2.1. 样品制备

按照之前的报告制备和处理了索马丁微晶（郭等。, 2018). 简言之，微晶通过8µm Whatman Nucleopore Track-Etched膜过滤三次（GE Healthcare）。通过离心浓缩微晶，并去除上清液。将晶体浆液装入定制的聚酰亚胺微孔底座中，该微孔有2µm的孔，供溶剂通过。然后用细尖滤纸接触支架的底面，然后手动放入液态硝基中快速冷冻，从而去除溶剂。冷冻前未添加防冻剂。

2.2。显微衍射数据采集

在NSLS-II（Fuchs）的FMX光束线上收集微衍射数据等。, 2016). 光束线配备了一个EIGER 16M探测器，该探测器经过校准以覆盖低能X射线。我们将X射线能量调至5 keV，光束尺寸为5×9µm。估计的波束通量约为6×10¹⁰ 光子⁻¹。我们以与MeshAndCollect方法（Zander）中实现的方法类似的方式收集所有数据集等。, 2015). 我们使用侧视图对齐井架；然后将支架旋转90°，使其表面与X射线垂直[图1(一)]。我们使用光栅扫描，光栅步长为5µm，以找到收集衍射数据的位置。这些位置，其衍射强度编码为绿色热图，对其衍射质量进行目视检查，并用于指导手动选择待排队收集数据的位置[图1(b条)]。从每个位置，我们收集了100帧的部分旋转数据集，使用0.2°的旋转步长和每帧0.02 s的曝光时间。根据程序计算，预计累积剂量为每颗晶体5 MGy放射性核素-3D类（泽尔丁等。，2013年b条). 在140 mm的样品到检测器距离处，相应的布拉格间距在检测器边缘约为3.0°。我们从18个装有微晶泥浆的井架中总共收集了1381个部分数据集。平均而言，我们在单个井架上收集了77个数据集。

图1 微晶处理和衍射数据采集。(一)光栅扫描前装载微晶的微型井架的代表性图像。(b条)根据光栅扫描热图（绿色）选择用于数据采集的位置。红色网格显示用于扫描的网格（55µm）。在本例中，101个位置（紫色点）排队等待数据采集。

2.3. 数据简化和组装

单晶数据集通过使用刻度盘（沃特曼等。, 2016)然后使用CCP4程序缩放并合并到2.6º间距无意义和无AIMLESS（埃文斯等。, 2011; Evans&Murshudov，2013年). 我们建立的方法用于异常值剔除和数据汇编（郭等。, 2018). 我们将单晶数据集处理为10、20、……、100帧的累积楔形，最终每个晶体有10个楔形。最大CC的楔块_1/2选择在4º时计算的数据进行后续数据汇编。平滑框架R（右）_合并（SmRmerge）报告无AIMLESS（Evans和Murshudov，2013年)用于在晶体和帧级别上对兼容性进行评分，以指导数据汇编期间的进一步异常拒绝。在晶体水平上，使用平均的SmRmerge（〈SmRmerger〉）对每个晶体进行评分，并通过拒绝100个最高\9001]SmRmerg \9002]的晶体来执行迭代晶体拒绝。所有1381个单晶部分数据集的组合称为“组合数据集1381”在每个循环中计算SmRmerge \9002；，以确定在连续循环中拒绝的最不相容晶体。从组装数据集1381开始，我们拒绝了100个最高〈SmRmerge〉的晶体，并获得了组装数据集1281，从中计算出更新的\9001\SmRmerged \9002]值，以准备另一个拒绝周期。通过迭代，组合数据集11811081，等直到使用组装数据集81结束。因此，在晶体水平上，总共获得了14个组装数据集。在帧级别，我们使用每帧SmRmerge来拒绝基于辐射诱导衰减的帧。我们拒绝了由frame_cutoff=[min（SmRmerge）×（1+衰变）]定义的不同截止处的帧，其中min（SmRmerge）是单晶数据集中最低的SmRmerge；衰变是一个无（有效，衰变=∞）、500%、200%、150%、100%或50%的拒绝率。在每个拒绝率下，SmRmerge大于frame_cutoff的帧被排除在无AIMLESS例如，150%的拒绝率表示SmRmerge大于min（SmRmerg）150%的帧被拒绝缩放和合并。我们对14个组合数据集（组合数据集1381、1281、…、81）中的每一个数据集以6个比率进行帧抑制，共获得84个具有不同帧抑制程度的组合数据集。我们的数据组装工作流示意图如图2所示在晶体和帧抑制后，帧抑制率为150%的组合数据集1181显示出最高的异常相关系数（ACC）（详见结果）。数据收集和细化统计表1显示了该组合数据集.

