2.1. 微焊缝的设计和制造

我们设计了用于微衍射实验的微晶操作的微型底座。这些支架的特点是使用聚酰亚胺作为低X射线散射背景，使用有图案的微孔（10µm宽）保持水分并捕获微晶，以及在微孔内使用滤纸去除溶剂的2µm孔（图1一). 整个底座的直径约为250µm，有两种不同的厚度：薄膜厚度为3µm、框架厚度为10µm。这些井架是以MiTeGen MicroMesh M4型号1为参考设计的（MiTeGen定制；https://www.mitegen.com网站)并组装到18 mm不锈钢棒和脊椎帽上，以与标准冷冻结晶学兼容。

图1 微晶照相中微晶的操作。(一)图案优美。插图：显示微孔形状和尺寸的高分辨率图像。为了更好地显示，2µm孔用白色圆圈高亮显示。(b条)采集和冷却微晶的通用程序。用微量吸管吸出微晶，微晶液滴沉积在井架顶部；然后用滤纸从底部除去溶剂，将井架插入液氮中冷却。(c（c）)在12.6 keV下测量的1.0×1.5µm FMX光束轮廓。(天)在光栅扫描方向上装载微晶的井架的光显微视图。(e（电子）)井架上微晶的光栅扫描热图。

2.2. 微晶样品制备

最终浓度为30 mg ml的索姆丁蛋白（Sigma；目录号T7638）⁻¹与由1.7组成的沉淀剂混合M（M）酒石酸盐，100米M（M）ADA pH 6.5，比例为1:3或1:4(v（v）:v（v）). 将混合溶液密封，以便成核和结晶。3小时后，通过反复离心和缓冲液交换，用100 m的稳定溶液停止结晶过程M（M）ADA pH 6.5，0.9M（M）酒石酸盐。通过离心收集微晶，然后通过8µm Whatman过滤器挤压三次。根据透射电子显微镜的估计，这些晶体的尺寸约为1.5×3µm。

图1(b条)说明了我们用来采集和冷却微晶的过程。我们没有使用井架从含有微晶的液滴中挖出晶体，而是使用微量移液管吸出0.5–1µl的微晶液滴。然后，我们触摸井架顶部的微晶液滴，用细滤纸触摸井架底部以去除溶剂，并将井架放入液氮中快速冷却。

2.3。显微衍射数据收集和还原

我们在国家同步辐射光源II（Fuchs）的前沿高分子晶体光束线（FMX）上进行了微衍射实验等。, 2016). FMX光束线具有1×1.5µm的微束（FWHM；图1c（c）)由一对KB镜、一个EIGER 16M混合像素阵列探测器和一个具有亚微米混淆球的快速扫描测角仪聚焦。在12.6 keV下，通过扫描30 nm的铬纳米线并测量发射的X射线荧光信号。为了对齐好的底座，我们使用侧视图将整个底座居中，然后将底座旋转90°，使好的底座表面垂直于X射线束（图1天).

我们在波束线数据采集程序中使用了光栅扫描工具(LSDC公司)找到衍射数据采集的“热点”位置。我们使用10µm的步长进行光栅扫描，并将返回的“热点”映射到光栅网格上，以帮助可视化和队列数据收集（图1e（电子）). 我们选择了所有显示衍射超过4.0º分辨率的“热点”，保存了它们的位置，并将它们排队等待自动数据采集。为了记录蛋白质S原子的异常衍射，以帮助我们的分析，我们以相对较低的能量收集了所有数据(E类=7.0千伏）。聚焦光束通量约为1.2×10¹¹ 光子⁻¹7.0 keV，16%传输。在每个选定的“热点”位置，我们使用0.1或0.2°的旋转角度收集50或100帧，每帧曝光时间为0.02 s，以进行精细的数据采集（Casanas等。, 2016). 在样品到检测器的距离为190 mm时，分辨率极限(天_最小值)在探测器边缘约为2.5º，我们总共收集了128个部分数据集，每个数据集来自一个单晶“热点”。这些部分数据集是从六个孔中收集的，每个孔中有8到64个晶体。

