2.1. 蛋白CAIX的表达和纯化_SV公司

CA九_SV公司其他地方也详细介绍了生产情况（科鲁扎、拉富马特、维格瓦里等。, 2018; 马洪等。, 2016). 简言之，CA IX_SV公司表示为大肠杆菌卡那霉素筛选下的BL21（DE3）细胞（最终浓度为50µg ml⁻¹)在37°C的摇晃培养箱中。细胞生长到OD₆₀₀～1.0，并且通过添加1mM（M）异丙基β-D类-1 m存在下的1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）M（M）硫酸锌₄4小时后，通过离心（5000克20分钟），并在−20°C下冷冻细胞颗粒。细胞颗粒在0.2℃室温下解冻后溶解M（M）硫酸钠，Tris–HCl pH 9，然后在冷藏室中搅拌约3小时，加入20毫克溶菌酶和1毫克DNaseI。澄清的裂解物通过50 000离心制备克在4°C下保持60分钟。亲和层析使用第页-氨基甲苯磺酰胺树脂（Sigma–Aldrich）（洗涤缓冲液1,0.2M（M）硫酸钠，Tris–HCl pH 9；清洗缓冲液2，0.2M（M）硫酸钠，Tris–HCl pH 7；洗脱缓冲液，0.4M（M）叠氮化钠，50 mM（M）Tris–HCl pH 7.8），然后尺寸排除色谱法（50米M（M）Tris–HCl pH值7.8，100 mM（M）氯化钠）。CA九_SV公司从尺寸排除柱中以对应于二聚体和单体形式的两个峰洗脱（Koruza、Lafumat、Végvári等。, 2018).

对应于单体CA IX的峰分数_sv公司使用Amicon超离心过滤装置（Merck）进行混合和浓缩，分子量截止值为10 kDa，并使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行分析电泳（SDS–PAGE）以估计其纯度。将蛋白质浓缩至最终浓度17 mg ml⁻¹用于结晶。

2.2。氘化CA IX的表达与纯化_SV公司

Deuterated CA IX公司_SV公司表示为大肠杆菌BL21（DE3）细胞符合其他地方描述的方案（科鲁扎、拉富马特、维格瓦里等。, 2018). 简单地说，细胞在37°C的LB肉汤（Miller）（Difco）中预先生长。然后在指数期中期将生长培养基换成相同体积的氘化ModC1培养基，并添加2%的未标记甘油（Koruza、Lafumat、Végvári等。, 2018; 达夫等。, 2015). 在氘化培养基中稀释后，让细胞在37°C下恢复1小时，同时以120转/分的速度摇晃⁻¹。适应期结束后，温度降低至25°C，摇晃增加至200转/分⁻¹在1 m的浓度下，通过添加IPTG诱导蛋白质表达M（M）硫酸锌。18小时后通过离心法收集细胞，并在−20°C下保存。Deuterated CA IX公司_SV公司按照第2.1节中关于突起形式的描述进行纯化.

2.3. CA九_SV公司结晶优化和H/D交换

如其他地方所述，经过漫长的优化程序后，使用悬挂滴和坐滴蒸汽扩散方法制备结晶滴（Koruza、Lafumat、Nyblom等。, 2018). 简单地说，最初使用1:1比例的蛋白质溶液（17 mg ml⁻¹H/H CA IX公司_SV公司)和30%(w个/五)销钉4000，0.1M（M）Tris–HCl pH值8.5,0.2M（M）醋酸钠或0.2M（M）甲酸铵。然后按照种子珠试剂盒（Hampton Research；https://www.hamptonresearch.com). 使用蛋白质：沉淀剂：种子储备的3:2:1比例重复结晶，滴体积在6至24µl之间。随着播种，晶体在一周内出现。精氨酸和氘化CA IX_SV公司使用蛋白缓冲液结晶。H/H CA IX晶体_SV公司在没有进一步操作的情况下使用。准备H/D CA IX_SV公司和D/D CA IX_SV公司晶体，将储液罐溶液移除，并替换为氘化版本。然后重新密封滴液，并在X射线数据收集前允许进行数周的H/D交换。在将晶体放入液氮中冷却之前，将其浸入补充有20%甘油的储液中进行低温保护。对于H/D和D/D晶体，使用氘化甘油制备冷冻保护剂。

