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研究交流\（\def\h填{\hskip5em}\def\hfil{\hski p3em}\def\eqno#1{\hfil{#1}}\）

期刊徽标结构生物学
通信
国际标准编号：2053-230X
第75卷| 第4部分| 2019年4月| 第212-216页
https://doi.org/10.107/S2053230X19001213

基底-模拟复合结构结核分枝杆菌癸烯基二磷酸合酶

十字标记_颜色_方形_文本.svg
慈平阁,一 仙莎笑,b条 郭丽婷（Rey-Ting Guo）,c（c） 黄建文,c（c） 刘卫东b条和陈春池c（c）*

一中国科学院生物化学研究所，台北11529，台湾，b条中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室，天津300308，中华人民共和国c（c）生物催化与酶工程国家重点实验室，湖北省生物资源绿色转化协同创新中心，湖北大学生命科学学院湖北省工业生物技术重点实验室，武汉43420，中华人民共和国
*通信电子邮件：ccckate0722@gmail.com

德国莱比锡大学N.Sträter编辑(2018年12月19日收到； 2019年1月22日接受； 2019年3月13日在线)

癸烯基二磷酸合成酶结核分枝杆菌(百万吨DPPS（也称为Rv2361c）催化ω,E类,Z轴-法尼基二磷酸(EZ公司-FPP）通过七个异戊二烯单元形成新的顺式双重债券。这种蛋白质像大多数其他蛋白质一样折叠成类似于奶油的同二聚体顺式-类型戊基转移酶。起始烯丙基底物EZ公司-FPP与S1位点结合，待并入的同烯丙基底物异戊烯基二磷酸与S2位点结合。这里是一个1.55º的分辨率结构百万吨DPPS和底物类似物香叶基的配合物S公司-硫代二磷酸（GSPP）和异戊烯基S公司-硫代二磷酸在一个亚单位中与各自的位点结合，清楚地显示了催化的活性位点构型和镁配位几何结构。GSPP在另一亚单位中的配体结合模式表明，可能存在产品从S2位点转移到S1位点的途径，这是反应的下一步所需的。负电荷效应器与S1位点的首选结合也为抑制剂设计提供了一个有希望的方向。

PDB参考：Rv2361c，6倍

类似文章

1.简介

结核病（TB）是全球十大死亡原因之一，是一种长期共存的人类“人群”疾病，由一组基因相关的分枝杆菌引起，即结核分枝杆菌复杂（MTBC）。耐多药结核病（MDR-TB）的出现是对公共卫生的一大威胁，在不久的将来消灭这种疾病的目标正面临挑战（世界卫生组织，2018年【世界卫生组织（2018），《2018年全球结核病报告》。日内瓦：世界卫生组织。https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/。]). 在新疗法的开发中，靶向结构相似的酶Rv1086、Rv2361c和Rv3378c，这些酶参与细胞壁生物合成和毒力因子的产生，可能是一种可行的方法（Wang等。, 2008【Wang，W.，Dong，C.，McNeil，M.，Kaur，D.，Mahapatra，S.，Crick，D.C.&Naismith，J.H.（2008），《分子生物学杂志》38119-140。】; 陈等。2014年【Chan，H.-C.，Feng，X.，Ko，T.-P.，Huang，C.-H.，Hu，Y.，Zheng，Y..，Bogue，S.，Nakano，C.，Hoshino，T.，Zhang，L.，Lv，P.，Liu，W.，Crick，D.C.，Liang，P.-H.，Wang，A.H.-J.，Oldfield，E.&Guo，R.-T.（2014），《美国化学学会杂志》136，2892-2896.】). 这三种蛋白质都属于顺式-戊基转移酶(顺式-PT）家庭，采用ζ-fold（Oldfield&Lin，2012年【Oldfield，E.&Lin，F.-Y.（2012），Angew.Chem.Int.Ed.51，1124-1137.】). Rv1086生产ω,E类,Z轴-法尼基二磷酸(EZ公司-FPP；C类15)来自香叶基二磷酸（GPP；C10)和异戊烯基二磷酸（IPP；C5)Rv2361c将其用于进一步延伸，以形成癸烯基二磷酸酯（DPP；C50; 考尔等。, 2004【Kaur，D.，Brennan，P.J.和Crick，D.C.（2004），细菌杂志，1867564-5750。】). Rv3378c转移二磷酸结核菌素（TPP；C）的二萜部分20)转化为腺苷，生成1-结核菌素基腺苷（1-TbAd；Layer等。2014年[Layer，E.，Lee，H.J.，Young，D.C.，Jezek Martinot，A.，Buter，J.，Minnaard，A.J.，Annand，J.W.，Fortune，S.M.，Snider，B.B.，Matsunaga，I.，Rubin，E.J.，Alber，T.&Moody，D.B.（2014），美国国家科学院院学报，111，2978-2983。])作为一个丰富的MTBC标记。