所有单晶数据集都使用DIALS（刻度盘）（沃特曼等。, 2016; 冬季等。, 2018)并使用中央对手方清算所4个程序无意义和无AIMLESS（Evans&Murshudov，2013年; 埃文斯等。, 2011; 参见§3用于详细的数据分析）。补充表S1列出了从97个（通过拒绝从128个）统计兼容数据集合并而来的最佳数据集的数据统计。

2.4. 结构细化

菲尼克斯精炼（回声等。, 2014; 阿富汗等。, 2012)用于结构精炼根据PDB条目中带有初始模型的合并数据集5lh1型（舒伯特等。, 2016). Friedel mates在所有细化中被视为两个反射，所得的傅里叶系数（ANO和PHIANO）用于计算Bijvoet差分傅里叶映射。库特（埃姆斯利等。, 2010)用于检查地图质量以及模型和溶剂调整。精制结构的立体化学用PROCHECK检查（拉斯科夫斯基等。, 1993)和摩尔概率（陈）等。, 2010)用于质量保证。这个细化统计关于最佳合并数据集，见补充表S1。

3.1、。总体数据组装策略

由于线性尺寸为几微米的晶体暴露在同步加速器的聚焦微束下，辐射损伤是一个固有的挑战。为了克服辐射损伤问题，我们设计了一个三阶段数据组装策略（图2). 第一阶段是从单晶部分数据集生成完整的参考数据集。每个单晶数据集都作为逐步累积的数据楔子进行索引和集成。对于每个单晶数据集我/σ(我)已选中。然后使用基于单位-细胞变化的聚类分析来选择一组兼容的晶体，以合并到参考数据集中。第二阶段是使用参考数据集对单晶数据集中的晶体和框架进行精细选择，我们根据相对相关系数（RCC）将单晶数据集的数据与参考数据集进行比较。这产生了一个“合格”帧的数据集，最终合并的数据集可以从中组合。第三阶段寻求从“合格”帧生成候选合并数据集，假设来自给定晶体簇的数据足够：例如，它们的合并完整性大于90%。使用迭代晶体剔除和帧剔除过程生成不同严格程度的合并数据集的排序序列。这些候选者通过数据质量和结构分析进行评估。

图2 数据组装策略。首先，将单晶数据集作为累积楔形进行索引和集成，以找到最大值我/σ(我). 单元-单元变化分析用于为合并的参考数据集获取兼容晶体。其次，单晶数据集的精细选择基于最大RCC，其中RCC定义为相对相关系数使用参考数据集的单晶数据集。第三，进行迭代晶体和帧剔除，以获得最终缩放和合并数据，用于进一步分析。

3.2. 第1阶段：生成参考数据集

我们将单晶数据集独立地索引和处理为逐渐累积的楔形。这些微晶对X射线的衍射很弱我/σ(我)对于大多数单晶数据集（图3），小于3一). 因为我/σ(我)随着多重性的增加，直到辐射损伤达到压倒性程度，我们只选择了达到最大值的累积楔形物我/σ(我). 使用我/σ(我)截止值为1.0，我们选择了104个单晶数据集，并进行了单元间差异分析，以对这些数据集进行分类（Liu等。, 2012; 福亚迪等。, 2013; 佐丹奴等。, 2012). 我们的分析表明，大多数微晶聚集在一个集群中，只有八个离群值（图3b条). 在这一阶段，主星团包含96个晶体，这些晶体与代表性晶体聚集在一起，如图3所示(b条)作为树状图的一个红色分支。最高的我/σ(我)然后将这些选定晶体的帧合并以获得参考数据集。参考数据集使用了收集的9250帧中的1579帧（17.1%）。

图3 单个微晶的数据分析。(一)直方图分布我/σ(我)用于获取参考数据集的单晶数据集的值。(b条)用于参考数据集中单晶数据集分类的单元间差异分析。品红色簇中的八个晶体代表了树状图中共簇的96个晶体。(c（c）)将典型单晶数据集的RCC转换为四种不同分辨率的参考数据集。(天)117个选定单晶数据集的RCC值的直方图分布。