2.4. 结晶数据收集和结构细化

H/H CA IX的两个衍射数据集_SV公司在100 K时在FIP-BM30A光束线上采集（罗斯等。2002年)在法国格勒诺布尔的欧洲同步辐射设施（ESRF）和瑞典隆德MAX IV实验室的BioMAX光束线上。H/D和D/D CA IX_SV公司数据是在瑞典隆德MAX IV实验室的BioMAX光束线上收集的。

使用自动PROC软件包（Vonrhein等。, 2011). 自动化工作流脚本主要使用XDS公司（Kabsch，2010年)作为数据处理和缩放软件无意义用于空间群确定。对于其中两个数据集（H/D和D/D），收集了3600张图像。这些图像被分批处理，以找出辐射损伤影响数据质量的临界点。然而，数据处理和后续模型精炼表明最好使用完整的数据集。

所有X射线数据的相位通过以下方式获得分子置换在里面相位器（麦考伊等。, 2007)使用PDB条目5张dvx（马洪等。, 2016)作为搜索模型。模型最初在年进行了刚性改进相位器，后面是约束细化在中菲尼克斯套房（亚当斯等。, 2011). 对于所有数据集，一个批量解决方案修正和一个免费R（右）-因子监视器（用5%随机选择的反射计算）应用于整个精细化。2F类_o个−F类_c（c）和F类_o个−F类_c（c）使用库特（埃姆斯利等。, 2010). 对于明显较大的P（P）2₁ 晶胞，这两条链条都是在没有涂抹的情况下精制的非晶体对称性（NCS）。

图形是使用生成的PyMOL公司（薛定谔；https://www.pymol.org). CA IX_SV公司结构以以下登录代码保存在RCSB蛋白质数据库中：6平方公里,6个季度,6平方米和6平方瓦.数据收集和细化统计总结见表1进行了二聚体界面分析、埋表面积计算和相互作用绘图PyMOL公司和库特并使用PDBePISA公司服务器（Emsley等。, 2010; Krissinel&Henrick，2007年).

表1 CA IX的数据收集和模型重新定义统计信息SV公司   Protiated（H/H）（小单元） Protiated（H/H）（大单元单元） H/D-交换（H/D） 氘化（D/D） PDB代码 6平方公里 6rqq型 6平方米 6平方瓦 来源 FIP-BM30、ESRF BioMAX、MAX IV实验室 BioMAX、MAX IV实验室 BioMAX、MAX IV实验室 波长（Ω） 0.979 0.979 0.979 0.979 探测器 ADSC Q315r公司 Dectris EIGER 16M公司 Dectris EIGER 16M公司 Dectris EIGER 16M公司 每张图像的旋转范围（°） 0.5 0.5 0.1 0.1 图像总数 270 360 3600 3600 “空间”组 P（P）21 P（P）21 P（P）21 P（P）21 单位-细胞参数（Ω，°） 一= 44.3,b条= 65.1,c（c）= 46.7,β= 115.1 一= 48.9,b条= 65.1,c（c）= 76.3,β= 92.86 一= 44.5,b条= 65.4,c（c）= 46.7,β= 115.1 一=44.4，b条= 65.1,c（c）= 46.6,β= 114.7 单位-细胞体积（Ω三) 121830 241730 121830 121830 分辨率范围（Ω） 50.0–1.77 (1.88–1.77) 49.5–1.28（1.29–1.28） 40.0–1.39 (1.42–1.39) 40.0–1.49 (1.51–1.49) 反射总数 63296 (9199) 422779 (20704) 327912 (15926) 265165 (13184) 独特反射次数 22187 (3463) 122208 (5995) 48352 (2406) 39461 (1948) 多重性 2.8 (2.6) 3.5 (3.5) 6.8 (6.6) 6.7 (6.8) 完整性（%） 95.1 (92.9) 98.4（96.0） 99.8 (99.1) 99.9（99.3） 〈我/σ(我)〉 10.5 (2.2) 13.1 (2.1) 19.9 (2.2) 14.3 (2.2) R（右）合并†(%) 6.3 (48.6) 3.1 (48.5) 3.6 (78.1) 6.0 (78.1) R（右）测量(%) 7.7 (60.3) 4.5（67.0） 4.3 (96.2) 5.9 (86.4) 科科斯群岛1/2(%) 99.6 (83.3) 99.9 (86.6) 99.9（82.2） 99.8 (69.7) R.m.s.d.，粘结长度（Ω） 0.007 0.007 0.006 0.015 R.m.s.d.，粘结角（°） 0.888 0.982 0.957 1.344 R（右）晶体‡ 0.169 0.179 0.173 0.173 R（右）自由的§ 0.206 0.195 0.188 0.203 溶剂分子数量 253 682 262 217 平均值B类因子（λ2)  蛋白质 26 21.7 29 29.3  溶剂 36.12 34.6 37.5 38.3  醋酸盐配体 31.92   33.57    甲酸配体   26.7   37.3 †R（右）合并=× 100. ‡R（右）晶体=. §R（右）自由的计算方法与R（右）晶体但对于从中省略的数据精炼（所有数据集反射的5%）

