1.简介

VI型分泌系统（T6SS）是革兰氏阴性菌中发现的一种多蛋白复合物，参与将各种效应蛋白传递到靶细胞中。它被认为在进化上与噬菌体（例如T4）的可收缩尾集合有关，与R型脓毒肽也有相似的收缩机制（Leiman等。, 2009; 巴斯勒等。, 2012; Ge公司等。, 2015). 这些纳米机器利用一个称为基板的平台，在基板上聚合一个由收缩鞘包围的管子。内管在基板端用蛋白质覆盖，蛋白质提供锥形端，这有助于靶细胞在鞘收缩时穿透基板（Leiman等。, 2009; 施奈德等。, 2013; Ge公司等。, 2015). T6SS由13个核心亚单位的多个拷贝和一个PAAR末端蛋白组成，这些蛋白可分为两个主要成分。第一种是膜复合物，由TssJ、TssL和TssM各十个拷贝组成。它们一起形成一个跨膜组件，作为另一个组件“注射机械”的“锚”。此外，它允许收缩管和相关效应蛋白通过细菌（Zheng&Leung，2007）; 博伊尔等。, 2009; 杜兰德等。, 2015; 钱法内利等。, 2016). 注塑机由两个子综合体组成。其中一个包含管，该管由TssD（Hcp）的堆叠六聚体组成，并由三聚体TssI（VgrG）和单个PAAR亚基覆盖。管子周围是TssBC的聚合异二聚体，排列成六螺旋，形成收缩鞘（Basler等。, 2012; 施奈德等。, 2013; 布鲁内特等。, 2014; 库巴河等。, 2014; 王等。, 2017). 管子和护套组装在第二个子综合体基板上，基板包含TssE、TssF、TssG和TssK。在鞘对基板收缩的过程中，内管和相关效应蛋白被驱动穿过基板中心的开口（Pukatzki等。, 2007; 布鲁内特等。, 2015; 泰勒等。, 2016). 构建后，鞘被AAA+ATPase TssH（ClpV；Bönemann）回收等。, 2009; 巴斯勒等。, 2012).

直到最近，人们对T6SS复合物中TssA亚单位的作用和位置知之甚少。已经证明，所有的TssAs都包含一个保守的N末端区域，该区域包含一个未知功能域ImpA_N（Pfam PF0681224；Finn等。, 2016)除了发散的C末端区域（Shalom等。, 2007; 佐伊德等。, 2017). 肠聚集物的荧光显微镜和低温电镜结构研究进展大肠杆菌（EAEC）和霍乱弧菌T6SS分别表明，在管和鞘聚合过程中，TssA位于生长的TssBCD复合物的基板远端并保持不变（Zoued等。, 2016; 纳扎罗夫等。, 2018). 此外，对EAEC TssA（Ec042_4540；Ec-TssA）结构域的蛋白水解和结构研究确定了一个假定的三域组织，对应于N末端结构域、中间结构域和C末端结构域，并为后两个结构域提供了X射线结构。这表明C末端结构域被组织成一个六角星，由12个亚基组成D类₆对称（Zoued等。, 2016).

我们观察到，与Ec-TssA相比，某些TssA同源物在C末端短约40个氨基酸。这促使对一种TssA亚单位AHA1844进行调查，该亚单位存在于嗜水气单胞菌ATCC 7966。在本文中，我们报告了生成合适的结构以结晶A.嗜水癖TssA（Ah-TssA）及其组成域（N末端域，Nt1；中间域，Nt2；C末端域，CTD）。此外，我们提供了来自Ah-TssA Nt2和Nt2-CTD结构域的蛋白质的首次结晶试验和X射线衍射数据，作为确定这些结构域的结构及其与EAEC TssA的关系的初始步骤。