图2 数据汇编的示意图工作流程。首先，将单个微晶数据集（每个100帧）分割并处理成十个累积的楔形；和最大CC的楔块1/2已选择用于数据汇编。其次，通过剔除100个平均SmRmerge值最高的微晶进行迭代晶体剔除。在每次晶体剔除后，根据定义的SmRmerge截止值执行帧剔除以去除异常值。最后，使用具有最大ACC的组合数据集进行结构确定。

2.4. 结构确定

下部结构由SHELXD公司（谢尔德里克，2010年). 5000SHELXD公司进行了试验，以搜索9个具有以下特征的异常散射体E类_最小值截止值在1.3和1.7之间，分辨率截止值在3.5和4.2Å之间。最好的下部结构用于计算初始SAD阶段相位器（Read&McCoy，2011年)或夏普（冯海因等。, 2007)，然后使用DM公司或所罗门群岛（Cowtan和Zhang，1999年). 自动建模使用BUCCANEER公司（Cowtan，2006年). 进一步迭代模型构建和精炼在中执行库特和菲尼克斯。精炼分别为（Afonine等。, 2012; 回声等。, 2014). 在所有细化中，Bijvoet对被视为两种不同的反射，所得的傅里叶系数用于计算Bijvoet-差分傅里叶映射。精细结构的立体化学通过PROCHECK检查（拉斯科夫斯基等。, 1993)和摩尔概率（陈）等。, 2010)用于质量保证。这个细化统计表1列出了具有150%帧抑制的组合数据集1181.

3.1. 单晶数据集

给定信噪比所需的X射线剂量与微晶的体积成反比（Holton&Frankel，2010). 因此，为了获得所需布拉格间距的衍射点，只能从每个微晶在被辐射损伤杀死之前收集到不完整的部分数据集。我们使用CC_1/2在4.0Å时评估单晶数据质量，并进行初始拒绝以去除导致CC降低的帧_1/2如果他们结合在一起。通过以较低分辨率拒绝初始帧，我们做出了一个折衷方案，即为下游装配选择更多帧，同时拒绝具有太多辐射损伤的帧，如果不拒绝，这将使缩放过程不稳定。图3(一)显示了微晶相对于CC的分布_1/2在初始帧抑制之后。最大CC_1/2作为标准，我们可以选择每个晶体20到100帧，这表明单晶对辐射损伤的响应不同，大多数单晶选择30到40帧[图3(b条)]。在初始帧拒绝后，我们从1381个晶体中总共选择了51570个帧，用于后续数据汇编。这些微晶的衍射能力很弱。必然是平均值我/σ（平均我), 〈我/σ(我)这些单晶数据集的平均值往往较低。对于1381个单晶数据集，大多数显示〈我/σ(我)〉约2个[图3(c（c）)].

图3 单晶数据集的数据分析。(一)抄送1/2单晶的分布。(b条)从单晶中选择的帧数分布。(c（c）)我/σ(我)〉单晶分布。(d日)以三个欧拉角表示的晶体取向分布α,β，以及γ.

支架上的晶体形态和分布会影响交互空间覆盖和数据组装。我们使用有图案的微孔来分布支架上微晶的方向。为了检查微晶的取向分布，我们索引了单晶数据集，将它们的取向矩阵转换为三个欧拉角，并在图3中绘制了角度分布(d日). 欧拉角α和γ在0°和180°之间大致均匀分布，但β峰值在～80°。考虑到索姆丁晶体的晶格是四方的β可以通过对称相关测量很好地适应。

3.2. 组合数据集

我们合并了1381个部分单晶数据集，逐步剔除了异常晶体和帧。由于每个单晶数据集中的数据不完整，缺少可靠的交叉晶体反射相关性分析，我们使用SmRmerge来表示每个帧与合并数据集的总体兼容性。通过使用〈SmRmerge〉，我们对1381个单晶数据集进行了排序，并迭代地拒绝了100个最高\9001»SmRmerge \9002；的晶体。在两次迭代中，这种晶体排斥去除了200个统计上最不相容的晶体，这些晶体对CC有害_1/2,R（右）_分裂和ACC（组装数据集1281和1381）（图4). 对于这14个组合数据集中的每一个，我们基于SmRmerge以6个比率进行了帧拒绝。通过结合这两种拒绝策略，我们发现可以从帧拒绝比率为150%或200%的1081或1181晶体中提取出显著的异常信号[图4(c（c）)]。帧重投影率为150%的组合数据集1181的ACC最高，为51.7%。该数据集随后用于结构确定。我们还发现，50%和100%的严格帧拒绝减少了异常信号。由于微晶之间的差异，我们建议以不同的比率进行帧抑制，并选择ACC最高的一个进行结构分析。