3.3. 第二阶段：精挑合格数据

有了参考数据集，可以更可靠地评估每个部分单晶数据集的帧。我们计算了相对相关系数（RCC）将单晶数据集转换为四种不同分辨率（2.5、3.0、3.5和4.0º）的参考数据集。为了便于说明，我们显示了20°楔形中100帧的代表性数据集的RCC进程（图3c（c）). 该图显示，达到最高RCC的帧数取决于分辨率，并且在高分辨率下比在低分辨率下更容易受到辐射损伤。例如，在4.0º分辨率下，最多可以选择70帧，而不会影响RCC值，而在2.5º分辨率时，只能选择20帧。我们对所有楔形单晶数据集进行了RCC分析，为了包括尽可能多的潜在有用数据，我们使用4°时的最大RCC作为选择单晶累积楔形的截止值。也就是说，对于累积楔块，在4°时产生减少RCC的框架被拒绝进一步使用（图3c（c）). 以RCC>3%为标准，我们选择了126个单晶数据集。这里的目标是通过漫无目的的也可以使用较高值或不同分辨率的RCC截止值进行初始晶体或帧选择。使用这里的精细选择，对单位-细胞变化的聚类略有不同，我们现在获得了主要聚类的117个单晶数据集，并将其用于下游分析。所选单晶数据集的RCC直方图分布如图3所示(天). 这一阶段的完整数据集包括3853帧（41.7%）。

3.4. 第三阶段：合并成一系列有序的合并数据集

我们在此阶段的方法是生成一系列按数据质量排序的合并。在将数据合并到合并数据集之前，我们使用晶体和帧拒绝的迭代过程，并且我们使用平滑帧R（右）_合并（SmRmerge）报告无AIMLESS（Evans和Murshudov，2013年)判断每次合并的质量。我们使用无意义并在中执行迭代数据和帧抑制无AIMLESS。我们首先平均每个单晶数据集中所有帧的SmRmerge值，然后根据其平均SmRmerger值对单晶数据集进行排序。所有117个晶体的第2阶段RCC测试合格的所有数据合并称为合并数据集117，通过排除十个具有最高〈SmRmerge〉值的单晶数据集，开始迭代晶体剔除。剩余的单晶数据集被重新组合，以进行另一个缩放和合并循环无AIMLESS以生成合并数据集107，从中计算更新的〈SmRmerge \9002；值，并用于排除其他十个晶体，并启动下一个晶体拒绝周期。以这种方式，合并数据集97、87等。并继续拒绝过程，直到总多重数为5或更低，在这种情况下以合并的数据集17结束。

在晶体抑制的每个周期中，我们还执行了帧抑制，以消除可能不会影响整体数据质量的辐射损坏帧。由于晶体之间的差异，对于每个单晶数据集应该拒绝多少帧似乎没有统一的标准。因此，我们采用了网格搜索程序，并使用SmRmerge进行帧抑制。对于每个单晶数据集，我们首先找到SmRmerge，Min（SmRmerg）最低的帧，然后定义网格重投影准则为frame_rej=[Min（SmRmerge）×（1+衰变）]或无（有效衰变=∞），其中衰变是200、150、100、50或10%的拒绝比。低衰减意味着更严格的拒绝。SmRmerge值大于frame_rej的帧被拒绝。请注意，Min（SmRmerge）属于特定的单晶数据集，而不是所有单晶数据集的全局最小SmRmerger。因此，这一过程实际上在11个晶体投射水平的每一个水平上生成了6个合并数据集，从而得到总共66个合并数据组。

3.5. 合并数据集的数据质量评估

我们使用CC_1/2和R（右）_分裂作为数据质量指标，用于评估晶体和帧投影过程的有效性（图4一和4b条). 总的来说，我们的程序在识别和拒绝不良单晶数据集和辐射损坏帧方面非常有效。在我们的方案中，通过在排序和拒绝的早期阶段建立大的合并数据集编号来识别不太兼容的单晶数据集。包括这样的单晶数据集导致在无AIMLESS如CC中的波动所示_1/2和R（右）_分裂没有帧拒绝或过于严格的帧拒绝（合并数据集87–117）。此外，R（右）_分裂数值往往会超过合并的数据集87–97，这表明包含不良数据会产生不利影响，并且当使用较少的晶体时，数值也会增加，这可能是因为多重性较低。100%的帧拒绝率通常会导致CC的改善和平滑_1/2和R（右）_分裂值。另一方面，数据质量受到严格拒绝（10%）的不利影响，这表明对于微晶而言，损坏的帧仍会影响整体数据质量。

