1.简介
这个沙粒病毒科是一个与人类啮齿动物传播感染相关的病毒家族。这些病毒在啮齿动物中引起慢性和无症状感染，并在世界各地构成人类病原体的贮存库（布赫迈耶等人。, 2007![【Buchmeier，M.J.，de la Torre，J.-C.&Peters，C.J.（2007）。《菲尔德病毒学》，第5版，第二卷，由D.M.Knipe和P.M.Howley编辑，第1791-1827页。费城：Lippincott Williams&Wilkins。]](../../../../../../logos/arrows/iucrj_arr.gif "Buchmeier，M.J.、de la Torre，J.-C.和Peters，C.J.（2007）。菲尔兹病毒学，第五版，第二卷，D.M.Knipe和P.M.Howley编辑，第1791-1827页。费城：Lippincott Williams&Wilkins。")
). 事实上，包括拉萨病毒,卢霍病毒,瓜纳里托病毒,萨比亚病毒,查帕雷病毒,马丘波病毒和朱宁病毒，是出血热爆发的原因，也是一个主要的公共卫生问题（Bowen等人。, 1997; 恩里亚等人。, 2008; 布里斯等人。, 2009). 仅在西非（塞拉利昂、几内亚、利比里亚、尼日利亚和贝宁），拉萨病毒每年造成数十万人感染（Günther&Lenz，2004). 这是一种常见的地方性感染，在大多数情况下会导致听力损失、震颤和脑炎，并且在1%的情况下会成为致命的出血热（Yun等人。, 2015). 根据世卫组织165例确诊病例和89例死亡病例的数据（通过实验室测试确认；世界卫生组织，2016年），上一次拉沙热疫情于2015年8月至2016年5月在尼日利亚爆发，病例生育率（CFR）为53.9%)。淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）是第一个分离出的沙粒病毒，被认为是该家族的原型病毒。它偶尔传播给人类，可能导致危及生命的脑膜炎和/或出血热，一些临床研究表明其致病性被低估了（Mets等人。, 2000; 舒尔特等人。，2006年; 杰米森等人。, 2006; Bonthius，2012年). 因为它的天然宿主是普通的家鼠(小家鼠)它在全球分布，欧洲、美洲、澳大利亚和日本报告了LCMV感染。LCMV是一种具有重要临床意义的人类病原体，可导致免疫功能低下的器官移植患者（Fisher-Hoch等人。, 1995; 已见者等人。, 2000; 巴顿等人。, 2002; 费希尔等人。, 2006; 舒尔特等人。, 2006; 麦克尼尔等人。, 2012). 人类通常通过接触受感染啮齿动物新鲜尿液、粪便、唾液或筑巢材料的气溶胶或器官移植过程中感染沙粒病毒（Fischer等人。, 2006). 尽管这些病原体对人类健康构成了广泛的威胁，但没有疫苗，只有有限的治疗选择（Lee等人。, 2011). 治疗人类沙粒病毒感染的唯一许可药物是广谱抗病毒利巴韦林，该药物仅部分有效，且具有显著毒性（McCormick等人。, 1986; 基尔戈尔等人。, 1997; 恩里亚等人。, 2008). 因此，有一个未满足的需求，即确定可开发成抗病毒药物以对抗人类致病性沙型病毒的新型化合物。