图4 组合数据集的数据分析。(一)抄送1/2, (b条)R（右）分裂和(c（c）)ACC。在每个图中，曲线对应于每个晶体抑制周期后帧抑制的不同程度。帧抑制显示为六种不同的比率，50%为最严格的抑制，“无”为无帧抑制。ACC值是用截断到4.0º的高分辨率数据计算的。

3.3. SAD相位和异常信号

索姆丁含有八个二硫键和一个甲硫九残基，共有17个硫原子。由于分辨率截止值为4.0º，二硫键（2.02º）不可分解，因此我们在SHELXD公司。使用E类_最小值1.4和5000时的截止值SHELXD公司试验，我们获得41个下部结构CC最高的解决方案_全部的和CC_虚弱的分别为45.7%和22.8%[图5(一)]。子结构用于SAD阶段划分，使用夏普（冯海因等。, 2007). 密度修正后，分辨率为2.6º的电子密度图质量足以用于库特[图5(b条)]。程序BUCCANEER公司（Cowtan，2006年)能够自动构建202个残留物中的178个。精细结构具有R（右）/R（右）_自由的18.6/21.6%，表明该组合数据的数据质量。与实验电子密度相比，图5(c（c）)显示了精细地图的电子密度。

图5 结构确定和阶段划分。(一)抄送全部的/抄送虚弱的共5000SHELXD公司试验(b条)密度修正后的实验电子密度(c（c）)精细电子密度图和(d日)双差傅里叶峰。反常散射体（硫）的峰值显示为等高线为3的品红σ。thaumatin的整体结构显示为带状。数字和黄色球体分别表示结构中反常散射体的位置和原子：（1）Cys149–Cys158，（2）Cys159–Cyst164，（3）Cys9–Cys204，（4）Cys121–Cys 193，（5）Cys134–Cys145，（6）Cys56–Cys66，（7）Cys126–Cym177，（8）Met122，（9）Cys71–Cys77。

为了评估异常信号的强度，我们进行了f“精炼（刘）等。，2013年)八个二硫键和一个甲硫九菲尼克斯。精炼通过使用Bijvoet对。Cys149–Cys158的最高f“值为1.34e，Cys56–Cys66的最低f”值为0.96e，所有硫原子的平均值为1.14e。在5keV下，硫的理论f”为1.31e。因此，我们的低能实验保留了大多数异常衍射信号。因此，所有九个Bijvoet-差分傅里叶峰都可以在3.0以上清晰地看到σ最高峰值为10σ对于Cys121–Cys193[图5(d日)]。在以下方面的成功结构测定异常信号的强度表明，在同步加速器束线上，由大约1200个尺寸小于10µm的晶体产生的原生SAD是可能的。

3.4. 框架拒收和辐射损伤

我们探讨了帧重投影比率对组装数据集1181的影响。我们发现ACC和Bijvoet差分傅里叶峰受到显著影响[图6(一)和6(b条)]。拒收率为100%或50%，即由于组合数据集中包含的受损数据较少，低分辨率炮弹的ACC大幅下降(d日_最小值> 5 Å). Bijvoet差傅立叶峰值以及峰值9（最低异常峰值）和峰值10（最高背景峰值）之间的间隙也减小，这可能是由于低分辨率异常信号的恶化。在150%或更高的抑制比下，低分辨率异常信号得以保留，Bijvoet差分傅里叶峰和ACC值变化不大。这一观察结果表明，辐射损伤的帧仍然有助于低分辨率异常信号的增强，并且应该在数据处理过程中保留。我们将这种增强归因于增强的多重性，它通过平均提高了信噪比。此外，辐射损伤，包括可能导致的非同构，首先影响高角度数据。虽然我们的每颗晶体5 MGy的剂量远低于30 MGy Garman的限制（Garman&Weik，2017年)和20 MGy Henderson限额（Henderson，1990)人们普遍认为，为了保持微弱的异常信号，需要更严格的水平。

