2.1. 材料

重组HSA表达于毕赤酵母从美国密苏里州圣路易斯Sigma–Aldrich购买（产品目录号A7736；纯度≥90%），作为冻干粉末，并按如下所述进一步纯化。根据供应商的说法，该结构体从N末端（Asp1）中删除了一个Asp，通过消除白蛋白的主要铜和镍结合位点来创建一个低过敏性结构体。此外，通过添加游离半胱氨酸来阻断Cys34，以提高稳定性、单体含量和同质性。酮洛芬是从美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司（目录号205359；纯度≥99%）以外消旋混合物，它代表了这种药物的市售配方。

2.2. 结晶蛋白质纯化

HSA溶解在50 m的缓冲液中M（M）特里斯，20米M（M）NaCl pH值7.4，并在4°C条件下，使用Superdex 200色谱柱上的相同缓冲液进行凝胶过滤，该色谱柱连接至美国伊利诺伊州芝加哥市的通用电气医疗保健公司（GE Healthcare，Chicago，Illinois，USA）。通过使用消光系数使用纳米滴2000（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆热电科学公司）测量280nm处的吸光度，以分光光度法估算HSA浓度ɛ_{280-HSA公司}共34 440页M（M）⁻¹ 厘米⁻¹和分子量MW_HSA公司66 470 kDa。合并单体HSA的收集部分并浓缩至162 mg ml⁻¹使用具有30 kDa分子量截止值的Amicon超离心过滤器（Sigma，目录号UFC903024）。

2.3. 蛋白质结晶

使用蚊子结晶机器人（TTP Labtech）在96个平板（Hampton Research，目录号HR3-123）上进行结晶。结晶前，浓度为162 mg ml的HSA溶液⁻¹（溶解于50 mM（M）特里斯，20米M（M）NaCl（pH 7.4）与100 m混合M（M）酮洛芬在100%DMSO中以9:1的比例（最终酮洛芬浓度为10mM（M）)并在37°C下培养数小时。将0.2µl等分的HSA–酮洛芬溶液与0.2µl等分的储液溶液[50 mM（M）磷酸钾，24%(w个/v（v）)聚乙二醇3350 pH 7.0]。将结晶板在室温下培养三个月，然后在37°C下培养几天，直到观察到第一个晶体。采集的晶体采用闪蒸冷却，无需任何额外的冷冻保护剂。

2.4. 数据收集和结构确定

数据采集是从美国伊利诺伊州阿贡市阿贡国家实验室先进光子源SBC 19-ID光束线上的单晶进行的。实验是在100 K下使用波长为0.979º的X射线进行的。香港（HKL）-3000（次要等。, 2006; Otwinowski&Minor，1997年)用于处理、集成和缩放数据。对辐射衰减和各向异性衍射进行了校正（博雷克等。, 2010). HSA的本地结构（PDB条目4千2厘米; 王，于等。, 2013)用作的模板分子替换。 结构确定和精炼使用执行香港特别行政区-3000与集成MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年),REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011),库特（埃姆斯利等。, 2010)和其他来自中央对手方清算所4个套餐（优胜者等。, 2011). 这个精炼该过程遵循了最新的最先进指南（Shabalin等。, 2018; 马约雷克等。, 2020). 13个TLS组由TLS运动确定服务器应用于精炼（Painter&Merritt，2006年). (S公司)-或(R（右）)-酮洛芬的对映体是通过仔细评估每个候选物与2毫发_o个−DF公司_c（c）和毫发_o个 − DF公司_c（c）省略映射（计算10个循环REFMAC公司 精炼没有配体）。每一个选择都是通过与以下地图的拟合度进行比较来支持的精细化，产生的ADP值以及与蛋白质的相互作用（氢键、盐桥和缺乏冲突）。对部分入住率进行了评估(R（右）)-酮洛芬分子位于药物位点9，导致出现正电子密度和相对较低的ADP值；因此，入住率保持在100%。这个ACHESYM公司服务器（Kowiel等。, 2014)用于模型在单位单元格。这个国际学生成绩评估服务器（Krissinel&Henrick，2007）)用于分析参与配体和大分子之间相互作用的残基。PyMOL公司（版本1.5.0.3；薛定谔）和化学素描用于图形生成。这个DALI公司服务器（霍尔姆，2019年)用于结构比较和C的计算^αr.m.s.d.值。衍射数据采集、结构统计精炼表1总结了结构质量衍射图像可在《高分子晶体学再现性综合资源》上找到，网址：https://proteindiffraction.org（格拉博夫斯基等。, 2016)带DOIhttps://doi.org/10.18430/m37jwn网址.原子坐标和结构因子已用登录码存储在PDB中7加仑.