沙粒病毒是一种包膜病毒，带有双段阴性单链RNA基因组。每个片段以双义方式编码由基因间区域（IGR）分隔的两个蛋白质。L RNA片段编码大蛋白L（～200 kDa）和小无序蛋白Z（～11 kDa等人。, 2007). L（UniProt P14240）是一种多域蛋白质：其N末端包括一个核酸内切酶域（残基1-196）和一个病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）域，但它缺乏一个封盖机制（López等人。, 2001). Z蛋白包含一个环指基序，是一种多功能蛋白，它调节病毒的生命周期，并在出芽期间组装形成基质（Cornu&de la Torre，2001）; 佩雷斯等人。, 2003, 2004; 桑多纳蒂·哈斯蒂等人。, 2016). S RNA片段编码成熟病毒蛋白糖蛋白GP-C（75 kDa）的前体，其在翻译后裂解后产生GP-1（40–46 kDa等人。, 2016)和核蛋白NP（～63 kDa；布赫迈耶等人。, 2007). NP形成保护基因组（和抗原）RNA（RNA）的聚合物v（v）). L和NP以及RNAv（v）形成用于复制和转录的活性核糖核酸复合物（平谢尔等人。2003年). 沙粒病毒属负RNA病毒；因此，病毒周期的第一步开始于L和NP病毒信使核糖核酸的转录（信使核糖核酸；Perez和de la Torre，2003). 这一步骤由L蛋白进行，并通过招募细胞来开始（可能在NP的帮助下）信使核糖核酸作为第一步。L蛋白裂解并夺取天然细胞信使核糖核酸～11后通过其内切酶结构域的帽状结构核苷酸，并将其作为L蛋白RdRp结构域的引物序列来合成病毒mRNA。这个晶体结构LCMV内切酶结构域（ENDO）最初是在一段时间前测定的（Morin等人。, 2010)但在这个原始结构中，完全理解核酸内切酶作用模式所必需的催化离子缺失了。Cap-snatching对病毒的生命周期至关重要，这使得核酸内切酶域成为药物设计开发的目标（Charrel等人。, 2011). 此机制由共享正粘病毒科和布尼亚病毒科，两个家族拥有显著的致病成员，其核酸内切酶已用于药物开发（雷圭拉等人。, 2010; 科瓦林斯基等人。, 2012; 杜波依斯等人。, 2012). 然而，沙粒病毒科核酸内切酶是开发抑制剂的一个具有挑战性的靶点。事实上，与来自正粘病毒科和布尼亚病毒科（费龙等人。, 2017). 以前的结构研究拉萨病毒内切酶表征了与催化离子的络合物（Wallat等人。, 2014)但未能获得含有抑制剂的复合物（Reguera等人。, 2016). 然而，人们对病毒核酸内切酶抑制剂产生了极大的兴趣，这些抑制剂被设计成占据活性位点并螯合金属离子（Rogolino等人。, 2012)。
在这项研究中，我们选择了两种已知的靶向流感病毒核酸内切酶的分子(正粘病毒科)作为抗沙粒病毒化合物基于结构的药物设计的起点（Noble等人。, 2012; 斯特瓦尔特等人。, 2013). 我们表征了DPBA的结合亲和力(1)和L-742001(2)（图1一)通过生物物理方法进行LCMV ENDO。我们评估了它们在在体外催化离子（Mg）对LCMV endo的核酸内切酶分析和晶体结构的解析2+或Mn2+)以及这两种二酮酸（DKAs）中的每一种。根据结构分析和生物信息学分析，我们合成了两种新的DKAs，化合物(三)和(4)（图1b条)它不仅对LCMV ENDO表现出更好的亲和力，而且对其活性也表现出了更好的抑制作用。
![[图1]](lz5019fig1thm.gif)
| 图1
2,4-二氧代-4-苯基丁酸[DPBA(1)], (Z)-4-{1-苄基-4-[（4-氯苯基）-甲基]-哌啶-4-基}-2-羟基-4-氧杂-2-烯酸[L-742001(2)]，2-羟基-4-（联苯-4-基）-4-氧代丁-2-烯酸(三)和2-羟基-4-氧代-4-（菲-3-基）丁-2-烯酸(4)。 |
2.材料和方法
2.2. 蛋白质表达和纯化