Rv2361c（或结核分枝杆菌DPP合成酶，百万吨DPPS）与十一碳烯基二磷酸合酶（UPPS；例如，参见Ko等。，2018年[Ko，T.-P.，Huang，C.-H.，Lai，S.-J.&Chen，Y.（2018），《结晶学报》F74，765-769.])，除了最终产品的链长（C50与C相比55)和起始烯丙基底物(EZ公司-FPP与电气工程师-FPP）。事实上，大多数顺式-PT具有共同的二聚体结构，底物结合的保守S1和S2位点位于亚单位界面附近（Oldfield&Lin，2012）【Oldfield，E.&Lin，F.-Y.（2012），Angew.Chem.Int.Ed.51，1124-1137.】). 起始烯丙基底物与S1位点结合，待并入的同烯丙基基材与S2位点结合。一个不变的天冬氨酸残基通过配位镁在催化中起核心作用2+-结合底物（郭等。, 2005[郭，R.-T.，柯，T.-P.，陈，A.P.-C.，郭，C.-J.，王，A.H.-J.&梁，P.-H.（2005）.生物化学杂志.280，20762-20774.]). 其他保守残基，包括Asn–Ser质子穿梭机和C末端RX（X）G基序也具有催化作用（马尔瓦尔等。，2018年【Malwal，S.R.，Gao，J.，Hu，X.，Yang，Y.，Liu，W.，Huang，J.-W.，Ko，T.-P.，Li，L.，Chen，C.-C.，O'Dowd，B.，Khade，R.L.，Zhang，Y.（2018），Zhang-Y.，Oldfield，E.&Guo，R.-T.（美国化学学会目录8，4299-4312.】; 格拉宾斯卡等。, 2017[Grabińska，K.A.，Edani，B.H.，Park，E.J.，Kraehling，J.R.和Sessa，W.C.（2017）。生物化学杂志292，17351-17361.]; 陈等。, 2017【Chan，Y.-T.，Ko，T.-P.，Yao，S.-H.，Chen，Y.-W.，Lee，C.-C.和Wang，A.H.-J.（2017）。美国化学学会欧米茄，2930-936。】). 的头尾耦合反应顺式-PT通过一种协同途径进行，类似于反式-PT（梁，2009[Liang，P.-H.（2009）.生物化学，486562-6570。]). 在形成新的C-C键后，焦磷酸盐与镁一起离开S1位置2+生成的二磷酸戊酯从S2位点转换到S1位点（Guo等。, 2005[郭，R.-T.，柯，T.-P.，陈，A.P.-C.，郭，C.-J.，王，A.H.-J.&梁，P.-H.（2005）.生物化学杂志.280，20762-20774.]; 补充图S1）。

这个晶体结构属于百万吨DPPS首先在三角区测定单位电池分辨率为1.8–2.6º，显示了除Rossmann-fold-like结构域之外的N末端模块顺式-PT（王等。, 2008【Wang，W.，Dong，C.，McNeil，M.，Kaur，D.，Mahapatra，S.，Crick，D.C.&Naismith，J.H.（2008），《分子生物学杂志》38119-140。】; PDB条目第2版第2版,第2版第3版和第二版第四版). 在一个晶体中，S1位点含有底物类似物二磷酸香茅酯（CitPP；C10)，在结构上模仿GPP，但缺乏烯丙基双键，而在另一个S2位点包含IPP分子（补充图S2）。随后百万吨使用正交晶体（Chan等。2014年【Chan，H.-C.，Feng，X.，Ko，T.-P，Huang，C.-H.，Hu，Y.，Zheng，Y.，Bogue，S.，Nakano，C.，Hoshino，T.，Zhang，L.，Lv，P.，Liu，W.，Crick，D.C.，Liang，P.-H.，Wang，A.H.-J.，Oldfield，E.&Guo，R.-T（2014）。美国化学学会杂志1362892-2896。】; PDB条目4次)，其中抑制剂与S1位点结合（补充图S3一). 在这里，我们报告了一个具有1.55 Au分辨率的复杂结构，S1和S2位点均被各自的烯丙基和同烯丙基底物类似物占据。本文还讨论了一些为催化机理提供更多见解的功能。