3.1. HSA–酮洛芬复合物的结构

HSA与酮洛芬复合物的晶体生长在空间组 C类2中含有一条蛋白链非对称单元。除第一残基（Ala2）外，蛋白质模型是完整的，其电子密度未观察到。电子密度揭示了一个(S公司)-酮洛芬分子到药物位点2，2(S公司)-酮洛芬分子到药物位点3和1(R（右）)-酮洛芬分子到药物位点9（图2). 此前有报道称，这三个位点都能结合多种美国食品药品监督管理局批准的药物(补充图S2; Czub公司等。, 2020). 该结构还包含三个脂肪酸分子，模型化为肉豆蔻酸，结合到FA3（与药物位点2重叠）、药物位点5（之前未表征为脂肪酸结合位点）和FA5（与药物部位8重叠）。因此，测定的HSA与酮洛芬的络合物与肉豆蔻酸的HSA络合物（PDB入口）具有几乎相同的构象1bj5号机组). 然而，它与无配体HSA结构（PDB入口）明显不同4千2厘米)，可以从对齐的C之间的r.m.s.d.值得出结论^α原子(补充表S1,补充图S3).脂肪酸结晶过程中没有添加，很可能是纯化后的残余物。制造商在纯化过程中向蛋白质中添加游离半胱氨酸，以阻断HSA中唯一的游离半胱酶残基，防止白蛋白二聚。根据观察到的电子密度，Cys34与另一个半胱氨酸分子形成二硫键。在确定的结构中观察到的配体电子密度的质量可以在https://molstack.bioreproducibility.org/project/view/VW8s7hb1Z9mnCLbg3NBU/作为对照，我们还测定了在相同结晶条件下获得的HSA的2.70º分辨率结构，但不含酮洛芬（空间群P（P）1; 单元-单元参数一 = 38.0,b= 86.2,c（c）= 97.3 Å,α= 75.0,β= 89.6,γ= 78.6°; 数据未显示）。在对照结构中，所有酮洛芬结合位点（药物位点2、3和9）保持未被占据，Cys34也与另一个半胱氨酸分子形成二硫键，并且脂肪酸与HSA–酮洛芬复合物中的相同位点结合。

图2 HSA与酮洛芬复合物的整体结构。白蛋白子域以不同的颜色显示。罗马数字（I、II、III）与域相关联，字母（例如IB）与子域相关联。酮洛芬分子显示为黑色球体中的原子。

3.2. HSA中酮洛芬结合位点

药物位点2，也称为Sudlow位点II和FA3/FA4，是白蛋白中三个主要药物结合位点之一（图3; Czub公司等。, 2020; 苏德洛等。, 1975, 1976). (S公司)-占据该位置的酮洛芬分子通过与周围残基（主要是Tyr411、Val415、Val418、Leu423、Val426、Leu430、Leu453、Val456、Leu 457、Leu460和Phe488）的强疏水相互作用以及其羧酸基与Tyr41和Ser489的羟基之间的氢键来稳定。Arg410还可能与羧酸盐基团产生远程电荷相互作用。参与结合的残留物(S公司)-表2列出了药物部位2的酮洛芬到HSA.一个(S公司)-与药物位点2结合的酮洛芬分子与之前报道的在FA4中结合的脂肪酸重叠（参见PDB条目1bj5美元; 咖喱等。, 1998)并且位于FA3附近，FA3被报告结构中的肉豆蔻酸分子占据。

图3 HSA中酮洛芬结合位点（PDB进入7加仑). 第2个毫发o个−DF公司c（c）电子密度图（r.m.s.d.为1.0Ω）以蓝色表示毫发o个−DF公司c（c）省略电子密度图（10后计算的图REFMAC公司 精炼模型中不含药物的循环，均方根表面积为2.5º）以绿色表示。酮洛芬分子以棒状表示，O原子为红色，C原子为黄色。螺旋线的颜色对应于图2中使用的颜色。电子密度和模型可以在https://molstack.bioreproducibility.org/project/view/VW8s7hb1Z9mnCLbg3NBU/.

