2.1. 基因克隆和转化

高0666(嘻哈A^N个)，一个编码HipA的基因^N个从流感嗜血杆菌，被放大了聚合酶链反应（PCR）使用流感嗜血杆菌（KW20株，ATCC 51907）基因组DNA作为模板。用于PCR的寡核苷酸引物如表1所示在PCR扩增之后，嘻哈A^N个使用限制性内切酶NdeI和XhoI。高0666.1(嘻哈B)，一个编码HipB的基因，以相同的方式扩增并使用相同的酶克隆到pET21a载体（Novagen）中。表达HipA^N个和HipA^C类一起，嘻哈A^N个首次克隆到pETDuet载体（Addgene）中，并且高0665(嘻哈A^C类)，一个编码HipA的基因^C类，随后被引入嘻哈A^N个在pETDuet矢量中。用于克隆嘻哈A^C类到pETDuet向量中限制性内切酶使用BamHI和HindIII消化PCR产物和载体。重组pET28a载体嘻哈A^C类也是用同样的方法制作的。将所有重组质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）竞争性细胞（Novagen）。

2.2. 蛋白质表达和纯化

转化细胞窝藏嘻哈A^N个成长为光学密度600 nm（外径₆₀₀)约0.5 in LB培养基，含50 mg l⁻¹37°C下的卡那霉素。此时，通过添加0.5 mM（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和细胞在相同温度下额外生长4小时。生长的细胞在5600℃离心收集克.将采集的细胞重新悬浮在缓冲液A中[50 mM（M）Tris–盐酸，pH值7.9，500 mM（M）含10%的NaCl(v（v）/v（v）)甘油]并通过超声波溶解。细胞裂解液在18000离心克持续1小时，并将上清液应用于亲和层析镍-硝基三乙酸（Roche）柱与缓冲液A平衡。用含有20m的缓冲液A洗涤柱中截留的蛋白质M（M）咪唑，用含有100–500 m的缓冲液A洗脱M（M）咪唑。HipA的最终纯化^N个通过以下方式实现尺寸排除色谱法使用Superdex 200（16/600PG）色谱柱（GE Healthcare）平衡20 mM（M）HEPES，pH值7.5，500 mM（M）氯化钠。HipA的纯度^N个经SDS–PAGE验证。

2.3. 结晶和衍射数据采集

纯化的HipA^N个浓缩至10 mg ml⁻¹使用Amicon超离心过滤装置（Millipore）进行结晶。初始结晶是使用公开的筛选试剂盒，使用384孔板，通过坐滴蒸发扩散法进行的。每个孔板含有0.5µl蛋白质溶液和0.5µl储液罐溶液。平板在4°C下培养。用于数据收集的晶体生长在2M（M）硫酸铵和0.1M（M）Tris，pH 8.5。用于结构计算的X射线衍射数据是使用ADSC Quantum 315r CCD探测器在大韩民国浦项光源5C光束线的100K下采集的。使用2000港元程序集（Otwinowski&Minor，1997). 数据收集的统计数据如表2所示.

表2 数据收集和模型优化统计 括号中的值表示最高分辨率外壳。   希帕N个（PDB代码：7czo公司) 数据收集   X射线波长（Ω） 0.9795 “空间”组 P（P）41212 单位-细胞长度(一,b,c（c）, Å) 66.25, 66.25, 103.62 单位-细胞角(α,β,γ, °) 90.00, 90.00, 90.00 分辨率范围（Ω） 50.00–2.70 (2.75–2.70) 总反射/独特反射 94,246/6,880 (345) 完整性（%） 99.9 (100.0) 科科斯群岛1/2† 0.998 (0.973) 我/σ我 27.9 (3.2) R（右）合并‡ 0.096 (0.766)     模型细化   R（右）工作/R（右）自由的§ 0.242/0.274 数量/平均B系数（Ω2)   蛋白质原子 882/41.43 水-氧原子 30/45.88 R.m.s.与理想几何的偏差   键长（Ω）/键角（°） 0.011/1.473 Ramachandran图（%）   最有利的 99.42 允许 0.58 不允许的 0 †立方厘米1/2Karplus&Diederichs（2012年). ‡R（右）合并=，其中我(小时)是反射的强度小时,是所有反射和总数超过了吗我反射测量小时. §R（右）=，其中R（右）自由的是针对随机选择的未用于结构的5%反射进行计算的精炼和R（右）工作计算剩余反射。

2.4.结构确定和精细化

确定HipA的结构^N个,相位MR在里面凤凰（亚当斯等。, 2010)使用蛋白质数据库（PDB）条目2wiu（Evdokimov等。, 2009)结构作为模型。初始模型构建的迭代周期由执行库特（埃姆斯利等。, 2010)，以及其他精炼使用参考5（穆尔舒多夫等。, 1997). HipA乐队^N个 晶体结构属于P（P）4₁2₁2空间组2.70º。坐标和结构因子以登录代码存放在PDB中7czo公司用于HipA^N个，HipA毒素的N末端成分流感嗜血杆菌。详细信息细化统计见表2.