2.材料和方法

2.1. 生产和净化百万吨DPPS（DPPS）

重组百万吨DPPS（Rv2361c）蛋白表达于大肠杆菌使用载体pET-28a，并如前所述进行纯化（Wang等。, 2008【Wang，W.，Dong，C.，McNeil，M.，Kaur，D.，Mahapatra，S.，Crick，D.C.&Naismith，J.H.（2008），《分子生物学杂志》38119-140。】). 简单地说，His-tagged百万吨将DPPS加载到Ni–NTA柱（Qiagen）上，洗涤并用咪唑梯度洗脱。通过凝血酶裂解和阳离子交换使用POROS HS20色谱柱（ThermoFisher）。使用HiPrep 16/60 S-100柱（GE Healthcare）通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质，并浓缩至10 mg ml−120米M（M）Tris pH值7.2，0.15 mM（M）氯化镁2，3米M（M）结晶用二硫苏糖醇。

2.2. 结晶、数据收集和结构测定

遵循上述程序（Chan等。2014年【Chan，H.-C.，Feng，X.，Ko，T.-P.，Huang，C.-H.，Hu，Y.，Zheng，Y..，Bogue，S.，Nakano，C.，Hoshino，T.，Zhang，L.，Lv，P.，Liu，W.，Crick，D.C.，Liang，P.-H.，Wang，A.H.-J.，Oldfield，E.&Guo，R.-T.（2014），《美国化学学会杂志》136，2892-2896.】)，重组百万吨DPPS在25°C下使用0.1的储层溶液通过坐滴蒸汽扩散法结晶M（M）HEPES pH 7.5，10%甘油，25%聚乙二醇400，7%聚乙二醇3000。在收集数据之前，将晶体浸泡在1m的储层溶液中M（M）每个异戊烯S公司-硫代二磷酸（ISPP；C5)和香叶基S公司-硫代二磷酸（GSPP；C10)持续6小时。

X射线衍射数据来自百万吨在国家同步辐射研究中心（NSRRC）的光束线BL15A1上的DPPS晶体，并使用香港（HKL）-2000（Otwinowski&Minor，1997）[Otwinowski，Z.&Minor，W.（1997），《酶学方法》，276307-326。]). 正交晶体具有相同的空间组与PDB条目相同，并且具有类似的单元-单元尺寸4次（陈等。2014年【Chan，H.-C.，Feng，X.，Ko，T.-P.，Huang，C.-H.，Hu，Y.，Zheng，Y..，Bogue，S.，Nakano，C.，Hoshino，T.，Zhang，L.，Lv，P.，Liu，W.，Crick，D.C.，Liang，P.-H.，Wang，A.H.-J.，Oldfield，E.&Guo，R.-T.（2014），《美国化学学会杂志》136，2892-2896.】). 进一步的结构精炼是用菲尼克斯（亚当斯等。, 2010【Adams，P.D.，Afonine，P.V.，Bunkóczi，G.，Chen，V.B.，Davis，I.W.，Echols，N.，Headd，J.J.，Hung，L.-W.，Kapral，G.J.，Grosse-Kunstleve，R.W.，McCoy，A.J.，Moriarty，N.W.，Oeffner，R.，Read，R.J.，Richardson，D.C.，Richards，J.S.，Terwilliger，T.C.&Zwart，P.H.（2010），《水晶学报》D66，213-221。】)和库特（Emsley和Cowtan，2004年【Emsley，P.&Cowtan，K.（2004），《水晶学报》，D60，2126-2132。】). 表1列出了数据和模型的一些统计数据[链接].