药物部位3，也称为肿瘤药物部位和FA1（Wang，Ho等。, 2013)也是SA（Czub）上三个主要药物结合位点之一等。, 2020; 苏德洛等。, 1975, 1976). 这个网站有两个(S公司)-酮洛芬分子结合，因此可以被视为两个亚基。子网站A与先前描述的FA1网站重叠（Curry等。, 1998)并且有(S公司)-酮洛芬结合。(S公司)-子网站A中的酮洛芬通过其羧酸基和Arg117的胍基之间的盐桥，通过与形成窄结合囊的残基（主要是Leu115、Met123、Phe134、Tyr138、Leu139、Ile142、Leu 154、Ala158、Try161、Phe165和Leu182）的强疏水相互作用而稳定，并通过从其羧酸基团到Tyr161的羟基的氢键（表2). 此外，羧酸盐基团与Arg186的远程电荷相互作用可能是一个额外的稳定因素。药厂3内的子公司B窝藏(S公司)-酮洛芬分子被稀疏的疏水残基包围，主要是Ile142、Phe149、Leu154、Phe 157、Tyr161和Lys190侧链的脂肪族部分。在这个亚网站上(S公司)-酮洛芬与His146侧链（NE2原子）形成氢键，并与Arg145形成远程电荷-电荷相互作用。与药物位点2和亚网站A相比，亚网站B的疏水性明显较小（参与相互作用的疏水残基数量明显较少），亲水性相互作用较弱（没有盐桥，只有一个氢键），这可能意味着(S公司)-酮洛芬。事实上，该配体的高原子ADP值（表1)可能表明其部分占据，但也可能是其在晶体中HSA分子之间位置变化的结果。值得注意的是(S公司)-与位点3内的亚基结合的酮洛芬的苯环彼此位于4º以内（图3)，这表明疏水相互作用另外，还可以稳定这两者(S公司)-酮洛芬分子和可能导致协同结合。

药物位点9位于FA8和FA9附近，是SA（Czub）中较少见的药物结合位点等。, 2020). 此网站仅包含(R（右）)-酮洛芬分子的报告结构。(R（右）)-酮洛芬分子通过几种疏水相互作用（主要与Ala191、Ala194、Val433、Tyr452、Val455、Val456以及Lys190和Lys432的脂肪族部分）而稳定；在其羧酸基和Tyr452的羟基之间形成氢键，在Lys436的羧酸基与氮基之间形成盐桥。(R（右）)-酮洛芬分子具有相对较高的ADP值，表明部分占据或位置变异，这也与该位点的疏水性显著较小有关，这可能导致较低的结合亲和力。

3.3. HSA和其他哺乳动物SA中酮洛芬结合位点的比较

将HSA–酮洛芬复合物的整体结构和观察到的单个结合位点与之前报道的ESA、BSA和LSA与酮洛芬的复合物结构进行了比较。表3总结了所用实验条件和十个已知药物结合位点的占用情况的比较.