将野生型ENDO（ENDO-WT）及其D118A和D88A突变体克隆到具有N-末端六组氨酸标签的pDEST14中，并在大肠杆菌Rosetta（DE3）pLysS细胞在TB培养基中17°C下经500 m诱导过夜M（M）IPTG。从收获的培养物中提取的细胞颗粒重新悬浮在50 mM（M）Tris缓冲液pH 8.0，300 mM（M）氯化钠，10米M（M）咪唑、0.1%Triton X-100、5%甘油。溶菌酶（0.25 mg ml−1)，DNA酶I（10µg ml−1)和无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）在超声处理前添加。固定金属离子色谱法在5 ml HisPrep色谱柱上进行澄清的裂解产物的分析（美国通用电气医疗集团的Al KTA express FPLC系统），使用500 m的相同缓冲液进行洗脱M（M）咪唑。洗脱的His标记部分在HiTra Q Sepharose 1 ml柱上稀释和纯化（GE Healthcare）。使用50 m的线性梯度洗脱蛋白质M（M）到1M（M）10米内的氯化钠M（M）HEPES缓冲液pH 7.5，2 mM（M）DTT公司。尺寸排除色谱法在制备的Superdex 200色谱柱（GE Healthcare）上进行，用10 m预平衡M（M）HEPES pH 8.0，50 mM（M）氯化钠，2米M（M）DTT公司。将蛋白质浓缩至25 mg ml−1并在液氮中冷冻。
2.3. 化合物和基质表征
2.3.1. 差示扫描荧光法（DSF）
熔化温度(T型米)蛋白质的值通过基于热荧光的分析测定。在96 well薄壁PCR板中，将11µl蛋白质溶液（ENDO）添加到11µl化合物中(1)或化合物(2)和/或金属离子（Mg2+或Mn2+)10米M（M）HEPES缓冲液pH 8.0，50 mM（M）氯化钠，2米M（M）DTT公司。最后，添加3µl荧光染料SYPRO Orange（715倍稀释于H2O；分子探针）。热能变性随后使用CFX Connect实时PCR检测系统（Bio-Rad）测量575nm处的荧光发射（在490nm处激发）。最终浓度调整为75µM（M）蛋白质，0.5米M（M）氯化镁2，0.5米M（M）氯化锰2, 450 µM（M）化合物(1)或(2)（最终配体：蛋白质比率=6）和5%二甲基亚砜。这个变性用玻尔兹曼方程计算蛋白质的中点GraphPad棱镜。所有测量均一式三份。
2.3.2. 微尺度热泳（MST）
MST实验在Monolith NT.115仪器（NanoTemper Technologies）上进行。使用蛋白质标记试剂盒red-NHS（纳米回火技术）用红色荧光染料NT-647标记蛋白质。标记蛋白的浓度保持在100 nM（M）而化合物的浓度是不同的。从500、250或125µ开始的15步双重稀释系列M（M）最终产生了16种不同浓度的测试化合物[(1)–(4)]. 实验在10米范围内进行M（M）含100 m pH值为8的HEPES缓冲液M（M）氯化钠，1米M（M）DTT，0.05%(w个/v（v）)吐温20.25米M（M）氯化镁2和0.25米M（M）氯化锰2.将最终样品调整为5%二甲基亚砜，以确保化合物的溶解度。样品在13000转/分的转速下离心5分钟−1去除潜在聚集物，将上清液装入标准处理过的MST级玻璃毛细管中（NanoTemper Technologies）。培养5分钟后，用80%的LED功率和80%的红外激光功率测量MST。Kd日使用纳米回火分析软件。
2.3.3。等温滴定法热量测定法（ITC）
将纯化的ENDO稀释在含有10 m的ITC缓冲液中M（M）HEPES pH 8.0，50 mM（M）氯化钠，2米M（M）DTT，0.25米M（M）氯化镁2，0.25米M（M）氯化锰2.化合物(1)在相同的缓冲液中稀释。在细胞和注射器中，DMSO的最终浓度为5%。在MicroCal ITC200微量热量计（GE Healthcare）中进行滴定。实验设计采用滴定剂浓度[1 mM（M）DPBA公司(1)在注射器中]分析物浓度的十倍（100µM（M）蛋白质），在25°C下注射19次。滴定方案中包括第一次小注射（0.2µl），以便在滴定之前去除注射器中截留的气泡。将零设置为滴定饱和热值后，对原始数据进行缩放。使用MicroCal来源插件的实现原产地9.1（原始实验室）。每个实验进行三次，数据显示为平均值±标准偏差。
