2.1. SR-XRF设置

SR-XRF装置安装在金刚石光源同步加速器的B16弯曲磁铁测试光束线上，用于多次实验（见图1)，一种光束线，致力于根据各种实验的特殊要求轻松调整和调整（萨维尼等。, 2010, 2011). 钻石光源储存环以自顶向下模式运行（3 GeV电子能量，300 mA环电流）。对于SR亚微米XRF实验，用RuB设置X射线能量₄C双多层单色仪（英国牛津大学FMB有限公司），可用于产生8–20 keV范围内的高通量单色光束（Diamond，2017一). 光束由Kirkpatrick–Baez（KB）镜对（钻石光源有限公司，内部设计和施工）聚焦。样品台由基于压电晶体的电机（每个xyz公司轴是ECS5050压电级；Attocube Systems AG，Munich，Germany）和高纯度丙烯酸甲酯样品架，该样品架由钻石光源的透明光活性树脂（Form 2，Formlabs Inc.，Somerville，USA）进行3D着色。主光束与样品之间的角度为45°。此外，该装置配备了光学显微镜（Optem Fusion，Qioptiq），聚焦在样品的背面（见图1). 这样可以快速识别感兴趣的区域。在与样品成45°角或与主光束成90°角的情况下检测到XRF辐射。注意，由于设置的几何形状，特别是主光束和样品之间的45°角，水平分辨率随着样品厚度的增加而恶化。此外，当显微镜从背面看到样品时，样品应该是透明的，以便找到感兴趣的区域。因此，建议的样品厚度应在几微米以内。

图1 左上角：显微镜图像、载体上的样品和检测器（从光束位置看）。右上角：B16设置的照片。底部：B16梁线示意图。【图片改编自Diamond（2017）b条).]

使用50µm金丝的刀刃扫描确定聚焦光束的大小。在17 keV和12.7 keV下进行标准物测量，以优化不同元素的激发（一次用于Sr以下的元素，一次用于Zn以下的元素）。

2.1.1. 17 keV的设置

17 keV的测量值是用Vortex四元探测器（Vortex ME4，Hitachi Ltd，Tokyo，Japan）记录的，总有效面积为200µm²和SII电子。用50µm金交叉测定的光束分辨率（半峰全宽，FWHM）约为500 nm（垂直）×600 nm（水平）。

为了描述设置的特征，特别是对于薄样品，测量了NIST标准（标准参考材料2783–过滤介质上的空气微粒；NIST，美国盖瑟斯堡）。从图2中的Ca、Fe、Cr和Zn分布图可以看出，该标准具有很大的异质性.如果面积至少为1 cm，则认证值仅在规定的不确定度范围内有效²测量（NIST，2011). 正如人们很容易看到的那样，这一面积太大，无法用亚微米光束进行分析。此外，该标准需要每像素120秒的测量时间来产生可评估的光谱。为了在合理的时间内获得灵敏度和检测下限，扫描区域被限制为6×6像素（考虑到我们的光束大小，这导致大约10.8µm的区域²). 在每个测量点之间，样品移动10µm（步长）。除加载的过滤器外，还以相同的方式扫描空白过滤器（也是NIST SRM 2783的一部分）。这允许确定仅来自空白滤波器的信号分量。加载过滤器和空白过滤器的总光谱（见图2，左上角）使用安装AXIL-QXAS公司第3.6版（国际原子能机构，2009年). 使用加载过滤器的拟合结果计算灵敏度和检测下限（LLD），并用空白过滤器的净计数进行校正。使用NIST证书（NIST，2011）中给出的不确定性（约95%）计算灵敏度的不确定性)以及两倍的拟合误差（2σ)加载过滤器的拟合净计数。注意，由于测量面积较小（与给定建议相比），图2中显示的误差条不符合95%的置信区间，仅作为粗略指示。如图2所示，获得的灵敏度约为8次计数⁻¹前景⁻¹对于CaK（K）α至249计数s⁻¹前景⁻¹对于AsK（K）α，而检测下限在1000秒内为169至4 ag。灵敏度值如图2所示也可以在支持信息。

图2 顶部：在NIST标准参考材料（SRM）2783（过滤介质上的空气微粒）上测量的36（6×6）个像素的灵敏度、检测下限（插入表）和和谱（插入；加载的为蓝色，空白过滤器为灰色），采用17 keV单色激发。注意，由于测量区域较小，灵敏度值上的误差线很可能被低估。底部：四个选定元素（Ca、Fe、Cr和Zn）的分布图，显示SRM的不均匀性。像素之间的距离为10µm。每个像素的测量时间为120秒。