表3 SA–酮洛芬复合物和常见药物结合位点中观察到的配体的结晶条件   HSA–酮洛芬 ESA–酮洛芬 BSA–酮洛芬 LSA–酮洛芬 PDB代码 7加仑 6个u4 6个问题9 6锁定 参考 这项工作 Czub公司等。(2020) 卡斯塔尼亚等。(2019) 泽林斯基等。(2020) SA来源 重组HSA表达于巴氏杆菌（西格玛A7736） 从马血中分离的ESA（Equitech-Bio ESA62） 从牛血液中分离出的牛血清白蛋白（Sigma） 从麻风病人血液（Sigma）中分离出的LSA，并在实验前脱脂 结晶液滴 HSA（162 mg ml−1)缓冲溶液（50 mM（M）特里斯，20米M（M）NaCl（pH 7.5）与100 m混合M（M）DMSO中酮洛芬的比例为9:1。HSA溶液与储液溶液按1:1混合。 ESA（34 mg ml−1)缓冲溶液（10 mM（M）特里斯，150米M（M）NaCl pH7.5）与储液溶液1:1混合。用悬浮在二甲基亚砜中的酮洛芬浸泡ESA晶体。 A BSA（10 mg ml−1)缓冲溶液（10米M（M）特里斯，150米M（M）NaCl pH7.5）与乙醇中溶解的酮洛芬混合。BSA溶液与储层溶液按1:1混合。 LSA（67 mg ml−1)缓冲溶液（10 mM（M）Tris，100米M（M）NaCl pH 7.4）与乙醇中溶解的酮洛芬混合。LSA溶液与储层溶液按1:1混合。 最终酮洛芬浓度（mM（M）) 5 3 0.7 4.6 储层溶液 50米M（M）磷酸钾，24%聚乙二醇3350 pH 7.0 100米M（M）Tris，2.0版M（M）硫酸铵，200 mM（M）硫酸锂pH 7.4 100米M（M）MES，18%PEG MME 5000200米M（M）氯化铵pH 6.5 100米M（M）三元，8%聚丙烯乙二醇400，16%聚乙二醇3350，200 mM（M）乙酸铵pH 8.0 DS1号机组 — UNL（解锁） (R（右）)-酮洛芬 醋酸盐离子 DS2号机组 (S公司)-脂肪酸酮洛芬（C14:0；肉豆蔻酸酯） 脂肪酸（C9:0；壬酸） — (S公司)-酮洛芬 DS3号机组 两个分子(S公司)-酮洛芬 — — 聚乙二醇分子 DS4（DS4） — (S公司)-酮洛芬 — PDB代码为2J3的聚合物 DS5公司 脂肪酸（C14:0；肉豆蔻酸） — — — DS6系列 — (S公司)-酮洛芬 — (S公司)-酮洛芬，醋酸盐离子 第7季度 — — — 带有PDB代码POG的聚合物 DS8号机组 脂肪酸（C14:0；肉豆蔻酸） — — — 第九季度 (R（右）)-酮洛芬 — — 醋酸盐离子 DS10公司 — (S公司)-酮洛芬 — —

最近有报道称ESA（与HSA的成对序列同源性为76.1%）与HSA结合(S公司)-药物部位4、6和10的酮洛芬（图4; Czub公司等。, 2020). 令人惊讶的是，这些药物位点在HSA结构中没有被占用。Czub详细讨论了ESA和HSA中包含这些药物位点的残留物的保存等。(2020)，他得出结论，ESA和HSA之间的药物位点4存在显著差异（57%的保守性），药物位点6部分保守性（75%的残基被保存），而药物位点10在两个物种的白蛋白之间保存得很好（94%的保守性）。因此(S公司)-位置4和6的酮洛芬可能归因于这些差异。然而，所有与(S公司)-ESA中药物位点10的酮洛芬与HSA中相同，但Ile7除外，Ile7是HSA中的Val。此外，ESA中的Ile7仅促进与药物分子的疏水性相互作用，进一步表明位点的保守性，并导致HSA中的药物位点10也可能结合(S公司)-酮洛芬，尽管在这里报道的结构中没有观察到它。药物场所2，其中(S公司)-酮洛芬与HSA结合，被ESA-酮洛芬复合物结构中的肉豆蔻酸分子占据，可能阻止药物结合。药物场所3和9在该结构中仍然空置。

图4 哺乳动物血清白蛋白中酮洛芬结合位点。酮洛芬与HSA（PDB入口）配合物的结构7加仑)、欧空局（Czub等。, 2020; PDB条目6个u4)，BSA（卡斯塔尼亚等。, 2019; PDB条目6问9)和LSA（齐林斯基等。, 2020; PDB条目6锁定).

