证明，这在PDB条目中进行了测试5分贝由于观察到TFZ得分较高。这取得了明显的成功充足的在前200名中报告的信号群（c1_74_r3_polyAla、c1_t89_r3_PolyAla1、c1_t74_r1_polyAla-1、c1_t79_r1_polyAla、c1_t84_r3.polyAla和c1_t100_r3_colyAl），最佳示例如图5所示.

图5 的交叉立体视图充足的合奏（c1_t74_r3_polyAla），在辛巴德搜索与结晶结构对齐的PF09819（品红色），PDB条目第5版（彩虹从N端的蓝色到C端的红色）。

当然，附加的翻译功能可以增加辛巴德，但这将在一定程度上通过更频繁的提前终止来弥补，因为可以提高灵敏度，从而选择好的搜索模型。