图4 将合并数据集作为晶体和帧拒绝的函数进行分析。(一)抄送1/2, (b条)R（右）分裂, (c（c）)R（右）自由的, (天)平均Bijvoet差傅立叶峰高度。在每个图中，曲线对应于每个晶体抑制周期后帧抑制的不同程度。帧抑制显示为五种不同的比率，其中10%是最严格的帧抑制，“无”是无帧抑制。

3.6条。结构精炼和异常信号

为了进一步评估拒绝标准的有效性，我们进行了结构分析精炼合并数据集的菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012)绘制了R（右）_自由的关于晶体数量和帧重投影比（图4c（c）). 该图显示，尽管存在一些小故障，但来自更多晶体的数据往往会产生更低的R（右）_自由的，但最后两个合并数据集（107和117）除外，其中合并的数据集不太兼容，并且可能会恶化整体数据质量。根据我们的改进，在100%和200%之间的抑制率似乎产生了类似的结果，而与所包括的单晶数据集的数量无关，这表明帧抑制策略在排除辐射损伤的帧方面是非常有效和稳健的。

索姆丁含有一个蛋氨酸残基和16个半胱氨酸残基，形成八个二硫键。我们收集了所有7keV的单晶数据集，其中的理论虚部反常散射(（f）′′）为0.72e，我们估计蛋白质的反常衍射比为2.2%。一贯地，我们的结构改进显示了我们判断的合并数据集中存在异常信号（f）′′精炼（刘）等。, 2013). 以帧重投影率为100%的合并数据集97为例，改进后的平均值（f）17个硫位的〃为0.75e，接近0.72e的理论值。因此，我们计算了Bijvoet差分傅里叶映射，使用中央对手方清算所4程序最大峰值（获胜者等。, 2011)找到3以上的六个最强峰值σ并绘制了平均峰值高度。从大多数合并数据集中可以发现显著的Bijvoet差异傅里叶峰，在这些合并数据集中，在100%拒绝率下，67–97（重数从16到24）的平均峰高都在4.5以上σ（图4天). 从合并数据集中成功提取微弱异常信号表明，我们的策略是稳健的，并且相对不受晶体重投影参数的影响。因此，我们的方法似乎适合于获得以下方面的优化数据精炼保留敏感的异常信号。

4.1. 微晶操作

事实证明，我们开发的新井架对处理微晶是有效的。聚酰亚胺的使用大大减少了背景散射，并消除了对硅载体的需要，硅载体在低能实验中产生具有显著吸收的强布拉格斑点（Roedig等。, 2016). 根据我们的经验，10µm微孔和2µm孔适用于一般情况下几微米及以上的微晶。因此，这一发展为可靠采集、冷却和呈现微晶以进行微衍射实验提供了一种易于实施的方法。虽然我们仅对一种具有双锥形状的索姆丁晶体使用了良好底座，但良好底座的设计和相当简单的取样操作协议与其他晶格的晶体兼容。我们认为，只要能把晶体装到一个很好的底座上通过在用滤纸从底部去除溶剂的过程中，应连接一个吸管，并在不同方向上被孔固定。

在没有优化晶体浆料密度的情况下，我们的底座微晶分布不均匀：有些底座可能含有60多个衍射良好的微晶，而有些底座可能只含有10个或更少的良好微晶。结晶浆料的密度可以通过旋转微晶并以较小的体积重新悬浮微晶来增加。由于结晶条件和晶体形态的变化，在没有堆叠的良好底座上找到最佳晶体密度是一个试错的过程。我们认为，用几种浓度的微晶制备良好的底座，然后在光束线上进行衍射测试，将提供足够的实验数据，以便准备优化的实验。DIALS（刻度盘）可以使用这些牺牲底座检测多个晶格。井架的当前尺寸仅为250µm直径。要在一个孔架上装载更多晶体，1–2 mm的直径可能有用（Coquelle等。, 2015). 在井架上冷却微晶时，即使没有添加任何冷冻保护剂，我们也没有观察到冰环衍射。这可能是因为我们完全去除了溶剂。然而，低温保护剂可以方便地添加到结晶滴或含有微晶的稳定溶液中。