3.1. 结晶学

用于X射线数据采集的晶体是在吊滴和坐滴蒸汽扩散装置中获得的。将微喂入液滴体积在3至10µl之间，可在1至2周内生成晶体。根据蛋白质的氘化状态，晶体的数量、大小和质量存在明显的可复制差异（图1; 科鲁扎、拉富马特、维格瓦里等。, 2018). 对于本研究中使用的晶体，体积范围为0.01至0.03 mm^三最大的CA IX_SV公司我们得到的晶体是0.8毫米^三并继续努力扩大和增加产量（见图5，科鲁扎、拉富马特、尼布卢姆等。, 2018). 我们在空间组 P（P）2₁带有两个标记为“小”的明显不同的单元（单元-单元参数一= 44.5,b条= 65.4,c（c）= 46.7 Å,β=115.1°）和“大”（单元-单元参数一= 48.9,b条= 65.1,c（c）= 76.3 Å,β = 92.86°). 最初在ESRF的FIP-BM30光束线上收集H/H晶体的数据，结果表明它们属于不同的空间组到之前报告的P（P）2₁2₁2₁（马洪等。, 2016). MAX IV实验室BioMAX光束线上H/H、H/D和D/D晶体的后续数据收集表明，H/H也被索引为空间组 P（P）2₁但有一个“大”晶胞（表1). 其他H/D和D/D晶体均为“小”晶体P（P）2₁ 单位电池，与我们从ESRF数据中确定的第一个相同。数据集和细化统计如表1所示晶体均进行了衍射，具有良好的统计特性，其结构分辨率为1.77–1.28º。

图1 生产用悬挂式和坐式蒸汽扩散装置的照片(一)精原化和(b条)氘化CA IXSV公司。此处显示的两种滴剂的体积均为10µl。

3.2. 空间群和晶体填充分析

小型P（P）2₁单斜的晶胞包含两个CA IX_SV公司链（每个不对称单元一条），体积为123 080Ω^三.另一个H/H晶体晶胞作为“大”处理P（P）2₁细胞，但实际上是一个加倍的“小”细胞晶胞表面ASU中的两条链与½，0，½的平移NCS相关。因此，虽然理论上在填充和接触方面“小”H/H结构是多余的，但结晶条件略有不同，我们确实看到活性中心中结合了不同的配体（稍后在第3.3节中讨论）。由于这些原因，我们在表1中显示了数据统计并在第3.3节和图5中讨论了活性位点。CA IX_SV公司包装布置如图2所示，与对称性相关的分子显示为灰色。

图2 CA IX的晶体封装图SV公司在里面P（P）21（本工程）和P（P）212121（PDB条目5张dvx)和中的CA IXP（P）61（PDB条目3iai公司)单位单元格。ASU中的单体P（P）21在所有图表中显示为红丝带，以供参考。ASU装置中的两条链条P（P）212121二聚体为绿色和蓝色P（P）61.