2.3.4.体外核酸内切酶测定
安在体外内切酶分析用于研究化合物的抑制作用(1)和(2). 反应在20µl样品中进行，样品由20 m组成M（M）Tris–HCl pH值8150 mM（M）氯化钠，1米M（M）TCEP，2米M（M）氯化锰2ENDO-WT（20µM（M）)与50、125、250、500、1000或2000µ预先混合M（M）通过添加1µM（M）19核苷酸单链RNA（Morin等人。, 2010). 反应混合物在25°C下培养，6小时后通过添加20µl加载缓冲液（含有10 m的甲酰胺）停止反应M（M）EDTA）。用于比较DPBA抑制作用的实验(1)和化合物(三)和(4)，内宽（20µM（M）)预混合50µM（M）采用与上述相同的方案。在20%聚丙烯酰胺/8上分析反应产物M（M）尿素凝胶。使用荧光图像分析仪FLA3000（Fuji）在光刺激板上观察未消化的RNA，并使用图像仪表（富士）。图表绘制使用GraphPad棱镜。所有实验均一式三份。
2.4。结晶、数据收集和结构测定
2.4.1. 结晶
通过混合200 nl蛋白质溶液（13 mg ml−110米以内M（M）HEPES pH 8.0，50 mM（M）氯化钠，2米M（M）DTT），使用蚊子机器人（TTP Labtech）提供100 nl水库溶液。与离子络合的ENDO-WT晶体生长在100 m的储存溶液中M（M）柠檬酸钠，pH 6.2，3%异丙醇，使用补充了1m的蛋白质溶液M（M）氯化镁2ENDO-WT晶体与离子和DPBA络合(1)在100 m的水库溶液中生长M（M）柠檬酸钠，pH 6.2，3.5%异丙醇，使用补充1m的蛋白质溶液M（M）氯化镁2和2米M（M）DPBA公司(1)（在PEG 400中溶解）。ENDO-WT晶体与离子和L-742001络合(2)在100 m的水库溶液中生长M（M）柠檬酸钠，pH 6，3.5%2-丙醇，使用补充了1m的蛋白质溶液M（M）氯化锰2和2米M（M）L-742001型(2)（在PEG 400中溶解）。ENDO-D118A突变体的晶体生长在100 m的储存溶液中M（M）柠檬酸钠，pH 6.3，8%异丙醇。所有晶体均在液氮中冷冻2使用20%(v（v）/v（v）)母液中的甘油作为冷冻保护剂。
2.4.2. 数据收集和结构测定LCMV的
与离子络合的ENDO-WT数据收集在束线ID23-1上，与L-742001络合的数据(2)在欧洲同步辐射设施（ESRF）的束线ID23-2上收集。ENDO-WT与DPBA复合的数据(1)并且在同步加速器SOLEIL的PROXIMA-1光束线上收集ENDO-D118A突变体。使用自动PROC工具箱（冯海因等人。, 2011). 通过以下方法获得相位分子置换使用相位器（麦考伊等人。, 2007)带有PDB条目3jsb型（莫林等人。, 2010)作为搜索模型。所有水和配体分子都从搜索结构中删除。使用重建初始模型自动编译（特威利格等人。, 2008)然后执行。随后，全原子各向同性温度系数精炼使用菲尼克斯定义（黄嘌呤等人。, 2012)和/或巴斯特（布兰科等人。, 2004). 电子密度图使用库特（埃姆斯利等人。, 2010). 在络合结构中观察到离子和/或化合物的额外密度，但在突变结构中未发现任何密度（补充图S4b条). 使用摩尔概率（陈）等人。, 2010)和PROCHECK检查（拉斯科夫斯基等人。, 1993). 进行了结构分析，并用UCSF奇美拉（佩特森等人。, 2004). 数据收集和细化统计如表1所示.