4.2. 异常数据和帧抑制

与大晶体相比，微晶含有较少的分子，并且对操作和环境变化更敏感，如单位细胞参数和衍射强度的变化所示（Farley等。, 2014). 因此，为了合并来自微晶的数据，我们需要有效地检测这些异常值并拒绝它们。利用来自单晶的完整数据，我们使用了单元间变化分析和衍射-同化分析，以确保只有来自兼容晶体的数据才能组合在一起（Liu等。, 2012; 佐丹奴等。, 2012). 对于微晶的部分典型数据，单位-细胞变异分析仍然有效；然而，部分单晶数据集之间的共反射次数通常不足以保证可靠的衍射强度相关分析。虽然可以从单晶中收集中等质量的参考数据集，以协助微晶数据组装（Hanson等。, 2012)如果晶胞尺寸和衍射强度发生变化，则参考文献可能会对单晶数据集的选择产生偏差。因为我们用无AIMLESS对于所有缩放和合并工作，为了兼容性，我们还使用了无AIMLESS计算迭代排序和异常晶体拒绝的〈SmRmerge〉。在我们的分析中，我们可以可靠地检测到不相容的晶体并有效地拒绝它们（图4一和4b条). 虽然我们可以获得17个晶体的完整合并数据集（重数约为5），但所有质量指标都表明，包括更多的单晶数据集可以提高数据质量，增强微弱的异常信号（图4一–4天).

我们如何知道框架的损坏程度严重到了什么程度，以至于这些框架无法使用？我们的网格搜索框架拒绝可能为合理处理辐射损伤提供了一条切实可行的途径。在这里，我们测试了五种不同的拒绝率，我们发现100到200%之间的值为合并数据集提供了合理的平滑度，以及最大CC_1/2和最小值R（右）_分裂，与包含的单晶数据集数量无关。因此，我们建议，对于辐射损伤帧的抑制，应该尝试不同的抑制比，并选择那些能提供最佳CC的抑制比_1/2和R（右）_分裂值（图4一和4b条).

与SFX数据相比，微晶的5倍性相当低。这里，我们使用5的重数来表示，即使在如此低的重数下，也可以用合理的结构重新定义统计信息来组装完整的数据集(R（右）_自由的=0.23），来自17个晶体。这表明，通过在同步辐射微衍射光束线上收集旋转数据，可以从有限数量的微晶中获得单晶质量数据。

4.3。弱衍射信号

硫位置的Bijvoet-差分傅里叶峰提供了数据准确性的敏感测量，我们已使用这些峰检测这些合并数据集中的异常信号（图4天). 补充图S1显示了17到117之间合并数据集的Bijvoet差分傅里叶峰值，帧重投影率为100%。尽管合并数据集中有四个峰值17，但包括更多单晶数据集在内，异常信号增强，出现了更多峰值，合并数据集中97清楚地分辨出了八个峰值（共九个）。然而，根据R（右）_分裂（图4b条)，包含所有数据（合并数据集117）对异常信号有害（图4天); 数据集97中的峰值1、3和6在这里几乎消失（补充图S1e（电子）和S1（f）). 类似地，补充图S2显示了合并数据集97在不同抑制比下的Bijvoet差傅立叶峰值。显然，100%的拒绝率与八个峰值的检测一致。然而，使用合并的数据集97，我们无法找到硫下部结构无论是哪一种SHELXD公司（Sheldrick，2010年)或菲尼克斯（兹瓦特等。, 2008). 为了改善异常信号，我们测试了在中实现的局部缩放和异常信号优化phenix.scale_merge公司（特威利格等。, 2016). 然而，局部缩放和异常信号优化后的数据显示增加了R（右）_自由的Bijvoet-差分傅里叶峰高降低，表明异常信号太弱，无法进行更可靠的提取。然后我们使用已知的下部结构由PDB导出，用于SAD相位计算，然后进行密度修改。我们计算了这些SAD相地图和模型地图之间的地图相关系数（mapCC），发现mapCC约为15%，这表明信号虽然存在，但太弱，无法从头开始少于100个微晶的SAD阶段。然而，由于我们的数据分析程序是稳健的，我们建议使用本地SAD结构测定随着微晶数量的增加和实验条件的可能改善，如X射线能量降低，这将是可行的。