据报道，药物位点1（Sudlow位点I）是BSA中唯一的酮洛芬结合位点（与HSA的成对序列同源性为75.6%），具有(R（右）)-在此位置模拟的对映体（图3; 卡斯塔尼亚等。, 2019). 大多数残基与(R（右）)-药物部位1的酮洛芬在BSA和HSA之间保守（图5)包括Arg256（HSA中的Arg257）和Tyr149（HSB中的Tyr150）。这些残基分别与酮洛芬的羧酸基团形成盐桥和氢键。只有两种残基不同：Arg198（HSA中的Lys199）和Lys221（Arg222）。此外，它们只参与疏水相互作用，这些变化不应影响酮洛芬与该位点的结合。然而，尽管BSA和HSA之间的药物位点1的序列保守性很高（89%），但该位点在HSA-酮洛芬复合物的现有结构中仍然没有被占据。药物位点2、3和9在BSA-酮洛芬结构中不含配体。在这种结构中，只有一个酮洛芬分子与BSA结合，这可以用与其他配合物相比所使用的酮洛芬浓度较低来解释（表3).

图5 牛血清白蛋白中酮洛芬结合位点的重叠(一)（PDB条目6个问题9)和LSA(b,c（c）)（PDB条目6锁定)在无配体HSA（PDB入口）中具有类似位点4千2厘米). BSA、LSA和HSA中的C原子分别显示为青色、黄色和灰色。残数对应于HSA中的位置。黑色标记的残留物在BSA或LSA和HSA之间是保守的，而红色标记的则不同。不同残基的命名方案如下：BSA或LSA中的残基，残基数，HSA中相应的残基。

据报道，LSA与HSA的配对序列同源性为73.4%，与HSA结合(S公司)-酮洛芬在药物位点2和6（图4; 泽林斯基等。, 2020). 令人惊讶的是，药物位点2结合(S公司)-酮洛芬在HSA和LSA中都存在，但这些结构中的结合模式不同（图6). (S公司)-LSA中药物位点2的酮洛芬分子通过与周围残基的疏水相互作用而稳定，并在其羧酸基团与Lys414和Tyr411之间形成盐桥和氢键。参与这些相互作用的大多数残基是保守的（89%）。此外，LSA和HSA之间不同的两个残基（Val388被Ile取代，Val449被Ala取代）不会改变结合位点的性质（图5). 该药物的羧酸基大致占据相同的位置，但其疏水部分方向相反。这里报道的HSA结构中，肉豆蔻酸分子（FA3）在此位置的存在可能会影响(S公司)-酮洛芬。以前(S公司)-据报道，布洛芬通过两种不同的结合模式与HSA和ESA中的药物位点2结合，这两种结合模式类似于(S公司)-酮洛芬(补充图S4; Czub公司等。, 2020).

图6 的比较(S公司)-酮洛芬与HSA中药物位点2的结合（PDB进入7加仑)和LSA（PDB条目6锁定). (S公司)-酮洛芬分子和与HSA结合的脂肪酸分子以棒状表示，O原子为红色，C原子为黄色，而(S公司)-与LSA结合的酮洛芬以棒状表示，O原子为红色，C原子为灰色。螺旋线的颜色对应于图2中使用的颜色.

另一个(S公司)-酮洛芬分子与LSA中的药物位点6结合，通过疏水相互作用和羧酸基团与Asn397侧链（NE2原子）之间的氢键以及羰基与Asn402侧链（ND2原子）和Lys545侧链之间的氢链稳定。该结合位点在LSA和HSA之间保守82%。HSA中两个不同的残基（Asn402到Lys和Asn541到Lys）改变了空腔的总电荷，并且由于HSA中Lys侧链的尺寸较大，可能会影响药物的构象，甚至阻止药物完全结合。药物位点6在HSA-酮洛芬结构中未被占据。在LSA–酮洛芬结构中，药物位点3被聚乙二醇分子占据，这可能会阻止药物与该位点结合。药物部位9中存在醋酸盐离子。