先前对CA IX的生物物理研究已经证实它是二聚体体内和在体外，尽管天然二聚体的精确组织尚不清楚（Hilvo等。, 2008; 锂等。, 2011). 在首次发表的晶体结构CA IX的催化域；它是使用杆状病毒表达载体系统生产的，其结构在空间组 P（P）6₁（PDB条目3iai公司; 单元-单元参数一=b条=144.2，c（c）= 208.9 Å; Alterio公司等。, 2009). 在这个结构中，蛋白质二聚化由一个涉及Cys174（CA II中的41位）的分子间二硫键介导，并被认为与生理相关第四纪构造。有趣的是，在同一份报告中，Cys174Ser CA IX变异体结晶，具有相同的填充和二聚体界面，但没有二硫键（Alterio等。, 2009). 最近，另一项研究报道了一种CA IX结构，这次是由酵母中表达的蛋白质确定的，该蛋白质在空间组 小时3（PDB条目6英尺; 单元-单元参数一=b条= 152.9,c（c）= 171.5 Å; Kazokaitм等。, 2018). 除了这些研究晶体结构CA IX的_SV公司也是在年确定的空间组 P（P）2₁2₁2₁（PDB条目5dvx型; 单元-单元参数一= 57.9,b条 = 102.7,c（c）= 108.9 Å). 该结构在ASU中也有两条NCS链，然而，这种排列与之前关于天然CA IX的报道不一致。这很可能是由于Cys174残基被突变为丝氨酸，而Cys174-残基被激活为丝氨酸晶胞和晶体包装也不同（马洪等。, 2016). 因此，这个较小的正交空间群晶胞比之前出版的六角形电池更适合中子研究，我们的研究采用正交形。在中子-蛋白质结晶学实验中考虑单位-细胞参数（通常最高可达150º）与电流的限制有关通量中子源的布局以及大分子束线的布局，以解决更大的晶胞参数（Meilleur等。, 2018; 奥戴尔等。, 2016). 为了能够从一个大尺寸的晶体中获得合理的衍射数据（优于2º分辨率）单位电池，还需要优化整体晶体体积（田中，2019). 尽管大量努力复制这些CA IX晶体_SV公司相反，我们获得了两个新的似乎不同的单斜P（P）2₁晶体（图1，表1). “小”单斜P（P）2₁晶体形态与氘标记的CA IX同晶_SV公司晶体形态。此外，只有一个CA IX_SV公司每非对称单元，这在使用中子进行蛋白质晶体学时很有用（布莱克利等。, 2015). 有关晶体触点的完整列表，请参阅表2.

图3显示了单斜晶系中两条链的重叠晶胞正交ASU中的两条链，以后者的链A作为参考。表2中列出了两者的单体对单体静电接触在正交链中有更多的相互作用介导界面，其中大多数是由于包裹在二聚体对周围的C末端残基引起的。对多个单体到单体排列的观察表明，CA IX具有强烈的二聚倾向，不依赖于分子间二硫键，因此不可能推断出哪个可能是相关的生理二聚体。天然CA IX和CA IX在排列和晶体堆积方面的差异_SV公司如图2所示.

CA IX公司_SV公司与CA IX相比，该变异体具有六个表面氨基酸替换，这些替换是为了优化在大肠杆菌和结晶。其目的是消除二硫键形成导致的二聚反应，降低表面疏水性，并鼓励基于CA II晶体接触的可能晶体接触（Mahon等。, 2016). 因此，我们想研究是否一些氨基酸相互作用涉及到P（P）2₁或P（P）2₁2₁2₁ 晶胞受六种氨基酸取代的影响。图4(一)和4(b条)显示了带状表示中的二聚体，取代的侧链被描绘成棒状。通过对这些结构的检查，很明显，残基Lys258和Tyr259参与了大单斜晶系中的NCS二聚化P（P）2₁ 晶胞此处报告[表2，图4(b条)]。在小单斜P（P）2₁和之前报道的斜方晶系P（P）2₁2₁2₁单位电池[图4(c（c）)]氨基酸取代均不参与晶体接触或NCS二聚反应。因此，六种表面残基的改变似乎并不会导致二聚化，但对其溶解度和稳定性有重要影响催化域CA IX的。

图4 根据CA IX中六种突变的位置比较晶体接触SV公司.CA九SV公司如漫画所示，取代氨基酸（与CA IX相比）被描绘成黄色棒状，锌被描绘成洋红色球体。(一)小型晶体链P（P）21 晶胞（本工程）(b条)ASU中的NCS链P（P）212121单元格（PDB条目5张dvx; 马洪等。, 2016).