| | LCMV ENDO与镁络合2+离子 | LCMV ENDO与DPBA复合(1) | LCMV ENDO与L-742001复合(2) | LCMV ENDO-D118A突变株 | | PDB代码 | 5升 | 5升 | 5吨 | 5升 | | 光束线 | ID23-1，ESRF公司 | SOLEIL前置器-1 | ID23-2、ESRF | SOLEIL前置器-1 | | 波长（Ω） | 0.976 | 0.978 | 0.873 | 0.978 | | 分辨率范围（Ω） | 48.46–2.43 (2.52–2.43) | 53.59–1.88 (1.95–1.88) | 54.06–1.97 (2.04–1.97) | 53.57–2.51 (2.60–2.51) | | “空间”组 | P（P）41 | P（P）41 | P（P）41 | C类2221 | | 一,b条,c（c）（Å） | 108.4, 108.4, 54.1 | 107.2、107.2、53.8 | 108.1, 108.1, 54.1 | 144.8, 159.2, 52.7 | | α,β,γ(°) | 90, 90, 90 | 90, 90, 90 | 90, 90, 90 | 90, 90, 90 | | 不对称单元中的分子 | 2 | 2 | 2 | 2 | | 总反射 | 67793 (6444) | 241187 (14092) | 308124（31957） | 73597 (7143) | | 独特的反射 | 23573 (2252) | 49896 (4927) | 44686 (4457) | 21183（2063） | | 多重性 | 2.9 (2.9) | 4.8 (2.9) | 6.9 (7.2) | 3.5 (3.4) | | 完整性（%） | 96.0 (96.0) | 99.6 (99.5) | 100 (100) | 99.0 (100) | | 平均值我/σ(我) | 13.61 (1.58) | 8.54 (1.20) | 12.51 (2.02) | 14.17 (2.09) | | 威尔逊B类系数（Ω2) | 57.12 | 37.53 | 33.03 | 58.27 | | R（右）合并 | 0.046 (0.607) | 0.094 (0.868) | 0.094 (0.870) | 0.060 (0.594) | | R（右）测量 | 0.056 (0.744) | 0.105 (1.15) | 0.102 (0.938) | 0.071 (0.704) | | 科科斯群岛1/2 | 0.999 (0.586) | 0.996 (0.416) | 0.998（0.715） | 0.997 (0.649) | | 细化中使用的反射数 | 22999 | 49844 | 44682 | 21091 | | 自由反射次数 | 1932 | 2457 | 2210 | 1004 | | R（右）工作 | 0.18 (0.27) | 0.19 (0.29) | 0.18 (0.27) | 0.20 (0.27) | | R（右）自由的 | 0.23（0.33） | 0.21 (0.29) | 0.22 (0.30) | 0.22 (0.29) | | 结构中的原子数 | | 总计 | 3240 | 3353 | 3586 | 3184 | | 大分子 | 3080 | 3064 | 3193 | 3063 | | 配体 | 2 | 60 | 47 | 8 | | R.m.s.d.，债券（Au） | 0.009 | 0.010 | 0.008 | 0.013 | | R.m.s.d.，角度（°） | 1.09 | 1.10 | 1.86 | 1.67 | | 拉马钱德兰阴谋 | | 有利（%） | 92 | 97 | 97 | 97 | | 允许（%） | 5.7 | 1.9 | 2.3 | 2.7 | | 异常值†(%) | 2.3 | 1.1 | 0.7 | 0.3 | | 平均B类系数（Ω2) | 75.92 | 50.30 | 41.98 | 74.32 | | †异常蛋白位于蛋白质的高度灵活区域。
|
4.结论
我们报道了LCMV核酸内切酶结构域的四种晶体结构：一种含有两个二价离子（Mg）的复合物2+)、D118A突变体和配体配合物的前两种结构–DKAs-DPBA(1)和L-742001(2). 这些结构提供了第一个与沙粒病毒核酸内切酶结合的特定配体的详细结构信息。我们的数据表明，全息结构中离子的存在实际上是一个罕见的事件。结构表明，金属-离子结合取决于能够在离子周围形成网状相互作用的水分子的数量。这表明负责双金属离子催化反应的催化离子很可能是由RNA底物本身引入的。本研究表明，Asp88是介导金属离子结合的关键残基。此外，根据对所有沙粒病毒科内切酶结构域，我们已经确定了四个基序，可以用作锚定靶向该结构域的优化化合物的特异性。基于两个新优化的DKA，我们的初步结果表明芳香环修饰提高了结合活性，主要是抗ENDO活性。尽管存在开放活性位点的挑战，但本研究证明了配体结合结构的知识可以指导针对LCMV核酸内切酶结构域的优化抑制剂的设计。