图6 对组装的数据集的分析1181。(一)关于布拉格间距的ACC图（%）。(b条)十个最高Bijvoet差分傅里叶峰的图。前九个峰（峰1-9）来自九个反常散射体，第十个峰来自噪声。(c（c）)CC图全部的/抄送虚弱的从SHELXD公司 下部结构确定具有不同帧重投影比的数据集1181。对于每个数据集，5000SHELXD公司试验是用E类最小值=1.4，分辨率截止值=4.0。具有已知结构的MR-SAD用于SAD定相，括号中显示了密度修改后的mapCC。

进一步研究帧抑制对native-SAD的影响结构确定，我们跑了下部结构使用搜索SHELXD公司对于具有不同帧重投影比率的组合数据集1181。我们发现，保存低分辨率异常信号与下部结构测定[图6(c（c）)]。可以看出，在50%和100%的拒绝率下，没有下部结构解决。相比之下，帧重投影率为150%或更高（包括无拒绝）的组合数据集下部结构解决。该结果强调了适当的帧抑制对于下部结构从微晶中测定。

为了评估框架抑制对结构可解性的影响，我们使用了分子置换SAD（MR-SAD）（Read&McCoy，2011）)从改进的结构开始计算SAD阶段。在SAD相位的密度修正后，我们计算了映射相关系数SAD和模型图之间的（mapCC）。我们发现，150%或更高的拒绝率给出了56%或更多的mapCC。然而，抑制率为50%和100%的组合数据集的mapCC约为33%，这表明由于帧抑制过于严格而产生的异常信号要弱得多，尽管这两个数据集中的辐射损伤必然较小。因此，对于具有旋转数据采集的同步加速器中的微晶本征SAD相位，需要适当的帧抑制。为了增强低分辨率异常信号下部结构确定和分阶段。

4.1. 显微衍射数据采集

对于尺寸小于10µm的微晶，我们已经证明了在较低能量（5keV）下同步加速器自然SAD相位的能力。我们的实验使用了约1400个微晶，其中181个晶体用于最佳数据集合。为了收集数千个数据集，需要一种高效的数据收集策略，该策略需要高密度晶体底座，并能快速识别和收集微晶。为了增加井架上的晶体密度，我们浓缩微晶，在不接触晶体浆液的情况下尽可能去除上清液，并平均获得每个井架77个数据集。我们获得的最高产量在井架上有101个数据集。

我们使用5×9µm的光束进行数据采集。为了防止X射线对附近区域的损伤，我们选择了由至少一个网格（水平方向为5µm）分隔的衍射位置[图1(c（c）)]。这种微衍射数据收集策略可以在欧洲同步辐射设施（赞德）实现自动化等。, 2015)和瑞士光源（巴苏等。, 2019). 光栅扫描晶体的初步分析可以提供有用的信息，以帮助设计数据收集策略，例如通过防止从重叠晶体中收集数据（Melnikov等。, 2018). 晶体识别和旋转数据采集的步骤可以按照最初的建议和测试进行组合（Gati等。, 2014). 这种数据收集模式减少了不必要的辐射损伤，但在标准衍射数据分析之前必须识别和拒绝大量空帧（高等。, 2018).

4.2. 辐射损伤

为了提取微晶自然SAD相位的微弱异常信号，辐射损伤是一个主要挑战。为了从单晶中挤出最多的数据，然后提取微弱的异常信号，我们采取了三种方法。第一种方法是通过收集每个样本的更多帧来过度曝光每个微晶。如图3所示(b条)虽然大多数微晶只允许使用包含30-40帧的楔形物获得最佳数据，但我们收集了100帧，从中可以选择最佳楔形物。第二种方法是将单晶数据集逐步处理成连续的数据楔。这确保通过使用最大CC来包含尽可能多的帧_1/2在较低的分辨率下（4º代表thaumatin）[图3(b条)]。第三种策略是在每一个晶体抑制周期后，微调对辐射损伤帧的抑制（图4). 我们发现，结合这些策略可以有效地治疗辐射损伤，同时从每个单晶中提取最反常的衍射信号。

通过我们的帧重投影分析，我们发现包括更多的数据，即使已损坏，也有利于增强低分辨率异常信号下部结构决心。例如，onSHELXD公司 下部结构测定，最高CC_全部的/抄送_虚弱的（45.8%/27.8%）来自组装数据集1181，没有帧拒绝。我们做到了下部结构使用4.0°间距的反射进行搜索；同时计算SAD相位并进行密度修改，所有反射均为2.6°。就mapCC而言，最佳相位（61%）来自150%的帧抑制。