为了正确看待这些值，表1中给出了与ESRF ID16B-NA束线处Mn和Cu的LLD的比较。

表1 钻石光源的B16光束线和ESRF的ID16B-NA光束线确定的Mn和Cu的检测下限（LLD）以及一些测量参数的比较 对两条光束线扫描多元素标准，以确定各种元素的LLD。ESRF ID16-NA光束线的值取自Laforce等。(2014).   钻石B16 ESRF ID16B-NA公司 锰K（K）LLD（1000秒，单位：ag） 15 0.0457（下午12点） 铜K（K）LLD（单位：ag，1000 s） 7 0.0136（下午4点） 标准 NIST SRM 2783标准 NIST STM 1832标准 每像素测量时间 120秒 0.1秒 励磁 17 keV（多层单色） 17.5 keV（粉色光束） 光斑大小（垂直×水平） 500纳米×600纳米 59纳米×48纳米 台阶尺寸（垂直×水平） 1微米×1微米 0.85微米×0.9微米

2.1.2. 12.7 keV的设置

使用激励能量12.7 keV的测试使用了不同的探测器，即单个硅漂移探测器（SDD）（Vortex 90EX，日立有限公司，日本东京；50 mm²活动区；堪培拉计数电子）。光束分辨率（FWHM）也约为500 nm（垂直）×600 nm（水平）。

步长和测量时间与§2.1.1中所述相同，NIST标准SRM 2783（加载和空白过滤器）（NIST，2011)也测得12.7 keV激发能量。总共记录了41个光谱（41×1像素），结果如图3所示.获得的灵敏度范围约为23秒⁻¹前景⁻¹对于CaK（K）α至396秒⁻¹前景⁻¹对于锌K（K）α而检测下限在1000 s内为92至5 ag。对于12.7 keV的激发，也可以获得镍的灵敏度和LLD值K（K）α由于来自空白滤波器的Ni信号的贡献和较低的灵敏度，这对于17keV的激励是不可能的。铬的高灵敏度和LLD值K（K）α由扫描中的单个Cr热点引起。在该热点中，Cr在60秒内达到16408个计数，而扫描中的所有其他像素的值在60秒内介于22和1046个计数之间。图3中显示的灵敏度值也可以在支持信息。

图3 顶部：在NIST标准参考材料2783（过滤介质上的空气微粒）上用12.7 keV单色激发测得的41个像素的灵敏度、检测下限（插入表）和总光谱（插入；加载时为蓝色，空白滤光片为灰色）。底部：B16上XRF装置中NIST SRM 2783的照片。

为了进一步表征B16亚微米-XRF设置、灵敏度和LLD（单位：µg⁻¹)还测定了厚厚的均质标准参考材料（NIST SRM 1412–多组分玻璃；NIST，美国盖瑟斯堡）（国家标准局，1985). 再次测量6×6像素的扫描区域（步长为10µm）。测量时间为20秒K（K）-和L（左）-行[以计数s为单位⁻¹（微克⁻¹)⁻¹]以及总光谱和LLD（微克⁻¹1000 s）如图4所示和5分别是。

图4 顶部：敏感度K（K）-在NIST标准参考材料1412（多组分玻璃）上用12.7 keV单色激发测得的36（6×6）像素的线、检测下限（插入表）和和谱（插入）。铁标记为灰色，因为它只是一个参考值，而不是一个认证值。底部：钙、钾、铁和锌的分布图，显示了同质性像素之间的距离为10µm。每个像素的测量时间为20秒。

图5 敏感度L（左）-线、检测下限（插入表）和在具有12.7keV单色激发的NIST SRM 1412（多组分玻璃）上测量的36（6×6）个像素的和谱（插入图）。

表2显示了PETRA III P06光束线处Ca、Fe和Cu的LLD比较。

表2 金刚石光源B16光束线和PETRA III P06光束线测定的Ca、Fe和Cu检测下限（LLD）以及一些测量参数的比较 对两条光束线扫描多元素标准，以确定各种元素的LLD。PETRA III P06光束线的值取自Boesenberg等。(2016).   钻石B16 PETRA III第06页 钙K（K）LLD（1000秒，单位：ag） 92 2.241 铁K（K）LLD（1000秒，单位：ag） 13 0.226 铜K（K）LLD（1000秒，单位：ag） 7 0.109 标准 NIST SRM 2783标准 AXO薄膜R11 每像素测量时间 120秒 20毫秒 励磁 12.7千伏 12千伏 单色仪 多层 双晶单色仪 光斑大小（垂直×水平） 500纳米×600纳米 450纳米×450纳米 探测器 SDD系统开发 迈亚