表1
数据收集和结构重新定义统计

括号中的值表示最外层的分辨率外壳。所有正面反射都用于细化。
PDB代码 6次
数据收集
 光束线 BL15A、NSRRC
 波长（Ω） 1
 “空间”组 P（P）212121
 一,b条,c（c）(Å) 77.71, 89.12, 94.44
 分辨率范围（Ω） 25–1.55 (1.61–1.55)
 独特的反射 95419 (9410)
 多重性 6.3 (6.3)
 完整性（%） 99.9 (100.0)
 平均我/σ(我) 48.7 (4.8)
 平均CC1/2 0.996 (0.981)
 R（右）合并(%) 3.6 (42.9)
 R（右）下午。（%） 1.6 (18.6)
结构细化
 反射次数 95335 (9261)
 完整性（%） 99.7（98.2）
 R（右）工作（95%的数据） 0.145 (0.185)
 R（右）自由的（数据的5%） 0.167 (0.206)
 R.m.s.d.，粘结长度（Ω） 0.0126
 R.m.s.d.，粘结角（°） 1.35
 原子数
  蛋白质 4688
  配体 92
  水 752
 平均B类系数（Ω2)
  蛋白质 24
  配体 37.7
  水 40.3
 拉马钱德兰支持（%） 97.7
 允许Ramachandran（%） 2.3
 Ramachandran异常值（%） 0
 旋转器异常值（%） 0.78
 冲撞得分 4.32
 摩尔概率分数 1.28

3.结果

3.1. 的总体结构百万吨DPPS（DPPS）

首字母R（右）刚性体后获得的值0.242精炼2.5º的分辨率证实晶体结构与PDB条目同构4次，二聚体为百万吨中的DPPS非对称单元。然而，在两个亚单位中与Asp76相邻的活性位点区域观察到了显著的结构重排。一个活性位点包含GSPP、ISPP和Mg2+而另一个只含有GSPP。可能是由于存在结合底物类似物，以前无序的C末端片段变得可见（补充图S3b条). 除了结合这些和其他配体以及溶剂分子外，在精炼大大改进了模型，评估结果如下摩尔概率（陈）等。, 2010【Chen，V.B.、Arendall，W.B.、Headd，J.J.、Keedy，D.A.、Immormino，R.M.、Kapral，G.J.、Murray，L.W.、Richardson，J.S.和Richardson，D.C.（2010）。晶体学报D66，12-21。】; 表1[链接]). 对于482对匹配的C，精确到1.55º分辨率的模型与原始模型的相对标准偏差为0.167ºα原子，甚至低于246℃下两个亚基之间的0.258°r.m.s.dα对。最大偏差发生在C端，其中包含RX（X）G图案。与其他14个已知同源结构的比较表明，构象与来自大肠杆菌和来自金黄色葡萄球菌（PDB条目1x09号和4时8分; 郭等。, 2005[郭，R.-T.，柯，T.-P.，陈，A.P.-C.，郭，C.-J.，王，A.H.-J.&梁，P.-H.（2005）.生物化学杂志.280，20762-20774.]; 朱等。, 2013[朱，W.、张，Y.、辛科，W.，亨斯勒，M.E.、奥尔森，J.、莫洛洪，K.J.、林德特，S.、曹，R.、李，K.、王，K.，王，Y.，刘，Y.-L.、桑科夫斯基，A.、德奥利维拉，C.A.F.、米切尔，D.A.、尼泽特，V.、麦卡蒙，J.A.和奥尔德菲尔德，E.（2013）。美国国家科学院学报，110，123-128。])193-197℃时，r.m.s.d.s为0.84–1.00Ωα在单体中配对。

百万吨DPPS包含一个独特的N端子模块，这在任何其他已知模块中都没有顺式-PT（王等。, 2008【Wang，W.，Dong，C.，McNeil，M.，Kaur，D.，Mahapatra，S.，Crick，D.C.&Naismith，J.H.（2008），《分子生物学杂志》38119-140。】; 图1[链接]一). 它位于二聚体的远端。在50个残基的帽状部分中有15个脯氨酸。使用搜索DALI公司（Holm&Laakso，2016年【Holm，L.和Laakso，L.M.（2016）。核酸研究44，W351-W355。】)这表明这个N端帽的褶皱是独特的。尽管有一些主链氢键，但没有典型的二级结构，但L型蛋白质折叠让人联想到tRNA结构（补充图S4）。它主要与α2,α3和α7个螺旋（图1[链接]一)，掩埋了1200°的表面积2每侧含有20多种氨基酸。界面包括非极性和极性残基，其中最突出的是一侧的Phe26、Trp32、Phe36和His53，另一侧的Glu109、Arg146、Leu153和Trp280（补充图S5）。螺旋α2和α3构成支撑产品碳氢化合物尾部的通道的一部分。在其他顺式-PT，如大肠杆菌UPPS它们直接暴露于溶剂中，并经历开-闭构象变化以促进催化。相比之下，百万吨DPPS仅采用闭合构象，可能是由于N末端帽的存在。