4.3. 低能量X射线

由于天然生物大分子中硫和磷的f“增加，低能X射线对天然SAD相位非常有吸引力（Hendrickson，2014; Liu&Hendrickson，2015年). 此外，较低能量下的整体衍射信号更强，与相应波长的立方体成正比（Holton&Frankel，2010). 然而，包括异常信号在内的低能X射线的吸收也随着能量的减少而增加。吸收可能来自晶体本身、晶体支架（支架）、晶体与探测器之间的路径以及探测器传感器材料。在我们的5keV实验中，我们使用了几微米的微晶。样品吸收率计算为小于2%，因此可以忽略不计。为了减少支架的吸收，我们使用了约3µm厚的聚酰亚胺阱支架，它可以在5keV下传输99%的X射线。因此，我们的聚酰亚胺支架非常适合于低能耗本机-SAD实验。5.4 keV时，规定探测量子效率因为爱格16M是94%，接近我们使用的5keV。通过使用在5keV下校准的设置，传感器吸收不应影响我们的低能实验。值得注意的是，我们没有使用氦气环境来减少空气吸收。我们的样品到探测器的距离是140毫米，这可能会使空气吸收5千伏X射线46.3%。然而，结构测定事实证明，即使在没有氦环境的情况下，也可以在5keV的条件下通过微晶进行自然-SAD相位调整。氦或真空环境的仪表化无疑将促进低能量下的自然SAD相位调整，如钻石光源（Wagner等。, 2016)和光子工厂（Liebschner等。, 2016).

在2.1°X射线波长下测量(E类=5.9 keV）被认为是自然SAD相位的最佳值，尽管未探索这种最佳值随晶体尺寸的可能变化（穆勒-迪克曼等。, 2005). 通过使用多晶体策略，我们还表明，从6keV收集的数据中记录的异常信号优于在7keV收集到的异常信号（Liu等。, 2014). 考虑到低能X射线的晶体尺寸依赖吸收，建议对微晶使用低于6keV的能量（Liu等。, 2014; 利布施纳等。, 2016; 瓦格纳等。, 2016). 即使是相对较大的晶体（50µm），也表明2.7Å的较长波长(E类=4.6 keV）优于1.9º的较短波长(E类=6.5 keV），用于本机-SAD相位（Liebschner等。, 2016). 在我们的低能微晶本征-SAD实验中，我们使用了5keV的能量，这是FMX光束线光子传输系统的低能极限。与对较大晶体所做的工作类似，探索微晶在7至4keV的X射线能量方面的自然SAD相位效应可能很有意思，尽管这种研究可能需要FMX目前没有的额外仪器。

4.4. 多晶体和异常值剔除

使用多晶体提供了一种有效的方法，可以获得必要的多重性和数据精度，以增强异常信号从头开始 结构测定（刘）等。, 2011; Liu和Hendrickson，2017). 使用多晶体产生的一个主要问题是晶体之间的差异，如果处理不当，会影响数据合并。我们和其他人建议使用单位间变化、衍射强度差异和ACC的相对贡献来剔除异常晶体（佐丹奴等。, 2012; 线路接口单元等。, 2012; 福亚迪等。，2013年). 对于微晶，每个晶体只能获得部分数据集；因此，必须使用多个晶体，并且需要根据单元间的变化或与合并或参考数据集（Axford等。, 2015; 郭等。, 2018; 山下等。, 2018; 巴苏等。, 2019). 使用遗传算法分类和异常晶体剔除为寻找相容的部分数据集提供了另一种方法（Zander等。, 2016). 根据我们的经验，索姆丁微晶的单位-细胞尺寸变化不大（郭等。, 2018). 因此，在我们的5keV实验中，我们没有使用单位-细胞变异来初始拒绝非同构数据。相反，我们将晶体和帧投影步骤与数据组装过程相结合，从而简化了数据分析工作流。通过使用最大CC_1/2在初始帧抑制为4°时，我们也没有使用参考数据集，进一步简化和加速了数据组装。到目前为止，在4º处选择分辨率截止值是经验性的。使用不同的最大CC_1/2截止将影响装配中包括的总帧数以及随后的晶体和帧拒绝。根据我们的经验，还可以使用几个分辨率截止值来优化单晶数据集中的帧选择。