3.3. H/H（小）、H/H、HD和DD CA IX的动态比较_SV公司结构

当氘化蛋白质用于中子研究时，重要的是要确定氘化是否在产生的蛋白质侧链和活性位点溶剂定位中引起明显的构象效应。为了使氘化蛋白在结构研究中有用，它必须代表生理蛋白质：不应有构象变化。如前所述，溶剂和氨基酸残基的整体活性位排列似乎在很大程度上未受影响，当所有四种结构相互叠加时，所有原子的r.m.s.d.变化小于1º。我们对结构进行了仔细的OMIT图分析，发现在所有四个结构中，都有两个离子与来自结晶条件的锌离子结合：醋酸盐或甲酸盐（图5). 甲酸盐和乙酸盐都是已知的与CA结合的抑制性阴离子，因此它们的存在并不令人惊讶（Coleman，1967; 哈坎森等。, 1992; Alterio公司等。, 2009). 甲酸盐通过取代活性部位中所谓的“深水”而抑制，并与二氧化碳底物结合在同一位置（图5; Domsic&McKenna，2010年)，而醋酸盐取代了两种水，即深水和催化锌结合水，有效地呈现了抑制活性中心结构（补充图S1）。我们观察到甲酸盐结合在H/H和D/D结构中明显的“大”细胞中，而乙酸盐存在于小H/H及H/D交换结构中（图5). 任何一种离子的存在似乎都不会影响整个活性中心侧链构象，除了小的水重排，这反映在活性中心溶剂分子W2的相对弱密度中[图5(一)]。在图5中(b条)–5(d日)可以看出，W2在相同的轮廓下密度很低，而且结晶更精细B类与其他活性中心溶剂分子相比。W2的弱密度在D/D结构中最为明显，其中密度不低于1.5σOMIT电子密度图中的水平。对此有多种可能的解释，包括甲酸盐的存在可能扰乱水网络或蛋白质氘化引起的细微影响。

图5 CA IX的动态比较SV公司. (一)H/H小写P（P）21 单位电池，(b条)双倍中的H/HP（P）21 单位电池，(c（c）)H/D换小P（P）21 晶胞和(d日)D/D CA IX公司SV公司在小范围内P（P）21 单位单元格。活性组分残留物被描述为黄色棒状物；水分子和锌原子分别显示为红色和品红色球体。2F类o个−F类c（c）电子密度图以蓝色网格显示，轮廓为1.50σ对于残留物，1.25σ溶剂和3.50σ对于锌。

对质子穿梭残基His200的仔细电子密度OMIT分析表明它在两种构象之间分裂，在CA II文献中称为“in”构象和“out”构象（补充图S2；Nair&Christianson，1991; 费希尔等。, 2005). 在带有PDB代码的结构中5张dvx（CA九_SV公司)His200侧链完全处于“退出”位置π-与Trp141堆叠（Mahon等。, 2016). 有结构证据表明，His64在CA II中的首选位置受到pH值的强烈影响，由于带电的His和锌（Fisher等。, 2005). 然而，这里报告的所有单斜结构和之前报告的正交形式都是在pH 8.5下生长的晶体中测定的，然而His200的交替构象占有率是不同的（Mahon等。, 2016). 然而，我们的晶体中确实含有甲酸盐或乙酸盐，这些配体的存在可能会通过改变锌电荷对His64取向的静电效应而成为干扰因素。

综合以上观察结果，对于CA IX的不同标记变体的四种结构_SV公司我们可以得出结论，氘化对整体结构几乎没有影响。这与之前报道的其他参数，如热稳定性和结晶行为形成对比（Koruza、Lafumat、Végvári等。, 2018). 此外，比较组成活性位点的特定残基表明，整体结构在H/H、H/D和D/D CA IX之间保持不变_SV公司.