[图1]
图1
的总体结构百万吨DPPS。(一)中的两个单体非对称单元的百万吨DPPS晶体如带状图所示。这个β-股被命名为A–Fα-螺旋线从N端到C端编号为1-7。其中一个亚基为黄色/红色，另一个亚单位为洋红/青色。N端子模块的表面显示为灰色网格。(b条)如果o个负极如果c（c）通过省略绑定的GSPP、ISPP（洋红条）和Mg计算的地图2+（紫色球体）以及相关的水分子（红色球体）和Asp76和Arg292的侧链（绿色和橙色棒）的轮廓为3σ和5σ和分别显示为灰色和蓝色网格。(c（c）)如果o个负极如果c（c）通过省略绑定的GSPP（黄色条）和Asp76和Arg292的侧链（橙色和绿色条）计算出的地图轮廓为3σ和5σ.

3.2. 基板绑定模式

与之前不同百万吨DPPS结构，其底物或抑制剂分子结合到S1位点或S2位点，本研究中1.55°分辨率的精细结构包含S1和S2配体以及结合金属离子（图1[链接]b条). 虽然GSPP的碳氢化合物部分在隧道中有些混乱，可能是由于顺式/反式烯丙基双键与实际底物的差异，可以清楚地看到其他部分，例如S和C1原子的位置，即开始电离反应的位置。ISPP的亲核C4原子几乎与GSPP的C1-S键共线，距离为3.5º。使用顺式-与C1和C4原子的定位一样，高烯丙基基底也准备好攻击烯丙基基质，并在此配置中形成新的双键。镁合金2+离子与GSPP的两个磷酸基团形成八面体配位α-ISPP的磷酸盐、Asp76的侧链和两个水分子。一种水被氢键结合到β-ISPP的磷酸盐和Asp76和Arg292*的侧链。另一种是氢键连接到GSPPβ-磷酸盐和Arg292*侧链。（星号表示二聚体中反亚基的残基。）

另一活性位点中的结合GSPP显示了两种具有类似占用率和温度因子的交替构象（图1[链接]c（c）). 一个假设与另一个亚单位中的位置相同，尽管α-磷酸盐和烯丙基异戊二烯基。另一种是整个分子向外移动β-面对溶剂的磷酸盐α-磷酸盐处于β-第一构象物的磷酸盐及其戊基进入隧道的一半。该活性位点既不含S2配体也不含Mg2+但Asp76带负电荷的侧链与带正电荷的Arg292*形成两个直接氢键，Arg292也与β-GSPP第二构象中的磷酸盐。有趣的是，该构象的硫代二磷酸基团与二膦酸盐抑制剂BPH-640的头部基团（Chan等。2014年【Chan，H.-C.，Feng，X.，Ko，T.-P.，Huang，C.-H.，Hu，Y.，Zheng，Y..，Bogue，S.，Nakano，C.，Hoshino，T.，Zhang，L.，Lv，P.，Liu，W.，Crick，D.C.，Liang，P.-H.，Wang，A.H.-J.，Oldfield，E.&Guo，R.-T.（2014），《美国化学学会杂志》136，2892-2896.】; 补充图S6），表明S1位点含有第三个磷酸亚基，可能具有三磷酸结合能力。在最近确定的不动杆菌UPPS结构，柠檬酸盐也结合到S1位点附近的类似位置（Ko等。，2018年[Ko，T.-P.，Huang，C.-H.，Lai，S.-J.&Chen，Y.（2018），《结晶学报》F74，765-769.]; 补充图S6）。