附录A
化学
所有试剂和无水溶剂均购自奥尔德里奇，使用时无需进一步干燥。所有涉及气敏或湿敏化合物的反应均在氩气气氛下使用烘箱干燥的玻璃器皿和注射器进行。在DMSO-d中测定核磁共振谱6在Jeol光谱仪上（400 MHz）。化学位移以p.p.m和耦合常数表示(J型)以赫兹（s，单重态；d，二重态；m，多重态）表示。使用Hypersil-Gold C18（2.5µm，2.1×50 mm）色谱柱和Finnigan Surveyor MSQ（MS），在Thermo Fisher Accela 600（检测260 nm）上记录HPLC/MS光谱，并在电喷雾电离（ESI）下进行正、负电离模式检测。用5–100%0.01%甲酸在乙腈溶液中的梯度洗脱化合物，洗脱时间为500µl min−1流速。
A1.化合物制备的一般程序(三)和(4)
将钠（20 mmol）缓慢添加到冰水浴中的冷甲醇中，得到2M（M）甲醇钠溶液。将适当的芳基甲基酮（5 mmol）和草酸二甲酯（10 mmol）溶于干燥的THF/DME[1:1(v（v）:v（v）)]将溶液滴入新制备的甲醇钠中。在室温下将混合物搅拌8小时。过滤所得固体，用冷甲醇和乙醚洗涤并干燥。将获得的酮烯酸钠酯溶解在水中并在室温下搅拌1 h。然后通过添加1N个将沉淀过滤掉，用冷水清洗并干燥。将获得的酮醇酯溶解在THF/MeOH[1:1(v（v）:v（v）)]和2的解N个逐滴加入NaOH。在室温下将所得澄清溶液搅拌1 h。通过添加1N个过滤掉HCl和形成的沉淀物，用冷水清洗并在真空下干燥。通过从乙醚结晶得到所需的芳基二酮酸来纯化所获得的粗物质(三)和(4)。
A2.2-羟基-4-（联苯-4-基）-4-氧杂-2-烯酸(三)
这是使用4-乙酰基联苯作为起始材料获得的黄色固体（212mg，27%总产率）。Tr-HPLC/MS，3.87分钟LC-MS（ESI−), 266.97 [M（M）–H]−; 人力资源管理系统ESI−为C计算16H（H）12O（运行）4[M（M）–H]−, 267.0663; 找到267.0663。1核磁共振氢谱（400 MHz，二甲基亚砜-d6)δ（下午）：8.16（d，2H，J型=8.1赫兹），7.88（d，2H，J型=8.1赫兹），7.77（d，2H，J型=7.8 Hz），7.54–7.50（m，2H），7.47–7.38（m，1H），7.15（s，1H。13C核磁共振（100 MHz，二甲基亚砜-d6)δ（下午）：189.73、170.28、163.16、145.33、138.61、133.39、129.14、128.63、127.24、127.03、97.87。
A3.2-羟基-4-氧代-4-（菲-3-基）丁-2-烯酸(4)
这是以3-乙酰菲为起始材料获得的黄色固体（185 mg，全球产量23%）。Tr-HPLC/MS，4.10分钟LC-MS（ESI−), 290.94 [M（M）–H]−; 人力资源管理系统ESI−为C计算18H（H）12O（运行）4[M（M）–H]−, 291.0663; 发现，291.0664。1核磁共振氢谱（400 MHz，二甲基亚砜-d6)δ（下午）：9.37（s，1H），9.01（s，2H），8.16–7.90（m，5H），7.76–7.70（m，2H。13C核磁共振（100 MHz，二甲基亚砜-d6)δ（下午）：187.61、174.57、164.17、134.01、131.79、131.79.、129.97、129.37、129.04、128.72、127.46、127.37、126.32、124.89、123.28、122.52、99.13。
鸣谢
作者要感谢SOLEIL的PROXIMA-1波束线以及ESRF波束线ID23-1和ID23-2的工作人员。作者感谢朱莉·利奇埃（Julie Lichière）和凯文·博特利奥·费雷拉（Kévin Botelho Ferreira）的技术援助，以及布鲁诺·库塔德（Bruno Coutard）博士、胡安·雷圭拉（Juan Reguera）博士和多明加·罗戈利诺（Dominga Rogolino）博士。
资金筹措信息
以下资金已获认可：Recherche国家机构（批准号ANR-11-BSV8-0019和ANR-10-INSB-05-01）；Recherche Médicale基金会（合同号SPF20130526788）；地中海感染基金会。
参考文献
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