3.1. 黄金测试结构

该样品由卡尔斯鲁厄纳米微设备（KNMF）通过电子束光刻为原子研究所（ATI）制作。在一块四英寸的硅片上涂上一层起始层（10纳米Ti，100纳米Au），以便通过气相沉积进行电镀。使用电子束写入器（EBPG5200Z，Raith）将结构写入1.5µm厚的PMMA层中的沟槽中。剂量为800µC cm⁻²MIBK和IPA的混合物（1:1）中进行了开发。通过电镀，沟槽中填充了厚度为1 mm的黄金。用氧等离子体去除残余抗蚀剂。样品为Ti涂层（整个表面）硅晶片。在Ti层的顶部，有100µm×100µm正方形的Au结构和1至10µm之间不同宽度的连续条纹。样品的显微镜图像如图6所示。

图6 KNMF金矿测试构造SR-XRF（左、右）和显微镜图像（中）的Au图。

使用B16上的XRF设置对该样品的两个区域进行扫描：显微镜图像右下角的正方形，图6)以及左下方线条结构的一部分。从上到下，线条结构的第一条条纹的宽度为10µm，后面是10µm的间隙；第二条条纹的宽度为9µm，后面是9µ米的间隙。条纹宽度和条纹间隙以1µm的步长减小到宽度为1µm.的最小条纹。两种结构均以1µm的步长和1 s的测量时间进行扫描。条纹和正方形的两张金图的测量分别需要约50 min和8 h。上面给出的时间包括测量软件与检测器通信所需的时间和电机运动时间（大约每像素1s）。扫描金结构的结果证实，使用B16上的XRF设置，1µm结构很容易分辨。

3.2. 人体骨活检样本

样本为椎体活检，切割厚度为4µm。该切口夹在两块8µm Kapton箔之间，并固定在Plexiglas框架之间。因此，骨样品固定在样品载体上，如图1所示。

图7显示了所测样品区域的显微镜图像（左上角）、概览扫描的Ca分布（左下角）以及最终高分辨率扫描中的Ca、Zn、Sr和Co分布。概览扫描的步长为20µm，每像素测量时间为2 s。概览面积为400µm×360µm且扫描时间约为20 min。

图7 测量骨样本的显微镜图像（左上），以及该样本上粗扫描的Ca分布（左下），以及精细扫描的钙、锌、锶和钴分布（右）。

高分辨率扫描（步长1µm）在显微镜图像中用蓝色边框标记的区域进行，并针对锌的测量进行了优化，因此需要更长的测量时间（每像素20秒）。整个扫描耗时约15小时。扫描面积为11µm×237µm。图7证明了该装置不仅能够对骨骼样本中的薄结构成像（尤其是在Zn图中可见），而且可以使用粗略扫描将得到的元素图容易地与显微镜图像相关联。

3.3. 癌细胞

这些测量是作为细胞内金属定位研究项目的一部分进行的。人类A-375恶性黑色素瘤细胞（ECACC，英国索尔兹伯里）生长在厚度为500 nm的7.5 mm×7.5 mm低应力氮化硅窗口上（Norcada，Edmonton，AB，加拿大）。用硫酸铜和螯合剂处理细胞。Gaál对样品处理进行了更详细的描述等。(2018一,b条).

通常，每个总面积最多100个单元就足够了。通常，在2 ml培养基中制备50万个细胞的细胞悬液，并将其涂在平板上。细胞会粘附在膜上。如果膜上放置了太多的细胞，则应从头开始；如果太少，那么应该用吸管吸出更多的细胞。如果使用这种方法，我们可以扫描同一膜上的单个细胞和小组细胞。

以0.5µm的步长测量每像素5 s的细胞样本面积。面积大小为20μm×20μm（41×41像素）。完成扫描大约需要2.8小时。图8中的元素图显示了用于调查单个细胞内元素分布的设置的适用性。

图8 P、 铜中毒人类a-375恶性黑色素瘤细胞的S、Cl、K、Cu和Zn图谱。