4.讨论

除橡胶合成酶外，其他大多数合成酶生产的长链产品没有特定的尺寸限制顺式-PT（以及反式-PTs）将伸长链容纳在由螺旋的疏水侧链包围的非极性口袋中α2/α3和中央β-薄板（或四芯α-螺旋进入反式-PT；梁等。, 2002【Liang，P.-H.，Ko，T.-P.&Wang，A.H.-J.（2002）.欧洲生物化学杂志.269，3339-3354.】). 这个口袋的大小决定了产品链的长度。作为一种加工酶，百万吨在下一个催化循环中，DPPS不会释放其产物，该产物将成为烯丙基底物，直到最终链长为C50已到达。据推测，烯丙基底物或产物的烃尾部分在口袋中经历了一定的重排，但在每次延伸反应循环后，它必须伴随着焦磷酸部分从S2位点转移到S1位点。GSPP在无镁亚基中的选择性结合模式百万吨DPPS暗示第三磷酸亚基，可能代表这种易位的过渡状态。

如图2所示[链接](一)，当S1和S2基板和Mg2+Asp76的侧链不仅与镁直接结合2+而且还涉及配位水分子。同一水与Arg292*侧链氢键合，Arg292侧链也与其他镁键合水结合。在没有S2基质和Mg的情况下2+，Arg292*直接与Asp76结合，Asp76不再参与镁配位（图2[链接]一). Arg292*的侧链与β-在这种构象中S1底物的磷酸盐，在另一种构象中它也接近于β-S2底物的磷酸盐。因此，它似乎最有可能作为载体，通过结合S2配体到S1位点β-磷酸盐。如图2所示[链接](b条)在新的顺式双键S1焦磷酸分解为镁络合物，Arg292*与β-产品的磷酸盐，并将其转移到S1位置。虽然五碳长烃尾需要结构重排才能装入S1囊中，但二磷酸部分可以像GSPP构象物一样进行处理，然后才能为下一个反应循环提供生产性结合模式。

[图2]
图2
底物类似物的结合模式。(一)在这个立体图中百万吨DPPS二聚体自身上叠加有两条切换的多肽链。蛋白质在一个二聚体中呈青色/绿色，在另一个二聚体中呈粉红色/黄色，侧链和配体也呈棒状。镁2+离子和水分子显示为球体，配位键显示为串珠。S1和S2站点的位置以及附近的螺旋线α1/α2和股β还显示了B。(b条)在该示意图中，Asp76和Arg292的侧链分别为深红色和深蓝色。S1衬底交替结合模式的三个子网站用绿色曲线表示。其他键，包括镁配位，以黑色显示。R（右）n个代表一组n个连续异戊二烯装置（C5n个).

总之百万吨DPPS结构与结合底物类似物GSPP和ISPP清楚地显示了催化作用的活性位点构型和镁配位几何结构，与之前的晶体观察和生物化学研究一致顺式-一般情况下的PT。它还表明，S1位点可能是含有多个负电荷基团的配体的首选结合位点，例如GSPP和BPH-640。GSPP显示了可能被反应中间体。之前观察到的BPH-640在类似位置也有其二膦酸盐基团。因此，S1位点可能是针对百万吨DPPS可能从含有各种碳氢化合物尾部的三磷酸类似物开始。

支持信息

3D视图

PDB参考：Rv2361c，6倍

补充数字。内政部：https://doi.org/10.107/S2053230X19001213/no5157sup1.pdf


致谢

作者感谢台湾国家同步辐射研究中心的束流时间分配和数据收集协助。

资金筹措信息

这项工作得到了台湾蛋白质项目（批准号AS-KPQ-105-TPP）的支持。

工具书类

第一次引用Adams，P.D.、Afonine，P.V.、Bunkóczi，G.、Chen，V.B.、Davis，I.W.、Echols，N.、Headd，J.J.、Hung，L.-W.、Kapral，G.J.、Grosse-Kunstleve，R.W.、McCoy，A.J.、Moriarty，N.W.、Oeffner，R.、Read，R.J.、Richardson，D.C.、Richards，J.S.、Terwilliger，T.C.和Zwart，P.H.（2010）。《水晶学报》。D类66, 213–221. 科学网 交叉参考 中国科学院 IUCr日志 谷歌学者
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通信
国际标准编号：2053-230X
第75卷| 第4部分| 2019年4月| 第212-216页
https://doi.org/10.1107/S20533230X19001213