2.5. 生物信息学

结构图是使用生成的PyMol公司(PyMOL分子图形系统第1.8版，Schrödinger，LLC）。使用SSM公司（Krissinel&Henrick，2004）)内的选项库特。蛋白质表面的溶剂可及面积通过以下公式计算国际学生成绩评估（Krissinel&Henrick，2007）). 基因组图来自KEGG公司数据库（Kanehisa等。, 2017). 序列和结构相似性使用DALI公司（Holm&Rosenstrom，2010年). 结构辅助对准使用电子脚本（Robert&Gouet，2014）)，在的帮助下ClustalW公司（陈娜等。, 2003)用于序列比对。最终结构的质量在wwPDB X射线结构验证服务器（Berman等。, 2003).

2.6. HipA的铜提纯^N个，希帕^C类和臀围

确定HipB、HipA^N个和HipA^C类可能会形成一个蛋白质复合物，pETDuet载体包含这两者嘻哈A^N个和嘻哈A^C类和pET21a载体嘻哈B使用。在这项研究中，六组氨酸标签被贴在HipA的N-末端^C类将这些质粒共转化，并以与上述相同的方式培养细菌细胞，用50mg l⁻¹链霉素。蛋白质表达和亲和层析也以与上述方法类似的方式进行，但这三种蛋白质以50–700 m的梯度小心洗脱，避免与色谱柱结合M（M）咪唑。

2.7. 分析尺寸-排除色谱法

纯化的HipB、HipA蛋白混合物^N个和HipA^C类受到尺寸排除色谱法在与上述混合物相同的条件下。使用凝胶过滤校准试剂盒（GE Healthcare）中的标准品，包括醛缩酶（158 kDa）、conalbumin（75 kDa”）和卵清蛋白（43 kDa“），获得标准曲线，并将该曲线与从蛋白质混合物中获得的峰位进行比较。

2.8. 细胞生长测定

验证流感嗜血杆菌HipBA系统中，使用以下对不同抗生素耐药的质粒进行细胞生长检测：pET21a含有嘻哈B，pETDuet仅包含嘻哈A^N个和pET28a含有嘻哈A^C类。在本试验中，所有质粒均转化为大肠杆菌菌株BL21（DE3）。在含有0.1%葡萄糖的M9培养基平板中生长的转化细胞的单个菌落在隔夜中进一步生长。然后将这些过夜培养物稀释至OD₆₀₀0.1。稀释的细胞新鲜生长，直到OD₆₀₀达到0.5；0.5米M（M）然后将IPTG添加到培养基中以诱导蛋白质表达。细胞在37°C下培养，每隔1小时进行监测。

3.1. 的总体结构流感嗜血杆菌希帕^N个和嘻哈音乐基因组图谱

有四个α-螺旋和五β-排列为β-结构中的桶流感嗜血杆菌希帕^N个[图1(一)]. 其中β-股，五股β-股(β1–β5） 形成aβ-薄片相互反平行，这些反平行β-床单两侧有四张α-螺旋线。单体结构的总溶剂可及表面积为7119².

图1 的总体结构流感嗜血杆菌希帕N个和嘻哈音乐基因组图谱。(一)180°旋转视图流感嗜血杆菌希帕N个.α-螺旋，β-线和环分别为红色、黄色和绿色。(b)示意图显示了嘻哈音乐的操纵子流感嗜血杆菌,大肠杆菌和沙雷氏菌.

在已报道的HipBA系统结构中，我们在流感嗜血杆菌紧靠上游嘻哈A^C类该轨迹称为嘻哈A^N个在本文中，编码与HipA的N末端部分相对应的106 aa蛋白大肠杆菌和沙雷氏菌[图1(b)]. 在所有这些情况下，嘻哈B位于的上游嘻哈A这些推测的HipB同源物可能因此自动调节嘻哈音乐^{不适用+适用}操纵子。总之嘻哈音乐操纵子包含两个基因，嘻哈B和嘻哈A，而嘻哈音乐操作子来自流感嗜血杆菌包含三个基因，嘻哈B,嘻哈A^N个和嘻哈A^C类.

3.2. HipBA系统的结构比较分析

迄今为止，已有两个物种报道了HipA的结构：大肠杆菌（PDB代码5公里98;Z得分9.2，均方根误差2.4º，序列一致性24%）（舒马赫等。, 2015)和沙雷氏菌（PDB代码4立方英尺;Z得分9.9，均方根误差2.7Ω，序列一致性23%（Wen等。, 2014)[图2(一)]. 比较流感嗜血杆菌希帕^N个并对这两个报道的结构进行了比较分析。流感嗜血杆菌希帕^N个与来自大肠杆菌和沙雷氏菌[图2(b)]. 此外，流感嗜血杆菌HipB与大肠杆菌O127:H6三方HipBA系统（PDB代码：7ab3号机组)，其与大肠杆菌HipB（PDB代码：5公里98,Z得分12.0，均方根偏差1.2°）（舒马赫等。, 2015)和oneidensis链球菌HipB（PDB代码：4立方英尺,Z得分9.7，均方根偏差1.8Å）（Wen等。, 2014)[图2(c（c）)]. 无论HipBA系统的二元或三元性质如何，二聚体HipB抗毒素在其DNA-结合HTH基序中高度保守[图2(c（c）)]这也表明了它们作为转录调节器的保守作用。此外，尽管HipA毒素具有相似的折叠，但HipA结合的HipB抗毒素的N末端与大肠杆菌（循环介于β3和β4，包含α1） 和沙雷氏菌(α3–α4） 蛋白质。这可能表明HipBA系统的毒素中和机制在其同源物之间可能不同。