2.材料和方法

2.1. 高分子生产

使用Ec-TssA和Ah-TssA的氨基酸序列比对来定义Nt1、Nt2和CTD的结构域边界（图1). 编码Ah-TssA或Ah-TSaA结构域（UniProt A0KJC7）的DNA从A.嗜水癖ATCC 7966（塞沙德里等。, 2006)由聚合酶链反应（PCR）使用表1中描述的引物对然后使用兼容的限制性位点将产物连接到第一个T7启动子下游的pACYCDuet-1表达载体（Novagen）中。含有tssa公司DNA被转化为大肠杆菌菌株JM83（Yanisch-Perron等。, 1985)，通过核苷酸测序验证，然后转化为大肠杆菌BL21（DE3）细胞（Novagen；Studier&Moffatt，1986年)蛋白质过度生产（Hanahan，1983年).

表1 底漆和结构设计 粗体序列表示限制位点。 构造 他的6.Ah-TSA His6.Ah-TSA Nt1 His6.Ah-TssA Nt2 Ah-TssA CTD系统 他的6.Ah-TSA Nt2-CTD 正向底漆 GCGC公司AGATCT公司AATGAGCTATCACACCCTG公司 GCGC公司AGATCT公司AATGAGCTATCACACCCTG公司 GCGC公司GGATCC公司AGGCGTCGACGTCGACAGTTC公司 GCGC公司GGATCC公司GAGTGCGGGCATTGGCGAGGC公司 GCGC公司GGATCC公司AGGCGTCGACGTCGACAGTTC公司 反向底漆 GCGC公司AAGCTT公司TCATTTCGACACGCGCCG公司 GCGC公司GGTACC公司TTAGCTGGAACTGCGACCGGTCGACG公司 GCGC公司AAGCTT公司附加条款 GCGC公司AAGCTT公司TCATTTCGACACGCGCCG公司 GCGC公司AAGCTT公司TCATTTCGACACGCGCCG公司 克隆/表达载体 pACYCDuet-1型 pACYCDuet-1型 pACYCDuet-1型 pACYCDuet-1型 pACYCDuet-1型 限制站点 BamHI和HindIII BamHI和KpnI BamHI和HindIII BamHI和HindIII BamHI和HindIII 表达式宿主 大肠杆菌BL21（DE3） 大肠杆菌BL21（DE3） 大肠杆菌BL21（DE3） 大肠杆菌BL21（DE3） 大肠杆菌BL21（DE3） 氨基酸 伊斯6.（1-478）（52.6 kDa） 伊斯6（1–229）（26.0千Da） 伊斯6（223–387）（19.7千Da） 381–478（10.7千Da） 伊斯6.（223–478）（29.8 kDa）

图1 假定Ah-TssA和Ec-TssA的域边界。Ec-TssA的蛋白质水解和结构研究确定了Nt1、Nt2和CTD的假定域边界（Zoued等。, 2016). 该信息与Ah-TssA和Ec-TssA之间的序列比对一起用于设计适合结晶的Ah-Tss a结构域。该键指示分配给每个假定域的颜色。

代表全长蛋白质的Ah-TssA结构体、三个已识别的结构域（Nt1、Nt2和CTD）以及其中两个结构域的组合（Nt2-CTD）生长在37℃的2 l BHI肉汤（Oxid）中，其中25µg ml⁻¹氯霉素。一旦培养达到OD₆₀₀在0.5–0.7的范围内，加入IPTG，最终浓度为1 mM（M）（0.1米M（M）用于诱导每个表达载体中存在的T7启动子（表1). 在收获细胞之前，将培养物在37°C下再培养2–3小时（使用30°C诱导合成His6.Ah-TssA、His6.Ah-TssA-Nt1和His6.Ah-TssA-Nt2）。收获的细胞在50 m内重新悬浮M（M）Tris–HCl pH 8.0，含2mM（M）EDTA，200米M（M）氯化钠、10%甘油（每克细胞糊5毫升），用溶菌酶处理（0.2毫克毫升⁻¹)在4°C下保持30分钟，然后使用脱氧胆酸钠（0.5 mg ml⁻¹)和PMSF（25µg ml⁻¹)再持续30分钟，并通过超声波溶解[EDTA被省略，咪唑（10 mM（M）如果要通过镍亲和力纯化蛋白质，则包括最终浓度色谱法，如果在超声处理步骤之前将细胞糊冷冻，则省略溶菌酶和脱氧胆酸钠步骤]。然后在35000下离心30分钟以清除裂解液克.