图2 HipBA系统的比较结构分析。(一)结构导向序列比对流感嗜血杆菌希帕N个其他HipAs的N末端部分。二级结构组织流感嗜血杆菌希帕N个显示在路线上。保存的残留物以红色和黄色突出显示。(b)结构比较流感嗜血杆菌希帕N个其他生物的HipBA系统。覆盖层中标记了高度保护的残留物。HipBA装订界面大肠杆菌和沙雷氏菌标识为圆形，放大为方形。(c（c）)HipB抗毒素的结构比较大肠杆菌O127:H6（PDB代码：7ab3号机组)和沙雷氏菌（PDB代码：4立方英尺)使用大肠杆菌与DNA结合的HipB抗毒素（PDB代码：5公里98)结构作为模型。

3.3. HipB、HipA的复合形成^N个和HipA^C类

展示HipB，HipA^N个和HipA^C类从流感嗜血杆菌形成与其他II型TA系统相似的复合物，进行分析凝胶过滤[图3(一)]，并通过SDS–PAGE分析洗脱部分[图3(b)]. His-tagged HipA公司^C类被两个HipA拉下来^N个和HipB。尺寸排除色谱法进一步证实了复合物的两种形式[（HipB+HipA^N个+希帕^C类)和（HipA^N个+希帕^C类)]在溶液中是单分散的。第二个峰在75和43 kDa分子量标准物之间洗脱，对应于异二聚体HipA^{不适用+适用}复合（～52.3 kDa）。这与二进制中HipA毒素结构的相对质量一致大肠杆菌HipBA系统（舒马赫等。, 2015). 此外，化学交联流感嗜血杆菌HipB显示了作为二聚体的HipB的主要多聚体形式[图3(c（c）)]与其他HipB抗毒素一样，因此在158和75 kDa分子量标准之间洗脱的第一个峰的结果被认为是由一个HipB二聚体结合到两个HipA的六元复合物组成^{不适用+适用}异二聚体。正如预测的那样，第三纪HipBA复合体最近沉积的结构（PDB代码：7ab3号机组)在大肠杆菌O127:H6揭示了HipB二聚体与两个HipA结合的六聚体组装^{不适用+适用}异二聚体（Baertensen等。, 2022). 事实上，共纯化的三种蛋白质的预期分子量表明流感嗜血杆菌（臀围+臀围^N个+希帕^C类)形成异六聚体和（HipA^N个+希帕^C类)在溶液中形成异二聚体。

图3 HipB、HipA的复合形成N个和HipAC类. (一)使用粒度净化三元混合物排除色谱法。已知质量的标准蛋白质的洗脱位置用垂直箭头表示。蛋白质混合物的两个主要峰用星形符号强调。(b)SDS-PAGE尺寸分析排阻色谱法分数。星号表示带星号的山峰所属的车道。(c（c）)化学交联的SDS-PAGE分析流感嗜血杆菌HipB使用DMA和DMS交联剂。实验条件如上所示，相应的多聚体形式标记在凝胶的右侧。

3.4. 三要素监管机制流感嗜血杆菌HipBA系统

我们验证了构成流感嗜血杆菌HipBA系统及其通过细胞生长分析的调节机制[图4(一)]. HipA的表达^C类导致细胞生长受到强烈抑制，表明HipA^C类起到毒素的作用。令人惊讶的是，这种生长并没有被传统的HipB抗毒素挽救，而是在HipA表达后被挽救^N个建议HipA^N个具有抗毒素的功能。此外，HipB和HipA的联合诱导^N个与HipA相比，提供了略微有利的增长援助^N个因此，HipB可能增强HipA的抗毒素活性^N个快速恢复细胞生长[图4(b)]. HipB和HipA的联合诱导^N个在中大肠杆菌O127:H6与诱导的HipA相比，HipBA三元TA系统的生长也有所改善^N个单独（Vang Nielsen等。, 2019)进一步支持HipB和HipA的增强作用^N个进一步抑制HipA毒性活性的成分^C类毒素。

图4 三要素监管机制流感嗜血杆菌HipBA系统。(一)细胞生长分析显示不同蛋白质表达的影响。每一条曲线代表具有不同蛋白质组合的细胞的生长，如图所示。数据显示了通过三次分析获得的平均值；标准偏差用误差线表示。(b)根据各成员之间的相互作用，推定监管机制的示意图概述流感嗜血杆菌HipBA系统。