His-tagged蛋白质(即。除Ah-TssA CTD外的所有构建物均应用于5 ml HisTrap HP 5 ml色谱柱（GE Healthcare Life Sciences）上，并用咪唑线性梯度洗脱（10–500 mM（M）). SEC（Superose 6 10/300 GL，GE Healthcare Life Sciences）在50 m深处进一步纯化了His6.Ah-TssAM（M）Tris–HCl pH 8.0，含500mM（M）氯化钠。首先用4M（M）硫酸铵和颗粒随后在50m内再次悬浮M（M）Tris–HCl pH 8.0，应用于阴离子交换柱（Resource Q 6 ml，GE Healthcare Life Sciences）上，然后用线性梯度的NaCl（0-500 m）洗脱M（M）). SEC（HiLoad Superdex 200 16/600，GE Healthcare Life Sciences）在50 m深处进一步纯化了Ah-TssA CTDM（M）Tris–HCl pH 8.0，含500mM（M）氯化钠。通过SDS–PAGE和随后的染色分析蛋白质纯度。

3.结果和讨论

如前所述，全长TssA结构体、His6.Ah-TssA和四种不同的结构域结构体均成功过度生产和纯化。纯化后的最终蛋白质产量为14 mg（His6.Ah-TssA）、5.6 mg（Hic6.Ah-TSA Nt1）、2.7 mg（His6.Ah-TssA Nt2）、7.2 mg（Ah-TsA CTD）和16 mg（His 6Ah-TssA Nt2-CTD）。凝胶过滤分析表明，His6.Ah-TssA Nt1是单体，His6Ah-Tss a Nt2是二聚体，而His6.Ah-TssA、Ah-TsA CTD和His6.Ash-TssA-Nt2-CTD的凝胶过滤表明，其分子量分别约为0.6、0.2和0.4 MDa，表明存在较大的络合物。

对全长蛋白和四个结构域进行了结晶试验，其中两个（His6.Ah-TssA Nt2和His6.Ah-TssA Nt1-CTD）产生了适合在牛津钻石光源进行数据采集的晶体（图2). 对两种纯化蛋白结构（His6.Ah-TssA Nt2和His6.Ah-TssA Nt1-CTD）的SDS-PAGE分析表明，初始纯度约>95%（补充图S1）。晶体衍射分辨率分别为2.05和3.75欧。这个非对称单元据估计，His6.Ah-TssA Nt2晶体中含有两个分子，马修斯系数可能为2.53 Au^三 Da公司⁻¹计算His6.Ah-TssA Nt2-CTD晶体数据的可能马修斯系数表明非对称单元包含10到18个亚基。基于4–16°分辨率的所有数据和积分半径范围对自转函数进行分析，没有发现His6.Ah-TssA Nt2-CTD在非对称单元。来自浸汞His6.Ah-TssA Nt2晶体的2.3º分辨率的初步数据提供了可拟合序列的初始图，表明晶体属于Nt2结构域（补充图S2).精炼目前正在进行结构的改进和收集更高分辨率数据的尝试。

图2 Ah-TssA结构域的晶体。(一)0.04年生长的His6.Ah-TssA Nt2晶体M（M）磷酸一钾，16%(周/v（v）)聚乙二醇8000，20%(v（v）/v（v）)甘油。(b条)在0.2中最佳生长的His6.Ah-TssA Nt2-CTD晶体M（M）醋酸钠，0.1M（M）柠檬酸钠pH 5.5，10%(周/v（v）)聚乙二醇4000。